凱里白酸湯乳酸菌的分離鑒定及菌種性能測定

趙承鑫，李艾蒙，楊小云，田其明，鐘定江，賈利蓉*

(1.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065；2.麻江縣明洋食品有限公司，貴州 凱里 556000)

白酸湯起源于貴州省黔東南苗族侗族自治州，是一種以米湯為原料的發(fā)酵調味品，富含以乳酸為主的多種有機酸[1]，因其滋味爽口且益于健康而深受當?shù)厝藗兿矏?。白酸湯具有增進食欲、清熱解暑、助消化、維持腸道穩(wěn)態(tài)、抗氧化、防衰老、抑菌消炎等多種保健功能[2]。白酸湯發(fā)酵的主要功能菌種是乳酸菌，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各類有機酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物能夠賦予酸湯獨特的風味[3]。研究顯示，人體攝入的大部分乳酸菌在通過消化道進入腸道之前, 會因不耐受胃酸環(huán)境而死亡,只有少數(shù)耐酸性乳酸菌能夠通過胃酸屏障。乳酸菌要發(fā)揮益生作用就需要順利通過胃液進入腸道，并在腸道定植后達到一定的數(shù)量[4-5]，故乳酸菌食品的益生功效與其能否適應胃腸道的低酸性環(huán)境和高膽鹽濃度有關。

目前國內對于貴州凱里白酸湯的研究大多側重于其營養(yǎng)物質[6]、風味成分[7]、工藝優(yōu)化[8-9]、微生物區(qū)系以及微生物對酸湯品質的影響[10-12]等，對酸湯源乳酸菌的研究較少。對乳酸菌胃腸道耐受性的研究主要集中于酸菜源乳酸菌[13-14]、泡菜源乳酸菌[15-16]耐酸性測定，而對白酸湯源乳酸菌產(chǎn)酸能力和耐酸性的相關研究尚未見報道。本試驗旨在從貴州凱里白酸湯中分離菌株，為白酸湯中乳酸菌的進一步研究和利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

凱里白酸湯：貴州凱里麻江縣明洋食品有限公司。

1.2 試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基(均為生物試劑)：青島高科技工業(yè)園區(qū)海博生物技術有限公司；平板計數(shù)瓊脂(生物試劑)：上海博微生物科技有限公司；氯化鈉(分析純)：天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；碳酸鈣、鹽酸(均為分析純)：成都科隆化學品有限公司；胃蛋白酶(分析純)：上海泰坦科技股份有限公司。

1.3 主要儀器與設備

電熱式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SPX-150B III生化培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；DW-2菌落計數(shù)器 杭州大微生物技術有限公司；H2-16KR臺式高速冷凍離心機 湖南可成儀器設備有限公司；pH計 上?？祪x儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 白酸湯樣品中乳酸菌的分離純化

從發(fā)酵時間為3，6，7，8，10 d的白酸湯樣品中各取1 mL，用8.5 g/L的生理鹽水稀釋至10-7，各吸取0.5 mL稀釋液接種于含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)48 h，不同發(fā)酵時間分別做2個平行。觀察菌落形態(tài)，選取呈圓形、表面微白色、濕潤、邊緣整齊、溶鈣圈較大的菌落，挑取單菌落在MRS平板上反復劃線3～4次，直至獲得21個純菌落平板。并將純化后的菌株于4 ℃保藏。

1.4.2 菌種鑒定

分別從上述純菌落平板上挑取21個單菌落，接種培養(yǎng)于含有10 mL葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的無菌離心管中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，不同純菌落各做2個平行，分別標記為L(單數(shù)，用作正式樣品)、M(雙數(shù)，用作備份樣品)。離心管用蒸餾水配平，在8000 r/min的轉速下離心12 min，棄去上清液，獲得菌體沉淀。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和142R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對細菌進行16S rRNA 基因區(qū)域擴增，20 μL PCR 體系包括2 μL 10×Ex Taq buffer, 0.2 μL 5u Ex Taq, 1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix,1 μL 5p Primer 1,1 μL 5p Primer 2, 0.5 μL DNA 模板，補 ddH2O 至 20 μL；擴增參數(shù)：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)25次；72 ℃延伸10 min；使用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴增產(chǎn)物，純化回收，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行Sanger測序，利用Sanger測序獲得的兩端raw sequence分別進行質控，去除低質量的堿基，獲得clean sequence后進行拼接，獲得組裝序列，與NT數(shù)據(jù)庫Blast獲得物種相似度前十的物種信息，并且選擇相似度最高的比對物種作為菌鑒的結果，以鑒定到種。

1.4.3 菌種活化擴增及菌懸液制備

從已鑒定出的純菌種中抽選3株不同菌種菌株，分別接種到含有15 mL MRS肉湯掊養(yǎng)基的無菌離心管中，36 ℃下培養(yǎng)24 h。離心管用無菌水配平，在6000 r/min的轉速下離心8 min，棄去上清液后用無菌生理鹽水洗滌，并稀釋至15 mL，備用。將上述菌液各取1 mL稀釋至10-7,10-8,10-9后涂布于平板計數(shù)瓊脂上，設置一組平行及空白，同時將菌液密封，放入4 ℃環(huán)境中抑制其繼續(xù)增殖；將平板放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出讀數(shù)。根據(jù)活菌計數(shù)結果，用無菌生理鹽水將3株菌稀釋至1.00×109CFU/mL，制成菌懸液備用。

1.4.4 不同種乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定

取1 mL菌懸液按表1方式接種，空白組接入1 mL無菌生理鹽水，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并控制培養(yǎng)相應時間[17]，發(fā)酵液總酸度的測定參考GB 12456-2021中的酸堿指示劑滴定法對樣品進行測定。

表1 接種方式Table 1 Inoculation methods

1.4.5 不同種乳酸菌的耐酸性測定

用蒸餾水稀釋鹽酸，分別調節(jié)pH值至1.5，2.5，按照1∶100(g/mL)的比例加入胃蛋白酶，充分溶解后用0.20 μm的微孔濾膜過濾。吸取1 mL制備好的菌懸液于9 mL人工胃液中，另取1 mL菌懸液于9 mL蒸餾水中作為對照，混勻后在36 ℃下培養(yǎng)，采用平板涂布計數(shù)法，選取合適的稀釋梯度分別測定1，2，3 h時的活菌數(shù)，每個時間段做兩組平行，取平均值。對照組僅測定0 h時即初始的活菌數(shù)。按下式計算乳酸菌存活率：

式中：S表示存活率，%；N1表示胃酸處理3 h后的最終活菌數(shù)，CFU/mL;N2表示胃酸處理0 h時的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結果以平均值表示，并采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)軟件和OriginPro 2021進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 分子生物學鑒定

經(jīng)鑒定獲得7株純菌株，Blast的比對結果見表2。

表2 7株分離乳酸菌的Sanger測序分析結果Table 2 Sanger sequencing analysis results of seven strains of isolated lactic acid bacteria

由表2可知，根據(jù)同源性比對，可判定菌株L7、L9、L15、L19、L29均屬于副干酪乳桿菌，菌株L17屬于干酪乳桿菌，菌株L31屬于植物乳桿菌。后續(xù)選擇表2中同源性最高的L7(Lactobacillusparacasei)、L17(Lactobacilluscasei)、L31(Lactobacillusplantarum)3株菌進行擴增并進行產(chǎn)酸能力及酸耐受性測定實驗。

2.2 白酸湯中不同種乳酸菌的產(chǎn)酸能力測定

產(chǎn)酸能力是乳酸菌的一個主要特征，產(chǎn)酸機制日益受到重視[18]。乳酸菌通過代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸和檸檬酸等有機酸，這些有機酸既能幫助調節(jié)腸道pH及菌群平衡、抑制腸道病原菌[19]，同時也能提高腸胃中酶的活力，幫助吸收營養(yǎng)物質，調節(jié)腸道功能[20]。因此，在實際的工業(yè)生產(chǎn)中，產(chǎn)酸能力強的乳酸菌往往具有更高的應用價值。3株乳酸菌發(fā)酵不同時間，發(fā)酵液的總酸度見表3。

表3 3株乳酸菌發(fā)酵液總酸度Table 3 Total acidity of fermentation broth of three strains of lactic acid bacteria

由表3可知，3株菌在培養(yǎng)階段總酸度不斷增加，產(chǎn)酸顯著，空白組酸度波動較小，證明培養(yǎng)過程沒有受到雜菌影響。0～8 h副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17酸度增長迅速，8～16 h增速減緩，16～24 h趨于平穩(wěn)；植物乳桿菌L31在0～8 h產(chǎn)酸量少，8～16 h產(chǎn)酸迅速，16～24 h趨于平穩(wěn)。在0～24 h培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)時間對菌液總酸度有顯著影響(p<0.05)。

以發(fā)酵液總酸度減去空白組培養(yǎng)基的酸度，算作菌株的產(chǎn)酸量，3株菌在不同時間段的產(chǎn)酸量比較見圖1。將數(shù)據(jù)進行以菌種為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌種在同一時間的產(chǎn)酸量是否存在差異。

圖1 不同菌株產(chǎn)酸能力Fig.1 Acid-production capacity of different strains

將產(chǎn)酸階段分為0～8 h，8～16 h，16～24 h，每個階段3株菌的產(chǎn)酸速率見圖2。將數(shù)據(jù)進行以菌株為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌株在同一時間段的產(chǎn)酸速率是否存在差異。

圖2 不同菌株產(chǎn)酸速率對比圖Fig.2 Comparison of acid-production rates of different strains

由圖1和圖2可知，3株菌在培養(yǎng)過程中持續(xù)產(chǎn)酸，且在24 h培養(yǎng)結束后，還有產(chǎn)酸趨勢；其中副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量相近，在培養(yǎng)前8 h產(chǎn)酸最快，8～16 h速率幾乎減半，16～24 h速率顯著降低并趨于平衡；而植物乳桿菌L31則在0～8 h產(chǎn)酸速率較低，8～16 h產(chǎn)酸最為迅速，產(chǎn)酸量也反超副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17，在16～24 h階段速率降低并趨于平衡；植物乳桿菌L31的最大產(chǎn)酸速率及產(chǎn)酸量均大于另外兩株菌。以菌種為變量分別對產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率進行顯著性差異分析，得出結果：菌株的差異會對產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率產(chǎn)生影響。植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸特性與干酪乳桿菌L17、副干酪乳桿菌L7存在顯著差異；干酪乳桿菌L17與副干酪乳桿菌L7產(chǎn)酸特性相近。干酪乳桿菌L17和副干酪乳桿菌L7產(chǎn)酸主要集中在前8 h,而植物乳桿菌L31在8～16 h有突出的產(chǎn)酸優(yōu)勢。總體產(chǎn)酸效果：植物乳桿菌L31>干酪乳桿菌L17>副干酪乳桿菌L7。

2.3 白酸湯中不同種乳酸菌的耐酸性測定

酸湯發(fā)酵過程中pH值在3.0～4.0之間波動，人體胃液中胃酸的主要成分為鹽酸，純胃酸的pH值約為0.9，正常胃液的pH值為2.0～3.5[21]，進食后胃液會被稀釋，pH值甚至上升至3.5[22]，比酸湯發(fā)酵的酸度更低。因此，僅少數(shù)具有良好耐酸能力的乳酸菌可以通過胃酸屏障。已知乳酸菌的耐酸機制有許多種，主要包括酸耐受反應機制、質子泵理論等[23]。由于食物在胃中通過的時間一般低于3 h，液體食物通過的時間更短，因此耐酸性試驗選擇1.5，2.5這2個pH值下培養(yǎng)試驗菌3 h，于10-7，10-8兩個稀釋梯度下觀察其存活情況。

乳酸菌耐酸性測定試驗中，存活情況見表4。

表4 白酸湯中乳酸菌在人工胃液條件下的存活率Table 4 Survival rates of lactic acid bacteria in rice sour soup under the condition of artificial gastric juice

將數(shù)據(jù)進行以pH為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗同一菌株相同培養(yǎng)時間但不同pH下的存活狀態(tài)差異，各試驗菌株在人工胃液中的存活情況見圖3中A～C，圖中不同字母表示差異性顯著(p<0.05)。將數(shù)據(jù)進行以菌株為變量的單因素顯著性差異分析，以檢驗不同菌株同一pH下培養(yǎng)3 h后的存活率差異，見圖3中D。

A

B

C

D

由表4和圖3可知，3株乳酸菌對人工胃液表現(xiàn)出了不同程度的耐受能力，且同一菌株相同pH條件下的初始菌落數(shù)和最終菌落數(shù)差異性顯著(p<0.05)，同一菌株相同時間不同pH條件下的活菌數(shù)差異也較大，不同菌株相同pH條件下的最終存活率也有一定差異，說明菌種或菌株的不同、生存環(huán)境的變化都會對其酸耐受性造成影響。總體上活菌數(shù)都隨著培養(yǎng)時間的延長和pH的降低而逐漸減少，說明胃液會對乳酸菌造成一定程度的影響。副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17在pH為1.5的人工胃液中培養(yǎng)3 h后存活率為0，菌株L7、L17在pH 2.5的條件下培養(yǎng)3 h后存活率分別為22.97%、37.50%，存活率較低，說明這兩株菌對惡劣酸性環(huán)境的耐受性較差，其中菌株L7的酸耐受性能最差。植物乳桿菌L31在pH 1.5的人工胃液中培養(yǎng)3 h后存活率僅為9.40%，但在pH 2.5的條件下培養(yǎng)3 h后存活率高達72.62%，說明該菌株的耐酸性較前兩者更強，但同樣較難在極端酸性條件下生存。溫賀等[24]測定了1株酸菜源植物乳桿菌在pH 3.0條件下的存活率為55%，由此可見，本實驗的植物乳桿菌L31菌株耐酸能力更強。比較3株乳酸菌的產(chǎn)酸能力和耐酸性，植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸能力和耐酸性都強于其他兩株菌(L7、L17)，由此可見，耐酸能力強的菌株其產(chǎn)酸能力也較強，這與白友菊[25]研究得出的結論相似。3株菌在pH 2.5條件下,3 h后活菌數(shù)都保持在107CFU/mL以上，而乳酸菌發(fā)揮益生作用的最低活菌數(shù)目為106CFU/mL，這說明當攝入數(shù)量級為108CFU/mL的酸湯源乳酸菌時，3株乳酸菌均能夠通過非空腹情況下的胃酸屏障并有機會在胃腸道中存活并發(fā)揮益生作用。

3 結論

本試驗從貴州凱里白酸湯中分離提純出7株乳酸菌，通過Sanger測序鑒定出5株副干酪乳桿菌、1株干酪乳桿菌以及1株植物乳桿菌，對其中3株不同種的乳酸菌(副干酪乳桿菌L7、干酪乳桿菌L17、植物乳桿菌L31)進行產(chǎn)酸能力和耐酸性測定，3株菌均具有良好的產(chǎn)酸能力，其中植物乳桿菌L31的產(chǎn)酸能力最強，且產(chǎn)酸時間點集中；而副干酪乳桿菌L7和干酪乳桿菌L17的產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率相近，產(chǎn)酸時間長，更易控制產(chǎn)酸進度。3株不同種的乳酸菌的耐酸性測定實驗表明，在正常胃液酸度pH 2.5下，3株菌均能存活且有幾率進入腸道發(fā)揮益生作用，其中酸耐受性強弱順序為植物乳桿菌L31>干酪乳桿菌L17>副干酪乳桿菌L7；而在空腹胃液酸度pH 1.5下，僅菌株L31能夠存活，且存活率較低，但依然能夠達到乳酸菌發(fā)揮益生作用的最低活菌數(shù)目，反映出植物乳桿菌L31具有較好的酸耐受性，有進一步開發(fā)的價值。本研究為白酸湯中乳酸菌的開發(fā)和利用奠定了理論基礎。