劉天梅

（青海省尖扎縣畜牧獸醫(yī)站，青海 尖扎 811200）

現(xiàn)階段規(guī)?；B(yǎng)殖中，由小反芻獸疫病毒引發(fā)的小反芻獸疫是一種“三高（高傳染、高發(fā)病、高死亡）”的RNA病毒性傳染病，在損害養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也不利于畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。鑒于此，本文主要系統(tǒng)化剖析了小反芻獸疫的流行病學(xué)，并就診斷技術(shù)展開了深入探討，以便于保證小反芻獸疫預(yù)防和消滅工作的高效化開展。

1 流行病學(xué)

小反芻獸疫的致病原為小反芻獸疫病毒，與其它病毒相比在形狀上，小反芻獸疫病毒多為粗糙的圓形或橢圓形，在pH5.75~9.6結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，若周邊環(huán)境pH值低于4或高于11，則會(huì)失活。作為一種急性、烈性以及接觸性RNA病毒性傳染病，小反芻獸疫的致死率極高，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定的A類動(dòng)物疫病類型。

2 臨床癥狀

小反芻獸疫的潛伏期通常為1周左右，發(fā)病后的臨床表現(xiàn)主要為體溫升高（高于41℃）、精神萎靡、眼角處有大量分泌物（漿液性逐漸變成膿性）、毛發(fā)凌亂、食欲不佳、口鼻干燥、口腔粘膜干酪樣病變、舌面和咽部潰瘍、舌背面糜爛、齒齦出現(xiàn)糜爛、口腔黏膜充血、流出大量流涎、乳頭壞死、血水樣腹瀉、孕動(dòng)物出現(xiàn)流產(chǎn)。經(jīng)剖析可知，患病的牲畜內(nèi)部變化也極為明顯，具體表現(xiàn)為硬顎至網(wǎng)胃和瘤胃交界處出現(xiàn)潰瘍、盲腸和結(jié)腸結(jié)合處出現(xiàn)斑馬樣條紋、肺出血、淋巴結(jié)腫大以及脾壞死。

3 診斷技術(shù)

3.1實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1.1 AGID 在實(shí)驗(yàn)室診斷中，與其它診斷技術(shù)相比，經(jīng)濟(jì)性、便捷性是“AGID”診斷技術(shù)的顯著特點(diǎn)。在診斷時(shí)首先診斷工作人員可用病畜的腸黏膜、淋巴結(jié)等組織制備標(biāo)準(zhǔn)PPRV抗原，并通過(guò)高免牲畜獲得抗血清，再以“瓊脂凝膠”為媒介，將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠中，而后將其放在一定溫度下，待一段時(shí)間后查看是否有“與陽(yáng)性對(duì)照抗原一樣的沉淀線”。這種診斷技術(shù)在應(yīng)用時(shí)，往往只能檢測(cè)烈性PPR抗原，相對(duì)地由于溫和型PPR抗原本身含有較少的病毒含量，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)難以出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照抗原一樣的沉淀線。

3.1.2 捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 小反芻獸疫病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要包括N、P、M、F、H以及L，而捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測(cè)對(duì)象主要是病毒中的用多種抗N蛋白單克隆抗體。在檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)工作人員可對(duì)牲畜糞便簡(jiǎn)單化處理后進(jìn)行檢測(cè)，特異性和敏感性是這種檢測(cè)技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)，但檢測(cè)成本相對(duì)較高也是這種檢測(cè)技術(shù)存在的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

3.1.3 CIEP 在病毒抗原檢測(cè)中，“CIEP”診斷技術(shù)的合理化應(yīng)用具有便捷性的顯著特點(diǎn)。在檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)工作人員可以水平電泳槽中（槽內(nèi)裝滿0.1 mol/L醋酸巴比妥緩沖液）的凝膠為載體，在正極加血清、負(fù)極加抗原，電泳0.5h后左右觀察。這項(xiàng)技術(shù)在具體化應(yīng)用時(shí)，雖然能快速檢測(cè)病毒抗原，但卻無(wú)法有效區(qū)分PPRV和牛瘟病毒的感染。

3.1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在實(shí)驗(yàn)室診斷中，“反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）”是一種常見的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，與其它診斷技術(shù)相比，特異性、靈敏性是這種檢測(cè)技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)。在檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)人員可設(shè)計(jì)三對(duì)位于F基因的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增片段的T載體克隆、序列分析，而后在通過(guò)建立區(qū)分小反芻獸疫疫苗毒與基因四系野毒的RT-PCR檢測(cè)方法用以檢測(cè)病毒，但這種檢測(cè)方式在使用時(shí)卻存在漏檢病毒引物位點(diǎn)變異病毒的劣勢(shì)，增加了后期防治工作難度。

3.1.5 LAMP 在對(duì)小反芻獸疫診斷時(shí)，LAMP也是一種比較常用的方法。當(dāng)前，有研究人員已經(jīng)針對(duì)N基因的保守區(qū)域構(gòu)建起了具體的檢測(cè)方法。在對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化之后發(fā)現(xiàn)，LAMP在檢測(cè)效率方面得到了顯著提升。通常來(lái)說(shuō)，從核酸提取到檢測(cè)結(jié)果的獲取只需要60~80min。同時(shí)，隨著技術(shù)的進(jìn)步LAMP在特異性和靈敏度方面展現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)，即使出現(xiàn)同屬病毒和類似病毒也不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。除此之外，LAMP還可以達(dá)到可視化的效果。操作時(shí)，首先要將小反芻獸疫病毒的RNA核酸提取出來(lái)，并使用分光光度來(lái)測(cè)定濃度，然后保存在-80℃的環(huán)境中。在按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作之后，要對(duì)小反芻獸疫病毒N基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并設(shè)計(jì)LAMP引物。最后通過(guò)最佳引物篩選試驗(yàn)得到反應(yīng)的最佳引物，之后可以根據(jù)實(shí)際需要開展特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)。

3.1.6 IFAT IFAT指的是間接免疫熒光抗體試驗(yàn)。在診斷小反芻獸疫病毒時(shí)，操作人員可以基于病毒特異性單克隆抗體來(lái)構(gòu)建試驗(yàn)，將感染發(fā)病早期和后期病料中的病毒抗原提取出來(lái)，完成鑒別和診斷。與此同時(shí)，技術(shù)人員還可以將重組小反芻獸疫病毒中的F蛋白作為抗原免疫基礎(chǔ)，制作多克隆抗體，以捕獲病料中的抗原。同時(shí)還需通過(guò)間接免疫熒光抗體試驗(yàn)對(duì)小反芻獸疫病毒進(jìn)行特異性診斷。

3.2血清學(xué)診斷

3.2.1 中和試驗(yàn) 相比實(shí)驗(yàn)室診斷，“血清學(xué)診斷”方式的使用不僅具有極高的診斷效益，與此同時(shí)在推動(dòng)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。作為國(guó)際貿(mào)易指定的試驗(yàn)方式，“中和試驗(yàn)”在具體化應(yīng)用過(guò)程中，工作人員需嚴(yán)格按照如下診斷流程進(jìn)行操作，即：經(jīng)過(guò)滅活待檢血清倍比稀釋→加入103TCID50/mL的病毒懸液→置于37℃下1h→每個(gè)梯度中取出0.2mL混合物于轉(zhuǎn)管內(nèi)→加入1mL Vero細(xì)胞懸液→置于37℃倒置培養(yǎng)→3d后棄去出現(xiàn)CPE的培養(yǎng)管→更換維持液→旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1周→檢測(cè)。這項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)雖然具有靈敏、特異的優(yōu)勢(shì)，但卻無(wú)法用以大規(guī)模臨床檢測(cè)。

3.2.2 分子生物學(xué)與膠體金技術(shù) 在血清檢測(cè)中，“特異性好、能夠檢測(cè)微量病毒”是“分子生物學(xué)與膠體金”診斷技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)時(shí)，具體檢測(cè)作業(yè)流程如下：對(duì)小反芻獸疫病毒N基因的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)兩條特異寡核苷酸探針→形成“生物素化探針-靶核酸-納米金探針”復(fù)合物通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)→固定在固相載體上→銀染放大信號(hào)。

3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （1）競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 當(dāng)動(dòng)物感染了小反芻獸疫病毒之后，它們的血清單體中會(huì)產(chǎn)生專門針對(duì)這種病毒的N蛋白和H蛋白。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)就是針對(duì)這兩種蛋白質(zhì)而進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，它可以通過(guò)單克隆抗體的形式來(lái)完成檢測(cè)。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有方便、快捷的特征，即使是在野外也可以對(duì)大量的樣品進(jìn)行診斷，敏感性為94.5%、特異性為99.4%。但競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)無(wú)法對(duì)小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒進(jìn)行區(qū)分，因此需要其他的方法作為輔助來(lái)進(jìn)行區(qū)分。（2）間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在操作的時(shí)候要先將抗原吸附到酶標(biāo)板上，然后向其中加入小反芻獸疫病毒的特異性血清。在經(jīng)過(guò)孵育之后加入酶結(jié)合物和底物，并對(duì)血清中所含有的特異性抗體檢測(cè)。小反芻獸疫病毒中的N蛋白中，第454~472位的氨基酸序列呈現(xiàn)出了免疫原性，這是該病毒特異性的體現(xiàn)。與此同時(shí)，小反芻獸疫病毒的B細(xì)胞表位在第452~472的區(qū)域，該區(qū)域的多肽抗體可以對(duì)病毒進(jìn)行特異性識(shí)別。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)就是在這個(gè)基礎(chǔ)上所產(chǎn)生的，它可以將小反芻獸疫病毒和牛瘟病毒進(jìn)行鑒別，實(shí)現(xiàn)了診斷效果的提升。但這種方法在實(shí)際操作的過(guò)程中容易受到其他蛋白的干擾和影響。（3）夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 在夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作的過(guò)程中，需要先將待檢測(cè)樣品與特異性抗體融合，形成免疫復(fù)合物，然后將其與預(yù)先包被在酶標(biāo)板上的捕獲抗體結(jié)合，在這之后就可以按照常規(guī)的方法，在樣品中加入酶結(jié)合物和底物檢測(cè)。這種檢測(cè)方法的原理是利用了小反芻獸疫病毒N蛋白表位的單抗。這種試驗(yàn)方法的特異性能夠達(dá)到92.8%，敏感性則為90%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的獲得時(shí)間通常在2h左右。

4 小反芻獸疫的預(yù)防

4.1免疫預(yù)防對(duì)小反芻獸疫防控，要堅(jiān)持預(yù)防為主的原則。該病具有較強(qiáng)的感染性，一旦有動(dòng)物發(fā)病，就會(huì)在短時(shí)間內(nèi)傳染給其他動(dòng)物，在不加控制的情況下會(huì)大規(guī)模的暴發(fā)。因此，養(yǎng)殖場(chǎng)要做好免疫預(yù)防的工作，通過(guò)接種小反芻獸疫疫苗的方式來(lái)達(dá)到免疫的效果?，F(xiàn)有疫苗的有效期通常為3年，相關(guān)人員需要按照規(guī)定的時(shí)間和流程來(lái)為養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物接種疫苗，在疫苗到期的末端還要及時(shí)續(xù)免。

4.2加強(qiáng)疫情的排查與檢測(cè)在小反芻獸疫防治的過(guò)程中，地區(qū)防疫部門要發(fā)揮應(yīng)有的作用，除了對(duì)養(yǎng)殖戶進(jìn)行宣傳之外，還要定期做好疫情的排查和監(jiān)測(cè)工作。根據(jù)小反芻獸疫在每5~6年會(huì)流行一次的情況，在流行區(qū)復(fù)發(fā)時(shí)間，防疫工作者需要做好疫情的監(jiān)測(cè)與記錄，為養(yǎng)殖人員提供指導(dǎo)。同時(shí)，還要與屠宰部門相互配合，做好及時(shí)有效的檢測(cè)與預(yù)防。如果發(fā)現(xiàn)疑似病癥及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)室確診的工作。

4.3做好應(yīng)急防控準(zhǔn)備由于小反芻獸疫的傳染性比較強(qiáng)，在發(fā)生疾病時(shí)做好應(yīng)急防控準(zhǔn)備是十分有必要的。具體來(lái)說(shuō)，防疫部門要提前構(gòu)建起應(yīng)急防控體系，在疫情發(fā)生之后啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案，對(duì)整個(gè)疫區(qū)進(jìn)行隔離。對(duì)急性小反芻獸疫患病動(dòng)物，要進(jìn)行撲殺，并對(duì)尸體進(jìn)行無(wú)害化處理。除此之外，還要對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行監(jiān)督與管理，要求其做好殺菌與消毒的工作，避免疫情進(jìn)一步的擴(kuò)散。

5 結(jié)語(yǔ)

在牲畜規(guī)模化養(yǎng)殖中，小反芻獸疫診斷技術(shù)雖然已經(jīng)十分成熟，但隨著疫病的頻發(fā)，為保證畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，建立便捷、快速、安全的檢測(cè)體系落實(shí)檢測(cè)工作，是高效化預(yù)防“小反芻獸疫”的有效渠道。