ITS序列分析在常見動物皮膚癬菌分類鑒定中的應(yīng)用

阮晨梅

（四川民族學(xué)院，四川康定 626000）

皮膚癬菌病是一種淺部真菌感染性皮膚病，呈全球性流行，根據(jù)流行區(qū)域不同，致病菌種類有所不同。根據(jù)生態(tài)學(xué)分類方式，皮膚癬菌主要分為親人性、親動物性、親土壤性皮膚癬菌[1]。親動物性皮膚癬菌常寄居于動物的皮膚被毛，可通過直接或間接接觸傳播，不僅在動物間相互傳播，在動物與人、人與人之間也廣泛傳播，危害較大且不易防治。隨著人類生活水平的提高，動物與人的關(guān)系愈發(fā)密切，由動物皮膚癬菌傳染人引起的人獸共患癬菌病也愈發(fā)常見。因此，探索高效分類鑒定皮膚癬菌的方法對指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。

在針對真菌的鑒定中，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析技術(shù)屬于一種不依賴病原微生物分離培養(yǎng)的高效分析技術(shù)，因其快速、簡便和高特異性，顯示出極大優(yōu)勢[2]。ITS序列分析技術(shù)不受抗生素的影響，能夠鑒定出死亡微生物和目前人工難以培養(yǎng)的微生物。通過ITS序列分析可快速鑒定患病動物感染的致病真菌，進(jìn)一步指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥。

1 ITS序列

1.1 ITS序列的結(jié)構(gòu)

皮膚癬菌的核糖體DNA以串聯(lián)重復(fù)方式構(gòu)成，由核糖體基因18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA及其相鄰的外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（external transcribed spacer，ETS）、ITS、基因內(nèi)間隔序列（intergenic spacer，IGS）構(gòu)成[3]。ITS序列是位于真菌18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的非編碼轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括位于18S rDNA、5.8S rDNA之間的第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和位于5.8S rDNA、28S rDNA之間的第二 內(nèi) 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū)ITS2[4]。18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA的基因結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定，異種間存在廣泛同源性。對比而言，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2在核糖體RNA的加工過程中常被剪切，在進(jìn)化過程中受到的自然選擇壓力小，具備更快的進(jìn)化速度，具有廣泛序列多態(tài)性，可應(yīng)用于種間分類的信息位點(diǎn)。

1.2 ITS序列的特點(diǎn)

ITS序列片段短小，具有重復(fù)的多拷貝特性，易于獲取與分析，特別適合皮膚癬菌屬、種級的系統(tǒng)發(fā)育和分類研究[5]。鑒定皮膚癬菌的種類時，可根據(jù)屬種間高變區(qū)或特異基因設(shè)計(jì)特異性引物，直接鑒定至種群水平。研究過程中，常結(jié)合病原菌菌落形態(tài)學(xué)特征、生長特性、生理生化指標(biāo)等傳統(tǒng)分類鑒定方法，提取皮膚癬菌DNA對ITS基因序列進(jìn)行測序分析，對病原菌的種類進(jìn)行高效鑒定[6]。結(jié)合16S rRNA和18S rRNA基因序列特點(diǎn)，運(yùn)用高通量測序技術(shù)可對動物皮膚樣品進(jìn)行微生物α多樣性分析和菌群結(jié)構(gòu)組成分析。有研究表明，了解患病動物病灶微生物多樣性情況可為疾病的防控和臨床指導(dǎo)用藥提供參考[7]。

2 ITS序列分析在常見動物皮膚癬菌分類鑒定中的應(yīng)用

皮膚癬菌是動物淺部真菌性皮膚病的常見致病真菌，主要寄生于動物的表皮角質(zhì)和毛發(fā)中，可在動物與人之間傳播。根據(jù)皮膚癬菌中大分生孢子和菌絲結(jié)構(gòu)的不同，可將其分表皮癬菌屬、小孢子菌屬和毛癬菌屬[8]。不同菌屬的皮膚癬菌感染特異性不同，毛癬菌屬常侵犯動物機(jī)體皮膚、趾甲和毛發(fā)，小孢子菌屬易侵犯動物機(jī)體皮膚和毛發(fā)，表皮癬菌屬侵犯動物機(jī)體的皮膚和甲。

3個屬中對動物皮膚有致病作用約30余種，在形態(tài)特征、生理生化特征上均存在一定的差異。報(bào)道常見的致病菌包括疣狀毛癬菌、須癬毛癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌，臨床診療上需要與皰疹病毒感染及其他深部真菌病相區(qū)別。臨床上常采用熒光染色法和KOH濕片法對淺表真菌進(jìn)行鏡檢，但是通過傳統(tǒng)的分類鑒定方法區(qū)別難度較大，且很難鑒定到種水平[9]。ITS序列分析能夠在較短的時間內(nèi)對動物常見的皮膚癬菌進(jìn)行分類鑒定，以便獸醫(yī)臨床上對動物皮膚癬菌病的快速診斷和治療。

2.1 疣狀毛癬菌

疣狀毛癬菌是一種獸醫(yī)臨床上常見的親動物性真菌，家畜中牛、山羊、綿羊均易感。臨床上炎癥表現(xiàn)明顯，患病動物頭、頸、軀干側(cè)面皮膚常出現(xiàn)脫毛、灰白色痂塊。疣狀毛癬病嚴(yán)重影響動物生長發(fā)育，降低機(jī)體抵抗力[10]。疣狀毛癬菌在SDA培養(yǎng)基上生長速度較慢，加入維生素B1和肌醇后真菌菌落的生長速度明顯提升。分離純化后的疣狀毛癬菌在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 w可觀察到菌落呈灰白色、乳白色或淺黃色，背面未見明顯的特征性色素，中心蠟狀成堆，邊緣呈“杉樹堆”，光鏡下可觀察到鏈狀厚膜分生孢子和鹿角樣的菌絲分支。

吳潤標(biāo)等[11]采集患病黑山羊病變皮屑進(jìn)行病原分離，根據(jù)GenBank收錄的絲狀真菌ITS基因設(shè)計(jì)皮膚癬菌ITS基因通用引物，測序分析顯示目標(biāo)菌ITS基因序列與Pchelin公布的嗜動物性疣狀毛癬菌（T.verrucosum）同源性高達(dá)99.99%，結(jié)合真菌菌落形態(tài)、孢子和菌絲結(jié)構(gòu)確定目標(biāo)菌為疣狀毛癬菌。葛松等[12]對病原真菌ITS序列進(jìn)行同源性比較鑒定，結(jié)果顯示，寧夏地區(qū)患真菌性皮膚病肉牛的病原真菌與疣狀毛癬菌同源性高達(dá)99%，系統(tǒng)發(fā)育樹上屬同一分支。基于ITS序列分析，王建昌等[13]確定2013—2014年河北進(jìn)口奶牛皮膚真菌病患牛分離得到的真菌中有10株疣狀毛癬菌，其DNA條形碼鑒定結(jié)果同形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

2.2 須癬毛癬菌

須癬毛癬菌是一種常見于人和動物的致病真菌，臨床上患病皮膚常出現(xiàn)被毛折斷、圓環(huán)狀脫毛、大量灰白色鱗屑脫落、炎性變化、結(jié)痂等病理現(xiàn)象。須癬毛癬菌是一個菌種的復(fù)合體，在種內(nèi)包含許多不同的分型，在形態(tài)學(xué)上和宿主上呈現(xiàn)多態(tài)性[14]。

菌株組成、分型方法的敏感性以及選用標(biāo)記分子的不同均可得到不同的須癬毛癬菌基因分型結(jié)果。根據(jù)SDA培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)特征、尿素酶試驗(yàn)、葡萄糖米飯?jiān)囼?yàn)、體外毛發(fā)穿孔試驗(yàn)、螺旋菌絲和大小分生孢子鏡下結(jié)構(gòu)，可將須癬毛癬菌分為羊毛狀、緊密狀、絨毛狀、粉末狀、顆粒狀等5個表型[15]。基于含錳超氧化歧化酶（MnSOD）基因序列，對14株人源須癬毛癬分離株和27動物源須癬毛癬分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，可將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ共5個基因型[16]?；趲锥≠|(zhì)酶基因序列同源性差異，可將31株兔源須癬毛癬菌分為5種基因類型；根據(jù)菌落形態(tài)特征分為顆粒型、粉末型和絨毛型等3種表型[17]。

通過ITS區(qū)段和LSU區(qū)段分子生物學(xué)序列分析，可對狐貍源性菌株的種和有性型做出明確鑒定[18]。劉彥威等[19]利用rDNA-ITS序列分析，結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)對河北省兔場患病兔病原菌分離鑒定出兔萬博節(jié)皮菌。利用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR鑒定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)趾間毛癬菌為大熊貓被毛樣本的優(yōu)勢菌種[20]。

以ITS轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為靶位，對分離自不同部位的須癬毛癬菌復(fù)合體PCR擴(kuò)增后測序，采用最大似然度法進(jìn)行序列分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；結(jié)果顯示，受試菌株和趾間毛癬菌聚類于同一主支的概率為98%，歸類于有性期為萬博節(jié)皮菌的趾間毛癬菌[21]。

2.3 犬小孢子菌

犬小孢子菌屬真菌叢梗孢科中的小孢子屬，是一類分布廣泛的親動物性真菌，在我國真菌病重發(fā)病率較高。臨床上犬小孢子菌常引起頭癬，其對皮膚毛發(fā)的損傷大，炎癥反應(yīng)明顯[22]。犬小孢子菌在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，可觀察到菌落從黃白色絲狀到白色羊毛狀的變化；在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)可觀察到黃色的特征性色素；在米飯培養(yǎng)基上可觀察到較多的大分生孢子。鏡檢犬小孢子菌可觀察到絲狀或球拍狀菌絲，頂端膨大呈紡錘形沿菌絲排列的大分生孢子，呈杵狀或葡萄狀沿菌絲排列的小分生孢子。

劉亭亭等[23]利用ITS序列分析從東北虎林園的東北虎身上鑒定出1株犬小孢子菌。崔麗娜等[24]利用ITS序列通用引物，對山東地區(qū)主要兔場的皮膚真菌病分離菌ITS區(qū)序列變異及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，確定該地區(qū)存在犬小孢子菌的流行。李鋒等[25]從1例皮膚病患犬體表分離培養(yǎng)病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定后，采用真菌鑒定通用引物ITS1、ITS4對分離菌的ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序分析；結(jié)果顯示，分離菌與Gen Bank中的犬小孢子菌（ATCC 36299）的ITS序列（FJ 385030.1）相似性為99%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上屬同一分支。夏繼寧等[6]從臨床收集的39株皮膚癬菌樣本中使用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增ITS靶基因，經(jīng)BLAST工具比對分析，顯示其中5株樣本菌為犬小孢子菌，且與表型鑒定結(jié)果相吻合。有研究利用rDNA ITS測序分析，進(jìn)一步證實(shí)了PCR-HRM分析方法獲得的HRM溶解曲線可應(yīng)用于臨床上紅色毛癬菌、指（趾）間毛癬菌、犬小孢子菌、堇色毛癬菌等4種皮膚癬菌的初步鑒定[26]。

2.4 石膏樣小孢子菌

石膏樣小孢子菌與犬小孢子菌同屬于小孢子菌屬，具有親土壤性，易感動物可通過接觸污染土壤感染?；疾游锍霈F(xiàn)脫毛、斷毛，鱗屑，脫毛部位皮膚結(jié)痂的現(xiàn)象。

石膏樣小孢子菌在SDA培養(yǎng)基上生長迅速，可觀察到菌落顏色從白色到棕黃色，形態(tài)從絨毛狀到粉末狀的變化。觀察菌落顏色可見中心色深，邊緣色淺。鏡檢可觀察到少量呈球拍狀、結(jié)節(jié)狀、梳樣的菌絲，有棘狀突起、壁薄粗糙、橢圓形或梭形的大分生孢子，長于菌絲一側(cè)的桿狀無梗小分生孢子。

李明勇等[27]通過分離青島地區(qū)患病兔病原真菌并對其ITS序列進(jìn)行分析鑒定，表明石膏樣小孢子菌在家兔中廣泛存在。石膏樣小孢子菌不僅存在于家畜中，在一些野生動物中也有分布。為研究大熊貓皮膚病的病因，中國大熊貓保護(hù)研究中心對患皮膚病的大熊貓進(jìn)行了真菌分離及形態(tài)學(xué)鑒定，并通過ITS序列分析鑒定出分離株為石膏樣小孢子菌[28]。錢晶等[29]根據(jù)石膏樣小孢子菌、犬小孢子菌、須毛癬菌ITS序列差異設(shè)計(jì)4條引物，建立多重PCR方法可同時檢測3種致病性真菌，方法簡便、特異、靈敏，可同時對寵物淺表真菌病原作出快速診斷與鑒別。

2.5 其他皮膚癬菌

ITS序列分析在斷發(fā)毛癬菌、馬毛癬菌、紅色毛癬菌等皮膚癬菌的分類鑒定中也存在少量應(yīng)用?；诰瓯硇秃突蛐吞卣鳎趓DNA ITS和TEF1序列分析下，表明感染馬毛癬菌的無癥狀患犬可將病原菌傳播給人類[30]。觀察有寵物犬接觸史的成人頭部膿癬患者，取其皮損邊緣少量分泌物分離培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)，選取真菌培養(yǎng)后菌落提取DNA，擴(kuò)增ITS區(qū)；結(jié)果顯示，測序分析ITS序列片段和斷發(fā)毛癬菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)MH877348.1相似性達(dá)到100%[31]。利用紅色毛癬菌保守區(qū)域rDNA ITS區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，可快速、準(zhǔn)確、敏感地區(qū)分紅色毛癬菌與其他皮膚癬菌[32]。

3 結(jié)論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，皮膚癬菌分類鑒定的方式不再局限于傳統(tǒng)的菌株形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)鑒定。ITS序列分析的應(yīng)用在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中主觀經(jīng)驗(yàn)的影響，使鑒定更加快速、簡單、客觀。但I(xiàn)TS序列分析無法對所有真菌的屬種進(jìn)行鑒別，在實(shí)踐應(yīng)用中也存在缺陷，尤其在比對使用的基因庫缺乏與待檢真菌親緣關(guān)系相近的已知真菌時。因此，在臨床中還需要將傳統(tǒng)的真菌學(xué)鑒定法與ITS序列分析相結(jié)合才能更好地指導(dǎo)實(shí)踐。真菌ITS序列具有種間特異性，使其在動物皮膚癬菌的分類鑒定及動物癬菌病的預(yù)防治療中發(fā)揮非常重要的作用，在動物皮膚病的臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。