綠藻多糖研究進(jìn)展

◎ 劉文晶，劉 山，王菲菲

（齊魯醫(yī)藥學(xué)院，山東 淄博 255300）

褐藻、紅藻、藍(lán)藻和綠藻是海洋中常見的藻類，許多海藻可以食用，且營養(yǎng)價(jià)值高，例如人們常食用的海帶屬于褐藻類，石花菜、角叉菜屬于紅藻類，滸苔、石莼屬于綠藻類。褐藻、紅藻利用率較高，例如卡拉膠褐藻膠等，綠藻研究相對(duì)較少。近年來，海邊經(jīng)常發(fā)生“綠潮”現(xiàn)象，主要是綠藻門的石莼泛濫，它可作為飼料、食品和藥物開發(fā)的原料[1]。由于綠藻多糖結(jié)構(gòu)往往比較復(fù)雜，大多數(shù)為酸性多糖，在結(jié)構(gòu)研究方面研究相對(duì)緩慢，但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)構(gòu)解析方面也有了較大進(jìn)步，本文就近年來綠藻多糖的研究進(jìn)展情況進(jìn)行綜述。

1 綠藻多糖提取方法

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是多糖提取最經(jīng)典的方法，多糖是多羥基化合物，極性較大，所以用極性大的蒸餾水作為溶劑提取綠藻里面的多糖是常用方法。一般先將綠藻沖洗干凈，去除雜質(zhì)，烘干后磨碎得干燥藻粉。將藻粉與蒸餾水按照一定比例混合，用常溫或者一定溫度蒸餾水進(jìn)行提取，將多糖溶液濃縮后，用95%的乙醇進(jìn)行醇沉處理，此方法需計(jì)算好料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度等。曹素建等[2]從石莼綠藻類中，按照藻粉與超純水1∶50的料液比，100 ℃熱水提取粗多糖，得率為5.75%。

1.2 酸/堿提取法

酸/堿提取法的基本原理是，弱酸或弱堿溶液可以破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)多糖成分盡可能多的被提取出來，但要注意的是要選擇適合的pH值來進(jìn)行提取，pH值過大或過小都存在破壞多糖糖苷鍵的風(fēng)險(xiǎn)。付雙超等人[3]確定滇刺棗多糖的最優(yōu)提取條件為檸檬酸調(diào)節(jié)pH值到1.5、溫度90 ℃、時(shí)間80 min，此時(shí)多糖提取率為13.62%。王姝垚等[4]采用0.5 mol·L-1NaOH溶液提取腸滸苔綠藻多糖，提取溫度為100 ℃，提取時(shí)間為2 h，粗多糖得率為6.4%。

1.3 超聲波提取法

超聲波提取法主要是通過改變超聲儀器的功率達(dá)到震碎細(xì)胞壁的效果，使細(xì)胞內(nèi)多糖溶出，該方法要注意提取時(shí)間，防止超聲過度，使多糖糖鏈發(fā)生斷裂。彭傳友等[5]采用超聲波提取法提取枇杷葉多糖，結(jié)果表明液料比為33 mL·g-1、功率320 W，溫度60 ℃、提取時(shí)間32 min時(shí)為最優(yōu)提取條件，最優(yōu)得率為5.78%。此法不用添加額外試劑，相對(duì)安全可靠，為枇杷葉多糖的提取提供了最優(yōu)方案。

1.4 酶解提取法

酶解法提取多糖可以使用一種提取酶，也可以多種提取酶聯(lián)合使用，原理是用酶破壞植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞質(zhì)中的多糖充分溶解出來，提高粗多糖的得率。杜涓等[6]采用纖維素酶提取玉米芯多糖，將玉米芯酶解20 h后，酶解法提取分離后的樣品與不加纖維素提取酶的樣品對(duì)比，發(fā)現(xiàn)具有相同的多糖官能團(tuán)，掃描電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示酶解后的多糖表面變得粗糙，立體結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定變化。酶解后多糖體外抗氧化活性得到了增強(qiáng)，主要原因是酶解的過程中也破壞了原來多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖有一定降解，體外抗氧化活性得到了增強(qiáng)。黃斌[7]在提取海洋綠藻滸苔多糖時(shí)，用酶法提取比其他方式多糖得率要高。

2 綠藻多糖分離純化方法

2.1 除雜

綠藻粗多糖提取之后往往摻雜色素和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，首先需要將色素去除，可以采用活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法等，吸附色素的同時(shí)也會(huì)損失一部分多糖，也可以使用過氧化氫法等化學(xué)方法去除色素，但實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)單的方式是采用透析袋透析法。這種方法是將粗多糖用少量蒸餾水溶解，置于透析袋中，外部大量純水，透析袋內(nèi)色素會(huì)滲透到外部環(huán)境中，但由于多糖粒徑較大無法透過透析袋薄膜，截留在內(nèi)部，實(shí)現(xiàn)脫色目的，此方法要注意透析袋孔徑，防止多糖的外溢。綠藻提取后的多糖有時(shí)會(huì)攜帶蛋白質(zhì)大分子，除蛋白的方式很多，有生物法、物理法和化學(xué)法。曹澤虹等[8]采用不同化學(xué)方法對(duì)駿棗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，發(fā)現(xiàn)三氟乙酸法脫蛋白效果最好，樣本損失率最小。

2.2 分離純化

常用的多糖分離方法有多級(jí)醇沉法、電泳法等，對(duì)于綠藻多糖最常用的是柱層析法。離子交換色譜原理是多糖分子和色譜柱內(nèi)部填料發(fā)生電吸附作用，被離子色譜柱吸附下來，再通過不同濃度的鹽溶液作為流動(dòng)相，使填料與多糖發(fā)生解吸附作用，不同濃度的流動(dòng)相可以使不同類型的多糖分子解離下來，實(shí)現(xiàn)分離目的。凝膠柱層析法是運(yùn)用分子排阻原理實(shí)現(xiàn)多糖的分離，填料一般是葡聚糖凝膠、丙烯葡聚糖凝膠，原理是小分子量多糖分子在填料的孔徑內(nèi)游走路徑長(zhǎng)，流出的時(shí)間長(zhǎng)，大分子量多糖分子進(jìn)入填料孔徑內(nèi)受阻力大，不易進(jìn)入孔徑，比較容易流出，流出時(shí)間短。HE等[9]采用Q-Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子色譜柱及Sephacryl S-400凝膠色譜柱對(duì)小枝剛毛藻粗多糖進(jìn)行了分離純化，得到半乳-阿拉伯聚糖OHSS2，并用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定其分子量，呈現(xiàn)單一對(duì)稱單峰，表明多糖純度較高，分離效果較好。

3 綠藻多樣結(jié)構(gòu)研究

綠藻多糖往往是酸性多糖，在解析結(jié)構(gòu)時(shí)具有其特殊性，多糖和其他生物大分子類似，具有一級(jí)、二級(jí)等多級(jí)結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)研究是綠藻多糖研究的基礎(chǔ)，隨著分析儀器和分析方法的進(jìn)步，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)研究有了進(jìn)一步進(jìn)展。高級(jí)結(jié)構(gòu)解析包括二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)研究，主要研究其空間構(gòu)象。

3.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)

目前多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)解析較為成熟，一級(jí)結(jié)構(gòu)解析主要集中在單糖組成、相對(duì)分子量、糖殘基鏈接方式、取代基鏈接位點(diǎn)和單糖的構(gòu)型等。相對(duì)分子量可通過低壓凝膠滲透色譜法、高效凝膠滲透色譜法、電泳法和質(zhì)譜法等進(jìn)行檢測(cè)，常采取高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖的分子量，根據(jù)液相圖譜的出峰時(shí)間和不同多糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量做線性回歸曲線，根據(jù)樣品出峰時(shí)間即可算出多糖的相對(duì)分子量。單糖組成分析常采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜法，即把多糖降解后的單糖，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生上發(fā)色基團(tuán)，與標(biāo)準(zhǔn)單糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，確定其單糖組成。甲基化結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是近年來多糖糖殘基解析的常用方式，基本原理是多糖的游離羥基被甲基取代，進(jìn)行酸降解，降解樣品經(jīng)過還原、乙酰化得到甲基化的糖醇乙酸酯，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析，與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，即可得出糖殘基之間的鏈接方式。值得注意的是，綠藻多糖多為硫酸多糖，還要把脫硫前后的樣品進(jìn)行甲基化對(duì)照實(shí)驗(yàn)以確定硫酸根的鏈接位置。LI等[10]從一種礁膜綠藻中用熱水提取分離得到粗多糖，進(jìn)一步通過陰離子交換柱和凝膠排阻色譜柱分離得到純品多糖PF2，主要的糖殘基為→3)-α-L-Rhap-(1→和→2)-α-L-Rhap-(1→,分支部分位于→3)-α-L-Rhap-(1→的C-2位置上，硫酸根基團(tuán)位于→2)-α-L-Rhap-(1→的C-3位置上。

3.2 高級(jí)結(jié)構(gòu)

多糖作為一種生物大分子，分子量比較大，且海藻多糖往往含有酸性基團(tuán)，空間結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。由于空間結(jié)構(gòu)對(duì)生物活性影響較大，所以多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)解析十分重要，主要包括二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)研究，研究方法有核磁共振法、X-射線衍射技術(shù)、圓二色譜法、糖芯片技術(shù)和分子模擬技術(shù)等方法。DAYAL等[11]利用X射線衍射技術(shù)分析了細(xì)菌纖維素結(jié)構(gòu)表征，得到總輪廓、結(jié)晶度、晶體尺寸等相關(guān)參數(shù)。

4 綠藻多糖活性研究

近年來，綠藻多糖的活性一直是多糖研究的熱點(diǎn)，包括抗凝血、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和免疫調(diào)節(jié)等活性研究。CAO等[12]從礁膜綠藻中提取出一種多糖，命名為MS-1，經(jīng)測(cè)定，MS-1在體內(nèi)外均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗凝血活性，并顯著降低血小板聚集能力。通過血栓的濕重和長(zhǎng)度，以及電誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓形成的血栓閉塞時(shí)間來評(píng)估，MS-1在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗血栓活性。這些結(jié)果提示，MS-1可能是一種很有前途的預(yù)防和治療血栓栓塞性疾病的海洋藥物。QIN等[13]從綠藻線形硬毛藻中提取得到一種硫酸鼠李多糖，對(duì)人胰島胰樣多肽的（Human Islet Amyloid Polypeptide，hIAPP）聚集具有抑制作用，可使hIAPP聚集形態(tài)改變，證明該多糖能有效抑制hIAPP聚集，具有較強(qiáng)的抗糖尿病活性。綠藻多糖，不僅可以用于醫(yī)學(xué)研究，在食品、化工方面也有重要應(yīng)用，比如石莼聚糖可以作為優(yōu)良的食品添加劑，滸苔多糖可以作為果凍里面的凝膠，綠藻多糖還可以作為有機(jī)肥料或者動(dòng)物飼料。

5 結(jié)語

綠藻多糖是一種非常特殊的天然大分子，目前還沒有被深度開發(fā)利用，目前集中在結(jié)構(gòu)研究和活性研究，在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、化工和食品方面有了一定應(yīng)用。綠藻由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，結(jié)構(gòu)解析比較煩瑣，尤其是高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析難度較大，結(jié)構(gòu)與生物活性的構(gòu)效關(guān)系還不夠明朗。為更好地研究多糖的結(jié)構(gòu)，可將其進(jìn)行寡糖制備，通過確定寡糖的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而推斷多糖結(jié)構(gòu)。綠藻多糖的活性研究取得了較大進(jìn)步，但其分子量巨大，分子難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因此其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。