毛茛科和芍藥科葉綠體基因組密碼子特征和系統(tǒng)發(fā)育比較

穆贏通 樊東昌 呂麗娟 李曉杰 路景詩 張曉明

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，呼和浩特 010019）

毛茛科（Ranunculaceae）為多年生至一年生草本，少數(shù)為藤本或灌木，單葉或復葉，花通常兩性，輻射對稱，果實為蓇葖果或瘦果，約62 屬，2 500 余種。在世界各洲廣布，主要分布在北半球溫帶和寒溫帶。我國有42 屬（包含引種的1 個屬，黑種草屬），約720 種，在全國廣布，常分布于西南部山地［1-2］。毛茛科植物大部分植物有很高的觀賞和藥用價值。毛茛科是被子植物原始類群之一，在被子植物系統(tǒng)演化中占據(jù)十分重要的地位，其系統(tǒng)關(guān)系和科下演化關(guān)系一直備受爭議［3］。毛茛科植物傳統(tǒng)的基于形態(tài)學的分類系統(tǒng)與分子系統(tǒng)學研究結(jié)果存在較大差異，近20 年的分子系統(tǒng)學研究雖然也確定了一些類群屬級地位，但對于科下許多類群的關(guān)系依然很不清楚［4］。芍藥科（Paeoniaceae）植物世界上僅一屬（芍藥屬Paeonia）約35 種，分布于歐、亞大陸溫帶地區(qū)，我國有11 種，主要分布在西南、西北地區(qū)［5］。芍藥科（Paeoniaceae）植物有很高的觀賞和藥用價值。自瑞典植物學家林奈（Garl von Linné）于1935 年根據(jù)原產(chǎn)于歐洲巴爾干半島培奧尼亞地方的一種多年生草本植物建立了芍藥屬，世界上應(yīng)用最廣的恩格勒系統(tǒng)（Engler）、邊沁系統(tǒng)（Bentham）和虎克系統(tǒng)（Hooker）等分類系統(tǒng)都把芍藥屬置于毛茛科中。到了20 世紀初，1908 年英國學者Wors?dell 發(fā)現(xiàn)芍藥屬植物的雄蕊群離心發(fā)育與毛茛科不同，將其獨立為芍藥科，但仍放在毛茛目中。近一個世紀來關(guān)于芍藥屬的分類等級和系統(tǒng)位置一直是植物分類學領(lǐng)域中爭論的熱點。至20世紀70 年代初，支持成立芍藥科，在國際上終于取得較為一致的意見。然而，關(guān)于芍藥科的系統(tǒng)位置卻又成為新的爭論熱點。芍藥科先被放入五椏果科目，在最新的APG 系統(tǒng)中被放在虎耳草目（Saxifragales）［6］。

中心法則是重要的生物學規(guī)律，在生物體遺傳信息傳遞的過程中三聯(lián)體密碼子是聯(lián)結(jié)核酸和蛋白質(zhì)的紐帶，扮演著重要的角色。生物一共有64 個通用密碼子，他們編碼20 多種不同的蛋白質(zhì)。在多種氨基酸中只有甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）由1 個密碼子編碼，其余氨基酸都由1 個以上密碼子編碼［7］。編碼同一氨基酸不同的密碼子稱為同義密碼子，生物翻譯的過程中同義密碼子的使用頻率是不同的，往往使用一種或者幾種特定的密碼子，密碼子這一特性叫做密碼子使用偏好性［8］。Grantham 認為造成密碼子使用偏好性的主要原因是突變壓力［9］，Ikemura 認為是選擇壓力［10］。此外密碼子親水性、DNA 復制起止位點和基因的長度也會影響密碼子的偏好性［11-13］。分析生物體密碼子使用特征對遺傳改良，分子育種和基因組的深入研究有重要作用。葉綠體是光合作用的直接細胞器，擁有大量的遺傳信息。而且具有結(jié)構(gòu)完整和序列保守性的特點［4］。其次，葉綠體DNA的核苷酸置換率適中，在應(yīng)用上很有價值。葉綠體基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的分子進化速度差異顯著，分別適用于不同階層的系統(tǒng)學研究［14］。

目前密碼子偏好性研究的論文很多，但都集中在單科或者單屬上，比較不同科的很少。因此本研究選取分類上比較有爭議的芍藥科和毛茛科來比較二者的密碼子使用特征和系統(tǒng)進化關(guān)系。為毛茛科和芍藥科植物的分子育種，遺傳改良和基因組，系統(tǒng)進化關(guān)系的深入研究提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究收集了已經(jīng)進行測序的7種芍藥科，33種毛茛科植物葉綠體基因組，所有數(shù)據(jù)均從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載，然后根據(jù)GenBank 的注釋信息提取33 種植物葉綠體基因組的編碼區(qū)域（Cds）序列。選取其中大于300 bp 的CDS序列用于以下分析［15］。

1.2 方法

1.2.1 密碼子使用特征基本參數(shù)

使用密碼子分析軟件CodonW 計算40 種植物葉綠體基因組CDS 序列密碼子以下指標［16］：①密碼子第3 位上4 種堿基A/T/C/G 的出現(xiàn)頻率（A3s，T3s，C3s，G3s）、密碼子的GC 含量和第3 位上GC含量（GC3s）。②同義密碼子的相對使用度（rela?tive synonymous codon usage，RSCU）。③有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）。④使用在線軟件CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）計算密碼子GC 含量（GC1，GC2，GC3）及3 位堿基的GC平均含量（GC-all）［17-18］。

表1 40種植物葉綠體基因組Table 1 Chloroplast genomes of 40 species

1.2.2 密碼子偏好性影響因素分析方法

1.2.2.1 ENC-plot繪圖分析

ENC 是用來衡量同義密碼子偏好性的指標，有效密碼子數(shù)在20～61，ENC 低于35 表示密碼子使用有高偏好性，反之表示低偏好性［19］。以每條CDS 序列真實ENC 值和GC3s 值做散點圖，然后添加ENC和GC3s之間的標準曲線。

結(jié)果可用于分析密碼子偏好性的影響因素，如果散點符合標準曲線或分布在標準曲線周圍。說明僅突變是密碼子偏好性的影響因素。如果散點低于標準曲線，分布在標準曲線很遠的地方，說明影響密碼子偏好的因素還有選擇和其他因素。

1.2.2.2 中性繪圖

對40 種植物葉綠體基因組進行中性繪圖，用R 對40 種植物每個基因的GC3 含量，GC12 含量做散點圖和直線擬合（GC3 含量橫坐標，GC12 含量縱坐標）。如果回歸系數(shù)接近于1說明密碼子偏好性受突變影響，接近0說明密碼子偏好性受自然選擇影響。

1.2.2.3 PR2分析

同義密碼子通常第3位堿基不同，為了避免因此我們選擇具有4 個同義密碼子的8 個氨基酸（第3 位堿基為ATCG）來分析密碼子第3 位堿基的分布情況。以G3/（G3+C3）和A3/（A3+T3）分別作為橫坐標和縱坐標來繪圖。在只有堿基突變的情況下A/T 和G/C 應(yīng)該相等，否則說明密碼子的偏好性受自然選擇和其他因素影響［20］。

1.2.3 最優(yōu)密碼子確定

計算芍藥科和毛茛科葉綠體基因組基因密碼子的RSCU，如果密碼子RSCU 大于1，說明此密碼子為高頻密碼子。高表達基因具有較低的ENC值，低表達基因具有較高的ENC 值。按照ENC 值的大小對每個物種的基因進行排序，選取高低兩端各5%的基因分別作為低表達基因組和高表達基因組。計算高表達基因組和低表達基因組每個密碼子的差值ΔRSCU，如果ΔRSCU 大于0.08 為最優(yōu)密碼子［21-22］。

1.2.4 系統(tǒng)進化分析

用MAFFT v7.313 對芍藥科和毛茛科葉綠體全基因組和葉綠體CDS 序列進行比對［23］。利用MEGAX 的系統(tǒng)鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對葉綠體全基因組和葉綠體CDS 序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并進行1 000次引導重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子基本特征參數(shù)分析與比較

7 種芍藥科植物葉綠體基因組密碼子數(shù)目十分接近，平均為24 325，其中密碼子數(shù)目最多的為Paeonia suffruticosa（24 791），最少的為P. decom?posita（24 178）33 種毛茛科植物葉綠體基因組密碼子平均數(shù)目為24 707，和芍藥科植物無明顯差異，其中密碼子數(shù)目最多的為Anemone henryi（25 900），最少的為Aquilegia rockii（23 729）。芍藥科和毛茛科植物葉綠體基因組密碼子每個位置的GC 含量均小于0.5，說明40 種植物密碼子都偏好使用A/U。7 種芍藥科植物GC 含量由大到小均為GC1、GC2、GC3。33種毛茛科植物中除了A.barne?byi是GC2 含量大于GC1 和GC3。其余植物GC 含量的大小關(guān)系與芍藥科植物相同。7 種芍藥科植物的ENC 值均在51 左右。33 種毛茛科植物中，A.rockii（57.56）和A.barnebyi（53.10）ENC值明顯與其他植物不同，二者同為耬斗菜屬，其余植物的ENC值也均在51左右（見表2）。

表2 葉綠體基因組密碼子參數(shù)特征Table 2 Codon features of chloroplast genome

2.2 高頻密碼子分析與比較

芍藥科植物葉綠體基因組和毛茛科植物葉綠體基因組（耬斗菜屬除外）具有29 個同義密碼子（RSCU>1），29 個密碼子偏好都相同，其中27 個密碼子都以A/U 結(jié)尾、1 個密碼子以G 結(jié)尾、1 個以C結(jié)尾；2 種耬斗菜屬植物葉綠體基因組，具有28 個同義密碼子（RSCU>1），并且2 種植物還存在部分不同。A.rockii葉綠體基因組28個密碼子中，18個以A/U 結(jié)尾，其中7 個以G 結(jié)尾，3 個以C 結(jié)尾；A. barnebyi葉綠體基因組28 種密碼子中25 個以A/U結(jié)尾，1個以G結(jié)尾，2個以C結(jié)尾（見表3）。

表3 40種植物葉綠體基因組同義密碼子分析Table 3 Synonym codon analysis of chloroplast genome in 40 species

2.3 最優(yōu)密碼子確定

芍藥科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子數(shù)目和毛茛科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子數(shù)目在物種間并沒有表現(xiàn)出一致性。芍藥科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子數(shù)在5～22 個，其中Paeonia decomposita最多，為22個；P.veitchii最少，為5 個。芍藥科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子第3 位堿基本都偏向與A/U，編碼L 的最優(yōu)密碼子中，P. veitchii、P. jishanensis、P. rockii、P. suffruticosa出現(xiàn)了以G 結(jié)尾的情況。編碼S 的最優(yōu)密碼子中P. decomposita、P. delavayi、P. jisha?nensis、P. suffruticosa出現(xiàn)了以C 結(jié)尾的情況。毛茛科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子數(shù)在3～24 個，其中Actaea dahurica最多，為24個，Callianthemun alata?vicum最少，為5個。毛茛科葉綠體基因組最優(yōu)密碼子第3位堿基也都偏向于A/U。編碼L的最優(yōu)密碼子中，Actaea dahurica、Adonis coerulea、Anemone hen?ryi、Caltha palustris、Isopyrum manshuricum出現(xiàn)了以G結(jié)尾的情況；編碼S的最優(yōu)密碼子中Actaea dahuri?ca、Adonis sutchuenensis、Anemone henryi、Aquilegia rockii、Helleborus thibetanus、Isopyrum manshuricum出現(xiàn)了以C結(jié)尾的情況（見表4）。

表4 40種植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子分析Table 4 Optimal codon analysis of chloroplast genome in 40 species

2.4 密碼子偏好影響因素分析

2.4.1 ENC-plot繪圖分析

芍藥科7 種植物和毛茛科33 種植物葉綠體基因組的基因都分布在標準曲線的兩側(cè)，小部分基因分布在標準線下側(cè)很遠的位置，說明毛茛科33種植物和芍藥科7 種植物葉綠體基因組密碼子偏好形成，不僅受突變的影響，還受自然選擇的影響（見圖1～2）。

圖1 ENC-plot分析Fig.1 ENC-plot Analysis of Ranunculaceae

2.4.2 PR2分析

對芍藥科7 種植物和毛茛科33 種植物葉綠體基因組密碼子第3 位堿基A3/T3、C3/G3 進行PR2分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，坐標點非均勻地分布在兩個區(qū)域。G3/（G3＋C3）>0.5 和A3/（A3＋T3）<0.5 的區(qū)域，說明芍藥科7 種植物和毛茛科33 種植物密碼子的偏好不僅受堿基突變的影響，還受自然選擇和其他因素的影響（見圖3～4）。

圖2 ENC-plot分析Fig.2 ENC-plot Analysis of Paeoniaceae

圖3 PR2分析Fig.3 PR2 Analysis of Paeoniaceae

圖4 PR2分析Fig.4 PR2 Analysis of Ranunculaceae

2.4.3 中性繪圖

中性繪圖結(jié)果表明，40 種植物葉綠體基因組的GC12 和GC3 無顯著相關(guān)。芍藥科7 種植物的葉綠體基因組GC3 在0.186～0.367，GC12 在0.328～0.543，斜率在-0.0957～0.1770。芍藥科7 種植物中Paeonia jishanensisvoucher PJISH20180113（斜率0.031）密碼子偏好受自然選擇影響最大。Paeonia rockii（0.1766）密碼子偏好受自然選擇影響最小。毛茛科33 種植物的葉綠體基因組GC3 范圍在0.219～0.357，GC12 在0.351～0.550，斜率在0.087～0.460。毛茛科33 種植物中Ranunculus macranthus（斜率為0.460）受自然選擇影響最小，Nigella dam?ascena（0.087）受自然選擇影響最大。芍藥科7 種植物和毛茛科33種植物葉綠體密碼子偏好不僅受突變影響，還受自然選擇的影響，自然選擇影響大于突變影響，芍藥科植物葉綠體基因組密碼子偏好受自然選擇影響大于毛茛科植物（見圖5）。

圖5 40種植物葉綠體中性繪圖分析Fig.5 Neutrality plot Analysis of Chloroplast genomes in 40 species

2.5 芍藥科和毛茛科植物分子系統(tǒng)學研究

2.5.1 基于葉綠體基因組完整序列的系統(tǒng)進化分析

以大戟科（2 種）、小檗科（2 種）、虎耳草科（2種）、五椏果科（1 種）和薔薇科（2 種）作為外類群，基于葉綠體基因組完整序列的系統(tǒng)進化分析表明，首先同屬植物都被聚類在一起。芍藥科被分為牡丹組和芍藥組，符合中國植物志分類關(guān)系和APG 分類關(guān)系。外類群把芍藥科和毛茛科植物分隔開來，毛茛科基于葉綠體基因組完整序列的系統(tǒng)進化關(guān)系偏離中國植物志分類關(guān)系，但支持把毛茛科劃分為4 亞科14 族［24］。除屬于唐松草亞族的尾囊草被劃分到側(cè)金盞族中，其余同族植物均被劃分在一起。此外銀蓮花族和毛茛族出現(xiàn)了親緣關(guān)系接近外類群的現(xiàn)象。芍藥科和外類群虎耳草科聚類在一起，符合APG 分類系統(tǒng)二者同屬于虎耳草目。大戟科和薔薇科聚類在一起符合APG分類系統(tǒng)二者同屬于薔薇系。五椏果科在APG 系統(tǒng)中從薔薇目中分離出來單獨放入五亞科目，從基于葉綠體基因組的分類結(jié)果上五椏果科更接近虎耳草目。APG 分類系統(tǒng)中屬于毛茛目的小檗科卻沒有和毛茛科聚類在一起（見圖6）。

圖6 基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)進化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on chloroplast genome

2.5.2 基于葉綠體基因組CDS序列的系統(tǒng)進化分析

基于葉綠體基因組CDS 序列的系統(tǒng)進化分析表明，同屬植物也都被聚類在一起。芍藥科基于葉綠體基因組CDS 序列系統(tǒng)進化關(guān)系和基于葉綠體基因組全序列的系統(tǒng)關(guān)系部分不同，但也可以分成兩個組，牡丹組和芍藥組。毛茛科的系統(tǒng)進化關(guān)系與基于葉綠體全序列的系統(tǒng)關(guān)系也不同，但更支持把毛茛科劃分為4 亞科14 族，尾囊草也被劃分到唐松草亞族上。此外也出現(xiàn)了毛茛族接近外類群的現(xiàn)象。外類群把芍藥科和毛茛科植物分隔開來，被劃分到虎耳草目（見圖7）。

圖7 基于Cds序列的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic analysis tree on CDS sequence

3 討論

密碼子在基因翻譯成蛋白質(zhì)的過程中起重要的作用。研究密碼子的使用特征對于遺傳改良和分子育種有重要的作用。目前公認的密碼子偏好的形成因素是自然選擇和突變壓力。分析密碼子偏好的形成因素對理解生物與環(huán)境間的分子機制，探討基因的起源和生物的系統(tǒng)進化關(guān)系有重要的作用。本研究比較毛茛科植物和芍藥科植物葉綠體基因組密碼子使用模式。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛茛科和芍藥科葉綠體基因組的高頻密碼子一致性很高，但最優(yōu)密碼子具有差異。但二者第3位堿基都偏向于以A/U 結(jié)尾，這與魯桑、茶樹和楊樹等雙子葉植物研究結(jié)果［25-27］一致。毛茛科和芍藥科葉綠體基因組密碼子偏好性的形成因素主要受自然選擇的影響，且芍藥科葉綠體基因組密碼子偏好性受自然選擇的影響大于毛茛科。

葉綠體基因組在植物系統(tǒng)進化研究中有重要的作用。芍藥科植物因為雄蕊群離心發(fā)育被劃分出毛茛科。陳之端和法國學者索菲·納多分別用6段序列和8 段序列構(gòu)建了毛茛科的最新系統(tǒng)發(fā)育樹，雖然二者大體相似，但在細節(jié)上仍然有頗多差別。這說明毛茛科除了基部相繼分出的3 個亞科之外，其核心演化支因為在白堊紀后期通過輻射演化快速形成了幾乎所有族的祖先，形成了難于解析的多分支結(jié)構(gòu)。因此，納多研究組建議把唐松草亞科和毛茛亞科（以及側(cè)金盞花亞科）合并成范圍更大的毛茛亞科，唐松草亞科降為毛茛亞科的一個族，并為毛茛科前3 亞科各設(shè)1 族，這樣毛茛科就分為4 亞科14 族，且全部14 個族都在白堊紀-古近紀絕滅事件之前即已分化。本研究對毛茛科植物和芍藥科植物進行系統(tǒng)進化研究。結(jié)果表明，毛茛科基于葉綠體基因組全序列的系統(tǒng)進化關(guān)系和基于葉綠體基因組CDS 序列的系統(tǒng)進化關(guān)系存在不同。二者都不支持中國植物志的分類關(guān)系，但支持把毛茛科劃分為4 亞科14 族?；谌~綠體基因組CDS 序列的系統(tǒng)進化關(guān)系更支持支持把毛茛科劃分為4 亞科14 族.此外兩種方法中毛茛科中都出現(xiàn)了毛茛族接近外類群的現(xiàn)象，這也就說明了毛茛科是個多系群。芍藥科基于葉綠體基因組全序列和基于葉綠體基因組CDS 序列的系統(tǒng)進化關(guān)系，同屬植物均被聚類在一起。芍藥科基于葉綠體基因組全序列和基于葉綠體基因組CDS 序列的系統(tǒng)進化關(guān)系雖然部分不同，但都可以被劃分為芍藥組和牡丹組?；谌~綠體基因組全序列的系統(tǒng)進化關(guān)系和基于葉綠體基因組CDS序列的系統(tǒng)進化關(guān)系，毛茛科和芍藥科的系統(tǒng)位置均被外類群分割開來，支持芍藥科獨立于毛茛科和毛茛目劃分到虎耳草目，但兩種分類方式存在不同這也間接說明非編碼區(qū)在系統(tǒng)進化中有一定的作用。