覃 碧 劉明洋 王 萌 王立豐 黃 飛

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，海口 571101；2. 海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228；3. 海南瑞橡熱帶經(jīng)濟(jì)投資集團(tuán)有限公司，?？?570105）

赤霉素（gibberellin，GA）是一種植物激素，調(diào)控生長發(fā)育多個(gè)過程，包括種子萌發(fā)、莖伸長、葉片伸長和花發(fā)育等［1～3］。DELLA 蛋白作為生長抑制因子，是GA 信號傳導(dǎo)過程起負(fù)調(diào)控作用的一類蛋白［4］。擬南芥基因組和水稻中的DELLA 蛋白在抑制GA 反應(yīng)方面表現(xiàn)出部分重疊但截然不同的功能［5］。在擬南芥中，RGA 和GAI 是GA 促進(jìn)營養(yǎng)生長和成花啟動(dòng)的主要抑制因子，RGL2 是參與種子萌發(fā)過程中主要的DELLA 蛋白，RGA、RGL1 和RGL2 均參與控制花的發(fā)育［6～7］。DELLA 蛋白豐度是通過調(diào)節(jié)GA水平來觸發(fā)泛素—蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白降解過程進(jìn)行調(diào)控的。酵母三雜交試驗(yàn)表明GA-GID1復(fù)合物促進(jìn)RGA和F-box蛋白SLY1之間的相互作用，F(xiàn)-box蛋白是SCFSLY1E3泛素連接酶的組成部分，其互作促使DELLA 蛋白降解。E3泛素連接酶COP1 在煙草中過表達(dá)促使DELLA 等位基因的降解，通過增加GA水平進(jìn)而降低DELLA蛋白豐度［8］。DELLA 蛋白有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N端DELLA 結(jié)構(gòu)域和C 端GRAS 結(jié)構(gòu)域［9］。其中，DELLA 結(jié)構(gòu)域?qū)τ贕A 降解是必需的，但不是Fbox 蛋白結(jié)合所必需，而GRAS 結(jié)構(gòu)域?qū)ELLA 蛋白與其他蛋白的互作起關(guān)鍵作用。DELLA 不能結(jié)合DNA，其主要是作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子［10］。

橡膠樹（Hevea brasiliensisMüll.Arg.）可合成優(yōu)質(zhì)的天然橡膠，是不可或缺的工業(yè)原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、交通運(yùn)輸以及國防建設(shè)等領(lǐng)域。橡膠樹生長發(fā)育和產(chǎn)量與植物激素信號密切相關(guān)［11］。目前，生產(chǎn)上應(yīng)用最多的產(chǎn)量刺激劑是乙烯利（ET）［12］。茉莉酸（JA）也有促進(jìn)橡膠生物合成的作用［11］。隨著分子生物技術(shù)手段的不斷應(yīng)用及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究取得顯著進(jìn)展，推動(dòng)了橡膠樹中植物激素信號交互的研究。在橡膠樹中，赤霉素信號的關(guān)鍵蛋白HbRGA1［13］和HbGAI［14］已經(jīng)克隆，但關(guān)于橡膠樹中DELLA蛋白編碼基因RGL1結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚。據(jù)此，本研究以橡膠樹品種熱研7-33-97為材料，克隆并鑒定HbRGL1的cDNA全長序列，對其基因序列進(jìn)行鑒定及生物信息學(xué)分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）分析該基因的表達(dá)特征，為研究橡膠樹中DELLA 蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國家橡膠樹種質(zhì)資源圃提供，橡膠樹品種熱研7-33-97 不同組織及其不同處理后的樣品采集，包括過氧化氫（H2O2）、赤霉素（GA3）、生長素（auxin，IAA）、乙烯利（ethephon，ET）、脫落酸（abscisic ac?id，ABA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、干旱和機(jī)械傷害均參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行［15］。樣品統(tǒng)一用液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用，每個(gè)處理包含3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

橡膠樹不同組織的總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 濃度和純度的檢測均參照樊松樂等的方法進(jìn)行［16］。

1.2.2 HbRGL1 cDNA全長序列的克隆

根據(jù)橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫的序列通過Primer Premier5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物HbRGL1-F 和HbRGL1-R（見表1），以反轉(zhuǎn)錄得到的熱研7-33-97葉片cDNA 為模板，用高保真性聚合酶Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，中國南京）進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA模板2 μL（～60 ng），2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1each）1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足50 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。通過PCR 擴(kuò)增得到HbRGL1目的條帶，使用凝膠回收試劑盒（Vazyme，中國南京）參考說明書對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物連接到TOPO-Blunt 平末端載體（上海翊圣生物科技有限公司，中國上海）后熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含氨芐抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落PCR 檢測后挑選陽性單克隆送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

表1 HbRGL1 基因全長克隆和熒光定量PCR 擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used in full-length gene clon‐ing and qRT-PCR amplification of HbRGL1

1.2.3 HbRGL1的生物信息學(xué)分析

利 用ProtParam、NCBI Conserved Domain、MEME、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM 等在線分析工具對HbRGL1 進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析［18］。利用DNAMAN 工具軟件進(jìn)行多序列比對。HbRGL1 蛋白通過NCBI SmartBLAST 搜索獲得同源蛋白序列，然后利用MEGAX 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 不同處理下HbRGL1表達(dá)模式分析

根據(jù)HbRGL1基因的ORF 設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物（見表1），以HbACTIN（Genbank登陸號：HQ260674.1）基因?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：

AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中國南京）10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，cDNA 1 μL（～20 ng），ddH2O 8.2 μL，在Bio-Rad熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s，之后進(jìn)行42 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增（95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s）。基因表達(dá)量為3次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。基因相對表達(dá)結(jié)果在Excel 2016軟件用2-△△Ct法［17］進(jìn)行計(jì)算，采用SPSS 25 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05 即為顯著性差異，并采用Origin Pro 2016軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRGL1 基因的克隆及其編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

以橡膠樹葉片cDNA為模板，使用特異引物克隆HbRGL1的cDNA 序列，測序驗(yàn)證正確后將其命名 為HbRGL1并 提 交NCBI（GenBank 登 陸 號：KM086714）。HbRGL1基因cDNA長度為1 901 bp，包含1 851 bp 的ORF，編碼616 個(gè)氨基酸。利用ProtParam 工具在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果表明HbRGL1 分子式為C2922H4599N817O922S27，蛋白質(zhì)分子量為66.79 kDa，等電點(diǎn)為5.28，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為46.73，脂肪系數(shù)為81.07，表明HbRGL1 為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.2 HbRGL1蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用NCBI Conserved Domain 進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，HbRGL1 蛋白的第49-122 位氨基酸是特征性的DELLA 結(jié)構(gòu)域，第249-611 位氨基酸是GRAS 結(jié)構(gòu)域（見圖1A 和圖3）。利用MEME 在線軟件分析橡膠樹HbRGL1與其他植物DELLA 蛋白序列發(fā)現(xiàn)，它們具有3 個(gè)共同的motif（見圖1B）。使用SignalP-5.0 Server 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，HbRGL1 沒有信號肽結(jié)構(gòu)。利用SOPMA 和SWISS-MODEL 分別預(yù)測HbRGL1蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α螺旋占43.90%，延長鏈占8.78%，β折疊占4.55%，無規(guī)卷曲占42.76%。TMHMM Server v.2.0 分析結(jié)果表明，HbRGL1 無跨膜結(jié)構(gòu)。利用DeepLoc-1.0 預(yù)測HbRGL1 蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞核中，其概率為0.998（見圖2A）。

圖1 HbRGL1蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析A.保守結(jié)構(gòu)域；B.不同物種DELLA蛋白基序預(yù)測Fig.1 Analysis of the structural characteristics of HbRGL1 A.Conserved domain；B.Prediction of the conserved motif of DELLA proteins form different species

圖2 HbRGL1的亞細(xì)胞定位預(yù)測及其系統(tǒng)進(jìn)化樹分析A.HbRGL1亞細(xì)胞定位預(yù)測；B.不同物種DELLA蛋白進(jìn)化樹分析Fig.2 Subcellular localization prediction of HbRGL1 and phylogenetic analysis A.Subcellular localization prediction of HbRGL1；B.Phylogenetic analysis of DELLA proteins of different species

圖3 HbRGL1與其他植物DELLA蛋白序列比對Fig.3 Sequence alignment of HbRGL1 with other plant DELLA proteins

2.3 HbRGL1 與其他植物DELLA 蛋白的比對分析

HbRGL1 與其他植物DELLA 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，HbRGL1與同為大戟科（Euphorbia?ceae）的橡膠樹HbGAIL、木薯MeGAIL、蓖麻Rc?GAI、麻風(fēng)樹JcGAI 相似性最高，聚為一類；大豆GmDELLA1 與擬南芥AtRGA 單獨(dú)聚為一類，明顯區(qū)別于其他木本植物的DELLA 蛋白，木本植物與草本植物DELLA 蛋白形成了兩個(gè)大的分支（見圖2B），表明其功能在不同植物中出現(xiàn)了分化。進(jìn)一步利用DNAMAN 軟件對HbRGL1 及其他植物DELLA 蛋白序列進(jìn)行多重序列比對分析，結(jié)果顯示，HbRGL1 與其他植 物DELLA 蛋白在DELLA和GRAS 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度保守，HbRGL1與HbGAIL、木薯MeGAIL、毛果楊PtGAI、擬南芥AtRGA 之間的相似度分別為90.2%、90.1%、78.0%、62%；而不同植物的DELLA 蛋白間總體相似度達(dá)到81.4%（見圖3），表明DELLA 蛋白在不同植物中具有較高的保守性。

2.4 HbRGL1基因的表達(dá)分析

通過qRT-PCR 分析HbRGL1在橡膠樹不同組織中的表達(dá)模式，結(jié)果顯示HbRGL1在樹皮中的表達(dá)量最低；其次是膠乳和葉片，其表達(dá)量分別為樹皮中的4.2 和8.2 倍；而在花中的表達(dá)量最高，是樹皮中的18.2倍（見圖4）。為了進(jìn)一步解析HbRGL1基因在脅迫處理下的響應(yīng)模式，本研究分析了干旱、機(jī)械傷害以及H2O2處理后HbRGL1基因的表達(dá)趨勢。結(jié)果如圖4所示，干旱處理顯著誘導(dǎo)HbRGL1的表達(dá)，干旱處理后8 d 其表達(dá)量上升達(dá)到處理前（0 d）的10.1 倍。機(jī)械傷害和H2O2處理也能明顯誘導(dǎo)HbRGL1的表達(dá)，其表達(dá)量在機(jī)械傷害后10 h達(dá)到初始0.5 h 的7.1 倍；而在H2O2處理后6 h 其表達(dá)量是對照0 h 的7.3 倍；以上結(jié)果表明，HbRGL1響應(yīng)橡膠樹干旱脅迫、機(jī)械傷害及H2O2處理。

圖4 HbRGL1基因在不同組織及不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析A.不同組織；B.干旱脅迫；C.機(jī)械傷害；D.過氧化氫；各柱形圖上用不同字母表示差異顯著（P<0.05），下同F(xiàn)ig.4 Expression analysis of HbRGL1 in different tissues and under stress treatments A.Different tissues；B.Drought stree；C.Mechanical wounding；D.H2O2；Different letters above each column means significant at P＜0.05 level，the same as below

經(jīng)不同外源激素處理后的qRT-PCR 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HbRGL1基因表達(dá)量顯著提高。結(jié)果如圖5所示，在外施GA3作用下，HbRGL1基因表達(dá)被快速誘導(dǎo)，在0.5 h的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到了0 h的14.6倍。外施IAA 也會(huì)誘導(dǎo)HbRGL1的表達(dá)，分別在6 和48 h表達(dá)量出現(xiàn)最高值，均為0 h 的5.4 倍。外源ET 和MeJA處理后6 h，HbRGL1的表達(dá)水平均達(dá)到最高，分別為0 h 的10.6 倍和5.4。外源ABA 處理也能快速誘導(dǎo)HbRGL1表達(dá)，在0.5 h 的表達(dá)量就提高了4.2 倍且一直維持至10 h，24 h 快速下降，48～72 h再次上調(diào)。外施SA 處理下，HbRGL1的響應(yīng)比其他激素遲緩，其表達(dá)量在48 h 出現(xiàn)峰值，是0 h 的6.3 倍（見圖5）。這些結(jié)果表明，外源激素包括GA3、IAA、ET、MeJA 及SA可以有效地誘導(dǎo)HbRGL1基因的表達(dá)，其中HbRGL1對GA3的應(yīng)答快速且表達(dá)量增強(qiáng)幅度最大。

圖5 HbRGL1在不同外源激素處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析A.赤霉素；B.乙烯利；C.茉莉酸甲酯；D.生長素；E.脫落酸；F.水楊酸Fig.5 Expression analysis of HbRGL1 under treatments with different exogenous hormones A.GA3；B.ET；C.MeJA；D.IAA；E.ABA；F.SA

3 討論

植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程通過關(guān)鍵調(diào)控因子不斷調(diào)整植物的生長發(fā)育以適應(yīng)不同的環(huán)境變化［18］。DELLA 蛋白是GA 信號通路的重要調(diào)控因子，屬于GRAS 轉(zhuǎn)錄因子家族，因其具有高度保守DELLA 結(jié)構(gòu)域而得名［19］。GRAS 轉(zhuǎn)錄因子由最早發(fā)現(xiàn)的3個(gè)成員GAI、RGA和SCR的特征字母而命名，在植物的生長發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)中具有重要作用［20］。本研究從橡膠樹中克隆得到一個(gè)DELLA 蛋白編碼基因HbRGL1，蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，HbRGL1 蛋白含有DELLA 和GRAS兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，屬于植物DELLA 蛋白家族成員。已有研究表明，DELLA 蛋白定位在植物細(xì)胞核中［21］，HbRGL1蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測定位于細(xì)胞核中，與已有的研究結(jié)果一致。qRT-PCR 結(jié)果表明，HbRGL1在橡膠樹所有組織中均有表達(dá)，但花中的表達(dá)量最高，表明HbRGL1在橡膠樹花的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在擬南芥和葡萄的研究中也證明RGL1基因?qū)ㄆ鞴侔l(fā)育起關(guān)鍵作用［22-23］。

DELLA 除了在GA 信號通路中發(fā)揮中重要作用，還作為多個(gè)信號通路交叉互作的節(jié)點(diǎn)調(diào)控植物的發(fā)育過程［24］。本研究通過qRT-PCR 技術(shù)分析了HbRGL1在外源GA3、IAA、ET、MeJA 及SA 處理后的表達(dá)量，結(jié)果表明HbRGL1響應(yīng)不同激素的處理。生長素與赤霉素對植物的促進(jìn)作用極其相似，尤其在果實(shí)生長調(diào)節(jié)過程中的相互作用。在番茄果實(shí)發(fā)育過程中，生長素信號成分SiARF7 和激活因子SiARFs 通過不同的結(jié)構(gòu)域與GA 信號抑制因子SiDELLA 反饋調(diào)控果實(shí)生長相關(guān)基因的表達(dá)，對番茄果實(shí)的形成有重要調(diào)控作用［25］。DEL?LA 蛋白還通過與EIN3 拮抗作用調(diào)控葉綠素的生物合成［26］。ABA 參與種子休眠的建立和維持，而GA 則促進(jìn)種子萌發(fā)的誘導(dǎo)，GA 和ABA 發(fā)揮拮抗作用調(diào)控種子萌發(fā)過程。DELLA 蛋白與ABA 信號通路的調(diào)控因子ABI3和ABI5相互作用，從而激活靶基因SOMNUS（SOM）的轉(zhuǎn)錄，SOM能促進(jìn)ABA的生物合成進(jìn)而抑制GA的生物合成，從而抑制種子萌發(fā)［27］。JA 和GA 交叉參與植物防御系統(tǒng)和生長發(fā)育過程。在沒有GA 的情況下，穩(wěn)定的DELLA 蛋白與MYC2 競爭與JAZ 的結(jié)合，JAZs 釋放MYC2，MYC2 通過與G-box 基序的結(jié)合激活JA信號途徑防御基因的表達(dá)［28］。JAZ 和DELLA 的相互作用影響DELLA 調(diào)節(jié)PIFs 活性，說明JA 和GA信號拮抗作用調(diào)節(jié)植物光形態(tài)發(fā)生［29］。DELLA 蛋白同樣參與SA 介導(dǎo)的生物脅迫和非生物脅迫過程。當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，抗病調(diào)控因子EDS1 與DELLA 蛋白R(shí)GA 和RGL3相互作用，抑制SA 過度生成和過度抗性反應(yīng)，通過維持植物生長和防御間的平衡［30］。在干旱條件下，GA 和SA 協(xié)同作用提高水稻應(yīng)對干旱脅迫的耐受能力［31］。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫、機(jī)械傷害、H2O2、外源激素包括GA3、IAA、ET、MeJA 及SA 可以有效地誘導(dǎo)HbRGL1基因的表達(dá)，推測HbRGL1參與橡膠樹中多個(gè)激素信號及其交互作用過程，并通過不同信號途徑及其交互作用調(diào)控橡膠樹的生長發(fā)育與脅迫響應(yīng)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明HbRGL1調(diào)控橡膠樹生長發(fā)育與脅迫響應(yīng)的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。