基于GC-MS的野生和‘魯赫’刺薔薇葉片代謝差異研究

吳 艷 李 賽 吳可心 穆立薔

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 50040）

刺薔薇（Rosa acicularis）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，是典型的野生資源植物，主要生長在中國東北、西北、華北等地區(qū)［1］，是優(yōu)質(zhì)的醫(yī)用與藥用植物［2-3］。刺薔薇果實(shí)中維生素C 和超氧化物歧化酶含量極高［4］，且風(fēng)味物質(zhì)豐富多樣［5］，是具有較好開發(fā)前景的野果資源。刺薔薇花可提取揮發(fā)油（花精油）［6］。刺薔薇葉片富含單寧，可提制栲膠［1］；同時(shí)含有豐富的黃酮和多酚類抗氧化物質(zhì)［7］。‘魯赫’刺薔薇（R. acicularis‘Luhe’）是俄羅斯從野生刺薔薇中選育出的一個(gè)品種，我國經(jīng)西伯利亞引進(jìn)。相比于野生刺薔薇，其在觀賞性［8］、抗鹽堿脅迫［9］、花精油得率［6］等方面表現(xiàn)更好，但其抗脅迫性尚不能完全適應(yīng)高寒或高鹽堿地區(qū)［10］。

代謝組學(xué)（Metabonomics）是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后又一新興的組學(xué)方法［11］。該方法通過高通量檢測和數(shù)據(jù)處理對代謝物組群指標(biāo)進(jìn)行分析，對生物代謝物質(zhì)信息進(jìn)行建模與系統(tǒng)整合，對研究對象進(jìn)行代謝產(chǎn)物定性定量的分析，進(jìn)而探究生物體的代謝過程和變化機(jī)制［12］。但生物體內(nèi)代謝途徑和產(chǎn)物眾多且復(fù)雜，僅植物的代謝產(chǎn)物就有20 萬～100 萬種［13］。代謝組學(xué)方法目前廣泛應(yīng)用于植物學(xué)研究中。其中GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）是一種靈敏度高、分離效果好、較為成熟的代謝組學(xué)檢測方法，且有多個(gè)大型公共數(shù)據(jù)庫用以檢測和匹配代謝物數(shù)據(jù)［14］。

葉片是植物重要營養(yǎng)器官葉的主要組成部分，是植物體光合作用和很多生理活動的主要承擔(dān)者，葉片的代謝物數(shù)據(jù)可以反映整個(gè)植物種類的生理特性。目前有關(guān)刺薔薇葉片的研究多以提取精油及其抗氧化能力為主［15］，暫缺乏有關(guān)葉片的代謝研究。本研究旨在通過GC-MS 代謝組學(xué)方法，探究野生刺薔薇和‘魯赫’刺薔薇的葉片代謝差異，分析和總結(jié)野生與人工栽培的2 種刺薔薇的葉片代謝差異，為刺薔薇種質(zhì)資源評價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

野生刺薔薇和‘魯赫’刺薔薇葉片于2019 年9月分別取自黑龍江省伊春市湯旺河和哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)植物園，均經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)穆立薔教授鑒定。選取長勢良好且高度相近的植株，剪切無病蟲害侵染、品相良好的成熟葉片若干，冰袋保存，每種樣品準(zhǔn)備3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。所有樣品用去離子水洗凈，濾紙吸干，備用［16］。

1.2 樣品制備

精密稱取90 mg 葉片，置入2 mL 離心管；加入2 粒小瓷珠和540 μL 的含內(nèi)標(biāo)（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1）甲醇，超低溫冷卻（-80 ℃，2 min）；放入研磨機(jī)中研磨（40 Hz，2 min），研磨徹底后超聲提取30 min（100 W）；加入300 μL的氯仿，漩渦震蕩（20 Hz，2 min）；加入600 μL的去離子水，重新漩渦震蕩；超聲提取30 min，低溫離心（14 000 r·min-1，4 ℃，10 min）；取700 μL 的上層溶液，導(dǎo)入新的2 mL離心管中，真空離心并濃縮揮干；向試管中加入400 μL 的甲氧胺鹽酸吡啶溶液（15 mg·mL-1），漩渦震蕩（20 Hz，2 min），將試管置入震蕩培養(yǎng)箱（37 ℃，90 min）；取出試管后加入400 μL的BSTFA（含1%的TMCS）和60 μL 的正己烷，漩渦震蕩（20 Hz，2 min），水浴（70 ℃，60 min）；取出樣本，室溫放置30 min，移入GC-MS樣本小瓶［17］。

1.3 GC-MS進(jìn)樣條件

使用Agilent 7890A 自動進(jìn)樣器進(jìn)樣至Agilent 7890B 色譜儀（均為美國安捷倫公司）和5977B 質(zhì)譜儀，經(jīng)非極性DB-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm I.D.，美國加州Folsom 公司）分離后進(jìn)入Agilent 5977B 質(zhì)譜儀，進(jìn)樣口溫度260 ℃，He 氣純度99.999%，流速1.0 mL·min-1，分流比1/10；升溫程序?yàn)?0～125 ℃（8 ℃·min-1）到125～210 ℃（4 ℃·min-1）到210～270℃（5 ℃·min-1）到270～305 ℃（10 ℃·min-1）；終溫305 ℃，保持3 min；EI 源電壓-70 V，溫度260 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～600 m·z-1，采集延遲5 min，采集速率為每秒20個(gè)光譜［18］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用R 語言XCMS 數(shù)據(jù)包對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪、過濾、峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊、文庫匹配等預(yù)處理［19］，使用Excel 2019 進(jìn)行峰面積歸一化法處理和對數(shù)轉(zhuǎn)換，使用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），使用SPSS 25 進(jìn)行t檢驗(yàn)，登錄KEGG 官網(wǎng)（https：//www.kegg.jp/）查詢差異代謝物ID 代號，將其代入MBRole 2.0（http：//csbg.cnb.csic.es/mbrole2/）分析差異代謝通路，使用R 語言進(jìn)行層次聚類分析和富集代謝氣泡圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種刺薔薇葉片代謝物總體差異

經(jīng)GC-MS 非靶向代謝組學(xué)［20］對2 種刺薔薇葉片進(jìn)行的代謝組學(xué)分析，共匹配出51種代謝物，包括6種氨基酸、12種糖類、4種烷烴類化合物、17種有機(jī)酸（不包含氨基酸）、5 種酯類和7 種其他類化合物（見表1）。使用峰面積歸一化法得出各代謝物的相對含量。

表1 兩種刺薔薇葉片的代謝物成分Table 1 Elements of metabolites of leaves from 2 R.acicularis

由于植物葉片含有的代謝物多為沸點(diǎn)較高的非揮發(fā)性物質(zhì)，須將其進(jìn)行衍生化處理才能進(jìn)入氣相色譜儀檢測［21］。本試驗(yàn)使用的三氟乙酰胺衍生化試劑（BSTFA）含1% 的三甲基氯硅烷（TMCS），原始數(shù)據(jù)中檢測到的化合物主要為硅烷化后的衍生物［22］，對各代謝物峰面積歸一化的計(jì)算應(yīng)去掉衍生化所帶來的-SiH2-亞甲硅基，才能得出較為準(zhǔn)確的峰面積數(shù)據(jù)。計(jì)算的公式如下：

式中：S為代謝物新峰面積，S0為原始數(shù)據(jù)中的峰面積，M0為衍生化產(chǎn)物的分子質(zhì)量，n為衍生化增添的Si 原子數(shù)量（代謝物原本含Si 原子的不計(jì)入），MSi為-SiH2的分子質(zhì)量（取s30.10）。

2.2 總代謝物PCA分析

對2 種刺薔薇葉片的GC-MS 代謝物總數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA），在95%的置信區(qū)間內(nèi)可得R2X=0.751 497，R2X＞0.5（見圖1），說明根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立的PCA 模型穩(wěn)定，可以用于結(jié)果解釋以及后續(xù)的處理。從結(jié)果圖中可知，‘魯赫’刺薔薇葉片和野生刺薔薇葉片的PCA 模型坐標(biāo)分別分布于y軸兩側(cè)且分布較為均勻，初步證明二者的代謝物存在明顯的不同，且同種間差異較小，可對其進(jìn)行進(jìn)一步的差異代謝物研究。

圖1 兩種刺薔薇葉片總代謝物PCA分析Fig.1 PCA analysis of total metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

2.3 總代謝物OPLS-DA分析

對2 種刺薔薇葉片的GC-MS 代謝物總數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘分析（OPLS-DA），可得R2X=0.966 663，Q2=0.920 560，R2X和Q2均＞0.5，且R2X＞Q2，二者相差極小且接近1，初步說明該模型較為有效可行。繪制2 種刺薔薇葉片代謝物的OPLSDA的3D圖，由圖2可知，2組數(shù)據(jù)的模型分別位于x=0，y=0 平面兩側(cè)，且各自較為聚集，可以有效說明二者間代謝差異較為明顯且同種間差異較小，建立的OPLS-DA模型較為符合預(yù)期。

圖2 兩種刺薔薇葉片總代謝物OPLS-DA的3D圖Fig.2 3D diagram of total metabolite OPLS-DA in leaves of two kinds of R.acicularis

為防止OPLS-DA 模型出現(xiàn)過擬合，對其進(jìn)行20次的置換檢驗(yàn)，可知R2X總是大于Q2，說明建立的模型未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，結(jié)果較為可靠（見圖3）。

圖3 兩種刺薔薇葉片總代謝物OPLS-DA的置換檢驗(yàn)Fig.3 Displacement test of OPLS-DA of two total metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

2.4 差異代謝物的篩選和分析

選擇OPLS-DA模型中變量投影重要性分析值（VIP）＞1 的代謝物數(shù)據(jù)，使用SPSS 25 對其進(jìn)行t檢驗(yàn)，篩選出P＜0.05 的數(shù)據(jù)，確定為2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物。對各項(xiàng)代謝物的差異倍數(shù)值（FC 值）進(jìn)行以2 為底數(shù)的對數(shù)換算，以野生刺薔薇葉片為基準(zhǔn)，log2FC＜0表示上調(diào)，反之則表示下調(diào)。

根據(jù)表2 可知，篩選出2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物共19 種，以野生刺薔薇葉片為基準(zhǔn)，‘魯赫’刺薔薇葉片代謝物中糖類中的β-龍膽二糖、阿拉伯呋喃糖和麥芽糖，有機(jī)酸類中的2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸和硬脂酸，烷烴類中的3，8-二甲基-十一烷，其他類中的乙醇胺、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷和甘油表達(dá)為下調(diào)；有機(jī)酸中的4-氨基丁酸、綠原酸、4-羥基苯甲酸和莽草酸，氨基酸中的L-丙氨酸和纈氨酸，其他類中的雙酚A 單甲醚表達(dá)為上調(diào)。對2 種刺薔薇葉片的差異代謝物相對含量數(shù)值矩陣進(jìn)行歐式距離矩陣計(jì)算，以完全連鎖方法進(jìn)行聚類分析（見圖4），大致上可將差異代謝物分成分為4 類：第1 類為4-羥基苯甲酸、雙酚A 單甲醚、4-氨基丁酸、綠原酸、L-丙氨酸和莽草酸；第2類為沒食子酸、乳酸、2，3，4-三羥基丁酸、阿拉伯呋喃糖、甘油和蘋果酸；第3類為硬脂酸、乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷和麥芽糖；第4類為纈氨酸、乙醇胺、β-龍膽二糖和3，8-二甲基-十一烷。其中第1 類全部為有機(jī)酸（含氨基酸），第2類以有機(jī)酸（含纈氨酸）為主，第3 類以糖（苷）為主，第4類則成分較為復(fù)雜，各類代謝物均含有。

圖4 兩種刺薔薇葉片的差異代謝物的層次聚類分析熱圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of differential metabolites in leaves of two kinds of R.acicularis

表2 兩種刺薔薇葉片的差異代謝物的篩選結(jié)果Table 2 Screening results of differential metabolites in leaves of 2 R.acicularis

由以上結(jié)果可知，相較于‘魯赫’刺薔薇，野生刺薔薇葉片主要在糖類和糖苷類物質(zhì)代謝表達(dá)上調(diào)，在2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸和硬脂酸4種有機(jī)酸代謝表達(dá)上調(diào)，在其他有機(jī)酸類物質(zhì)和氨基酸代謝表達(dá)下調(diào)。野生刺薔薇葉片在糖（苷）類的相對含量上優(yōu)于‘魯赫’刺薔薇，而‘魯赫’刺薔薇的抗脅迫物質(zhì)（有機(jī)酸、氨基酸）相對含量更高。

2.5 差異代謝通路分析

將19種差異代謝物英文名稱代入KEGG 官網(wǎng)查詢ID，將ID 序列代入MBRole 2.0 得出差異代謝通路名稱和組分?jǐn)?shù)據(jù)，使用R 語言繪制富集氣泡圖，選擇impact 值（氣泡面積）較大和-log10（P-val?ue）（顏色鮮艷程度）較大的代謝通路，作為2 種刺薔薇葉片的主要差異代謝通路（見圖5）。由富集氣泡圖可得出二者主要的差異代謝通路有5條，分別是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路、苯丙烷的生物合成途徑、苯甲酸的輔酶A 降解途徑、苯甲酸的羥基化降解途徑和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑。另有奎寧酸未被KEGG 收錄ID，將在討論中單獨(dú)列出。

圖5 兩種刺薔薇葉片的代謝通路富集氣泡圖Fig.5 Enrichment bubble diagram of metabolic pathway in leaves of two kinds of R.acicularis

由差異代謝通路分析可得，‘魯赫’刺薔薇和野生刺薔薇的葉片主要在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、苯丙烷的生物合成、苯甲酸的降解和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝這4個(gè)方面有顯著的代謝差異。

3 討論

為探究刺薔薇的野外條件下的野生種和人工栽培的人工選育栽培種（‘魯赫’刺薔薇）的葉片代謝差異，對野生和‘魯赫’刺薔薇的葉片進(jìn)行的非靶向GC-MS 代謝組學(xué)分析共檢測和匹配出51 種代謝物，PCA 和OPLS-DA 模型可靠，其中利用OPLS-DA 模型共篩選出19種代謝物作為2 種刺薔薇葉片的代謝差異物。以野生刺薔薇作對照，‘魯赫’刺薔薇共有4種糖（苷）類、3，8-二甲基-十一烷、乙醇胺、甘油和少量有機(jī)酸表達(dá)下調(diào)，4種有機(jī)酸、2種氨基酸和雙酚A 單甲醚表達(dá)上調(diào)。糖類物質(zhì)作為光合作用的最終產(chǎn)物，是植物體內(nèi)主要的能量和碳骨架來源［23］。在野外條件下，野生刺薔薇葉片的糖類相對含量較高，其光合作用效率可能較‘魯赫’刺薔薇高，但由于二者變量不單一（取材地海拔氣候有一定差別），可在今后的研究中補(bǔ)充葉片凈光合速率對比試驗(yàn)。部分氨基酸和有機(jī)酸是植物的次生代謝產(chǎn)物或重要前體［24-25］，本試驗(yàn)中的‘魯赫’刺薔薇在人工栽培條件下，部分有機(jī)酸類（2，3，4-三羥基丁酸、沒食子酸、乳酸、蘋果酸、麥芽糖、硬脂酸、4-氨基丁酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、L-丙氨酸、奎寧酸、莽草酸、纈氨酸）代謝表達(dá)和野生刺薔薇出現(xiàn)差異，說明二者在有機(jī)酸類相關(guān)次生代謝方面因基因［26］和環(huán)境因子［27-28］出現(xiàn)表達(dá)差異。

2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝通路有5 條，主要表現(xiàn)在ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、苯丙烷的生物合成、苯甲酸的降解和部分氨基酸的代謝這4 個(gè)方面。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一大類跨膜蛋白，植物ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量高達(dá)上百種，與其復(fù)雜的代謝活動密切相關(guān)，在植物表面蠟質(zhì)分泌、調(diào)節(jié)重金屬含量、次生代謝物運(yùn)輸?shù)确矫姘l(fā)揮著極其重要的功能［29］。苯丙烷的生物合成途徑是大多數(shù)植物次生代謝物的主要來源之一［30］，對植物的生長發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫起到重要作用［31］。苯甲酸是植物的自毒作用產(chǎn)物［32］，是植物因無益代謝物的過度積累產(chǎn)生的有害產(chǎn)物［33］，苯甲酸的積累會嚴(yán)重抑制植物的生長發(fā)育［34］。丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝與植物的生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和抗脅迫反應(yīng)密切相關(guān)［35］?？鼘幩崾嵌喾N天然芳香族化合物經(jīng)莽草酸生物合成途徑的關(guān)鍵前體［36］，2種刺薔薇葉片在奎寧酸代謝上有顯著差異，但二者并未在整個(gè)莽草酸代謝途徑有明顯差異。ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、苯丙烷的生物合成、3 種氨基酸的代謝和植物生長發(fā)育、生物素調(diào)節(jié)和環(huán)境應(yīng)答有密切聯(lián)系。所有的通路均受基因的調(diào)控和環(huán)境的影響，并且互相之間也有錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系，如苯丙烷的合成影響氨基酸的合成，苯甲酸會抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)等［33］。二者未在整體的代謝通路以及次生代謝上出現(xiàn)差異富集，說明雖然栽培條件不同，但遺傳物質(zhì)接近的二者葉片的代謝通路并未有整體差異，僅限于前文提到過的5條差異代謝通路。

目前的代謝組學(xué)技術(shù)還無法做到對生物體進(jìn)行精準(zhǔn)、全面的檢測，本研究依靠GC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)僅能確定2 種刺薔薇葉片的顯著差異代謝物與和代謝途徑，無法對其進(jìn)行更深一步的定量和拓?fù)潢P(guān)系研究，但本研究的結(jié)果可為其基因序列、蛋白質(zhì)種類和轉(zhuǎn)錄因子的選取縮小范圍，結(jié)合生物信息學(xué)對其進(jìn)行更全面深入的研究，并對相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供依據(jù)。對于刺薔薇資源植物，在以后的研究中，可結(jié)合基因組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組等對其進(jìn)行生長發(fā)育、抗脅迫、觀賞、綠化、營養(yǎng)與藥用價(jià)值等方面的研究。