肋果沙棘和西藏沙棘轉(zhuǎn)錄因子bHLH94基因?qū)０芜m應(yīng)性分化的研究

錢 婷 趙 凡 張玉潔 李雪麗 孫 坤 張 輝

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070）

堿性螺旋—環(huán)—螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子是最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其廣泛存在于真核生物中［1］。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子因含有bHLH 結(jié)構(gòu)域而命名，其結(jié)構(gòu)域主要由保守的60 個氨基酸殘基組成［2］。根據(jù)功能的不同，bHLH 結(jié)構(gòu)域可以分為兩部分：堿性區(qū)域和HLH 區(qū)域。堿性區(qū)域分布在bHLH 保守結(jié)構(gòu)域的N 末端，包含15～20 個與DNA結(jié)合相關(guān)的殘基；HLH 結(jié)構(gòu)域分布在bHLH 結(jié)構(gòu)域的C 末端，由兩個α螺旋組成，是bHLH 轉(zhuǎn)錄因子中同源或異源二聚體形成必不可少的結(jié)構(gòu)［2］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育研究，動物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子主要分為A～F六類［2］。根據(jù)結(jié)構(gòu)域、表達(dá)模式及轉(zhuǎn)錄功能，前人將bHLH 轉(zhuǎn)錄因子分為Ⅰ～Ⅶ七類［3］。植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子雖然還沒有明確定義，但是越來越多植物bHLH亞家族基因已得到鑒定［1］。

在植物體內(nèi)，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物生長發(fā)育調(diào)控，如花形態(tài)發(fā)生、氣孔細(xì)胞分化和保衛(wèi)細(xì)胞形成等［2］。此外，研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子可與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控多種次級代謝產(chǎn)物的生物合成及誘導(dǎo)途徑，主要包括萜類、生物堿、苯丙素、花青素等，這些次級代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用［4］。例如：蘋果（Malus pumila）中MdbHLH3過表達(dá)，花青素積累增加，提高蘋果耐寒性［5］；龍血樹（Dracaena cambodiana）中，DcbHLH5通過參與植物黃酮類化合物合成途徑，減少輻射對DNA和蛋白質(zhì)等大分子的損傷［6］。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH 轉(zhuǎn)錄因子也可通過調(diào)控植物激素信號通路，響應(yīng)植物逆境脅迫。例如：在擬南芥（Arabidop?sis thaliana）中，AtbHLH122在保衛(wèi)細(xì)胞過表達(dá)，抑制脫落酸（ABA）的分解代謝，從而增強擬南芥的耐旱性，該基因通過調(diào)節(jié)脯氨酸的積累及丙二醛的降解提高擬南芥耐鹽性［7］；在水稻（Oryza sativa）中，OsbHLH148基因通過調(diào)節(jié)茉莉酸（JA）信號通路及OsJAZ蛋白的功能，提高水稻耐旱性［8］。

青藏高原伴隨著強風(fēng)、強紫外輻射、低氧和低溫等極端的環(huán)境特征，分布在青藏高原的植物長期受低溫和強紫外輻射等環(huán)境的影響，形態(tài)特征和生理生化方面發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化，這些變化也體現(xiàn)在基因?qū)用嫔希?］。沙棘屬（Hippophae）植物分為無皮組和有皮組，無皮組分布范圍廣泛，海拔在550～3 000 m；有皮組集中分布于青藏高原及邊緣地區(qū)，海拔在3 000～5 200 m，在高山河谷、高原河漫灘地或高山草甸形成大片的沙棘灌叢［10］。肋果沙棘（H. neurocarpa）是青藏高原隆起過程中形成的適應(yīng)寒冷環(huán)境的有皮組一員，其生長的海拔為2 700～4 300 m［10］。為適應(yīng)高海拔極端環(huán)境，肋果沙棘演化出晴天爆發(fā)式集中開花機制、長距離風(fēng)媒散粉機制［11］和增強抗氧化酶活性適應(yīng)強輻射環(huán)境的生理特征［12］。西藏沙棘（H. tibetana）生長于海拔2 700～5 200 m 的河灘及高山草地，是青藏高原隆起之前就存在的最古老的有皮組一員。西藏沙棘具有高山植物形態(tài)上最典型的表型特征，即矮生性［13］。研究表明，相比于肋果沙棘，西藏沙棘在形態(tài)及生理等特征上更進(jìn)化［13］。

目前，肋果沙棘和西藏沙棘適應(yīng)高海拔環(huán)境的研究主要集中于表型分析［10，13］，就基因?qū)用骊U述肋果沙棘和西藏沙棘海拔適應(yīng)性的研究還有待深入。因此，對不同海拔梯度下的肋果沙棘和西藏沙棘進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出受到正選擇作用的轉(zhuǎn)錄因子bHLH94基因，基于bHLH94基因在肋果沙棘和西藏沙棘內(nèi)基因表達(dá)量和功能兩方面的研究分析其在2 種沙棘中的適應(yīng)性分化及對海拔的響應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集青海省不同海拔梯度下長勢相同的肋果沙棘與西藏沙棘嫩葉作為研究材料，將沙棘嫩葉立即放入液氮進(jìn)行冷凍。試驗設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，采樣具體信息見表1。

表1 沙棘屬植物采集地信息Table 1 Collection information of Hippophae

1.2 數(shù)據(jù)來源

Phytozome 數(shù) 據(jù) 庫（https：//phytozome.jgj.doe.gov/pz/portal.html）；NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；TAIR 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidop?sis.org/index.jsp）；Picea abies 數(shù)據(jù)庫（https：//conge?nie.org/）［9］（見表2）。

表2 植物系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)鍵節(jié)點物種蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)來源Table 2 Sources of protein sequence data from the key nodes of the phylogenetic tree of plants

1.2 方法

1.2.1 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)及正選擇基因的篩選

采用RNA plant Plus 試劑分別提取不同海拔梯度下的肋果沙棘和西藏沙棘新鮮嫩葉總RNA，基于二代測序技術(shù)中的Illumina 平臺對不同海拔下的2 種沙棘進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。篩選2 種沙棘中正選擇作用基因：基于OrthoMCL 找出的直系同源基因?qū)?，用paml-codeml 計算Ka/Ks 值（即ω），ω＞0.5 即受到正選擇作用的基因［14］，選擇受正選擇作用的轉(zhuǎn)錄因子bHLH94基因為目的基因。

1.2.2 2種沙棘bHLH94基因克隆

PCR 擴增目的基因：利用Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒對樣品總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA 樣品。PCR 反應(yīng)總體 系25.0 μL：cDNA 為1.0 μL，2×EasyTaqPCR Master Mix 為12.5 μL，正 反 向 引 物 各1.0 μL，ddH2O 為9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性40 s；98 ℃變性10 s；50 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)，引物序列見表3。將擴增結(jié)果用Sanger 法測序并利用Chromas 軟件分析測序結(jié)果并導(dǎo)出［9］。

表3 PCR和qRT-PCR所用引物Table 3 Primers used in PCR and qRT-PCR

1.2.3 熒光定量PCR驗證基因表達(dá)量

根據(jù)所獲得的肋果沙棘和西藏沙棘bHLH94基因序列，設(shè)計熒光定量專用引物，將反轉(zhuǎn)錄得到的所有樣品cDNA 稀釋為50 ng·μL-1，并以此為模板，按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行熒光定量試驗。反應(yīng)總體系20.0 μL：cDNA 為2.0 μL，上下游引物各為0.8 μL，ddH2O 為6.0 μL，TB Green Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）為10.0 μL，ROX Refer?ence Dye 為0.4 μL。反應(yīng)在ABI PRISM 7500 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火34 s；40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計算HnbHLH94和Htb?HLH94基因的相對變量值，內(nèi)參基因為鼠李沙棘actin基因［15］。肋果沙棘、西藏沙棘及內(nèi)參基因ac?tin的熒光定量引物序列見表3。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析：選擇同源性最高且e值最小的BLAST 結(jié)果，用DNAstar 軟件中的Editseq 和Se?qbuilder 程序截取目的基因CDS 區(qū)并翻譯為氨基酸序列［9］。利用ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）工具分析蛋白質(zhì)的分子量、等電點、親疏水性等基本理化性質(zhì)。利用PSORT（https：//psort.hgc.jp/）預(yù)測蛋白質(zhì)的核定位信號。利用TMHMM sever 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ser?vices/TMHMM-2.0/）和SignalP 5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽。將氨基酸序列提交到Zhanglab 網(wǎng)站的I-TASSER（http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ITASSER）進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并用VMD 可視化軟件分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

直系同源基因篩選：在Windows 系統(tǒng)下進(jìn)行本地BLAST 抽提13 個位于植物系統(tǒng)進(jìn)化樹上的關(guān)鍵節(jié)點物種bHLH94轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白序列，過濾條件為e＜10-6。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)及正選擇基因篩選

通過轉(zhuǎn)錄組測序共獲得190.01 Gb 的clean bases，各樣品的GC 含量均在41%以上，Q30堿基比例均大于91%，表明轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)量豐富、質(zhì)量較高。數(shù)據(jù)組裝后，共獲得1 561 185 條unigene，其中長度在1 kb 以上的unigene 有133 402 條（見表4）。paml 計算沙棘屬植物轉(zhuǎn)錄因子bHLH94基因ω值為0.75 679，表明2 種沙棘在適應(yīng)高海拔環(huán)境的分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子bHLH94基因受到正選擇作用。

表4 2種沙棘unigenes組裝結(jié)果統(tǒng)計Table 4 Statistics of the assembly results of unigenes of H.neurocarpa and H.tibetana

2.2 bHLH94基因在2種沙棘中的克隆

PCR 擴增HnbHLH94和HtbHLH94基因，利用Sanger 測序?qū)Χ鷾y序結(jié)果進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HnbHLH94基因Sanger 測序結(jié)果和二代測序結(jié)果在565～575 位點和第597、885 位點堿基存在差異，HtbHLH94基因Sanger測序結(jié)果和二代測序結(jié)果在第867 位點堿基存在差異。以Sanger 測序結(jié)果為準(zhǔn)，利用DNAstar 軟件中的Seqbuilder 與Editseq 程序獲得HnbHLH94和HtbHLH94基因的CDS 區(qū)。HnbHLH94基因的CDS 區(qū)全長1 017 bp，共編碼338個氨基酸。HtbHLH94基因的CDS區(qū)全長1 008 bp，共編碼335個氨基酸。

圖1 HnbHLH94和HtbHLH94基因二代測序序列和Sanger測序結(jié)果比對紅色框為Sanger測序結(jié)果與二代測序結(jié)果的差異堿基位點Fig.1 HnbHLH94 and HtbHLH94 next-generation sequencing sequence was compared with the Sanger sequencing results The difference between the Sanger sequencing results and the next-generation sequencing results in red boxes

2.3 2種沙棘bHLH94蛋白及擬南芥同源蛋白序列比對

HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白序列比對，二者存在10 個非同義突變位點。利用NCBI 網(wǎng)站的BLASTX 程序查找HnbHLH94基因和HtbHLH94基因的同源蛋白質(zhì)序列，發(fā)現(xiàn)二者均與Carya illinoi?nensis的假設(shè)蛋白序列相似性最高，E 值分別為2E-125、2E-123，序列覆蓋度分別為76%、70%。Hnb?HLH94 和HtbHLH94 蛋白與鼠李科Ziziphus jujuba的bHLH94 蛋白相似度也很高，E 值分別為1E-69、1E-66，序列覆蓋度分別為76%、70%。利用本地BLAST 檢索擬南芥中與HnbHLH94、HtbHLH94 同源的蛋白序列，選擇同源性最高且E值最小的ATb?HLH94和ATbHLH96蛋白，NCBI 和pfam 等網(wǎng)站預(yù)測HnbHLH94、HtbHLH94 及擬南芥ATbHLH94、ATbHLH96轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該類轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活域缺失，只有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如圖2所示，沙棘屬HnbHLH94、HtbHLH94和擬南芥ATbHLH94、ATbHLH96轉(zhuǎn)錄因子DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域存在3 個氨基酸差異位點，其他位點均一致，說明bHLH94轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域非常保守。

圖2 HnbHLH94、HtbHLH94及擬南芥的bHLH94、bHLH96蛋白氨基酸序列紅色框為HnbHLH94與HtbHLH94蛋白氨基酸差異位點Fig.2 Amino acid sequence of bHLH94 and bHLH96 in Arabidopsis thaliana and HnbHLH94 and HtbHLH94 Differential amino acid sites of HnbHLH94 and HtbHLH94 in red boxes

2.4 HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

基于NCBI 和Phytozome 等網(wǎng)站，下載植物系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)鍵節(jié)點的13 個陸生植物蛋白序列數(shù)據(jù)。本地BLAST結(jié)果顯示，藻類植物Chlamydomo?nas reinhardtii和裸子植物Picea abies中沒有bHLH94基因的同源蛋白質(zhì)。將其他11 個物種中共得到13 條同源蛋白質(zhì)序列與本研究中的Hnb?HLH94 和HtbHLH94 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。分析得到，該基因在物種進(jìn)化過程中相對保守。

圖3 最大似然法構(gòu)建bHLH94蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹該系統(tǒng)進(jìn)化樹中支持率小于50的均未顯示Fig.3 Phylogenetic tree for bHLH94 proteins by Maximum likelihood method The support rate of less than 50 is not shown in this phylogenetic tree

2.5 HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測及理化性質(zhì)分析

Zhanglab 網(wǎng) 站I-TASSER 進(jìn) 行HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并用VMD 軟件分析HnbHLH94和HtbHLH94蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白的α螺旋、β折疊等空間結(jié)構(gòu)特征基本相同，二者三級結(jié)構(gòu)高度相似。ProtParam 網(wǎng)站分析HnbHLH94 和HtbHLH94理化性質(zhì)，得到HnbHLH94和HtbHLH94的分子式分別為：C1677H2640N474O536S17，C1678H2633N475O533S16；分子質(zhì)量分別為：38 563.28、38 502.19；等電點分別為：5.25、5.41；利用ProtScale 網(wǎng)站分析HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白的親疏水性，二者均為親水蛋白。PSORT 網(wǎng)站分析HnbHLH94 和HtbHLH94 在細(xì)胞中的定位，結(jié)果顯示二者均位于細(xì)胞核內(nèi)。TMHMM sever 2.0 和SignalP 5.0 分 析 發(fā) 現(xiàn)Hnb?HLH94 和HtbHLH94 沒有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽，說明二者不屬于分泌蛋白。

2.6 bHLH94基因在2種沙棘中的表達(dá)量分析

圖4 bHLH94蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測綠色部分為DNA binding domain；A.HnbHLH94 蛋白三級結(jié)構(gòu)Surf模型，B.HtbHLH94蛋白三級結(jié)構(gòu)Surf模型Fig.4 Predicted results of the tertiary structure of bHLH94 protein The green part is DNA binding domain；A.Surf model of tertiary struc?ture of HnbHLH94 protein；B.Surf model of tertiary structure of Htb?HLH94 protein

FPKM 同時考慮了測序深度和基因長度對fragments 計數(shù)的影響，是目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法。在本研究中，通過二代測序，將readcount數(shù)進(jìn)行FPKM 轉(zhuǎn)換，以FPKM 值來表示基因的表達(dá)量水平［9］。bHLH94基因在肋果沙棘和西藏沙棘的FPKM 均值分別為1.780、9.493。用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件對HnbHLH94和HtbHLH94基因FP?KM 值進(jìn)行單因素方差分析，二者FPKM 值差異顯著（P＜0.05）。以海拔為橫坐標(biāo)，F(xiàn)PKM 值為縱坐標(biāo)對HnbHLH94和HtbHLH94基因FPKM 值作線性回歸分析，結(jié)果顯示，HnbHLH94基因的FPKM 值隨著海拔的升高而減小，R2值為0.5027。Htb?HLH94基因的FPKM 值隨著海拔的升高而增大，R2值為0.998 6。實時熒光定量PCR的結(jié)果表明，Hn?bHLH94基因表達(dá)量隨著海拔的升高呈現(xiàn)下降趨勢，HtbHLH94基因表達(dá)量隨著海拔的升高呈現(xiàn)上升趨勢，這與HnbHLH94和HtbHLH94基因FPKM值隨海拔升高所表現(xiàn)的趨勢一致。

3 討論

3.1 bHLH94 基因在2 種沙棘中的序列結(jié)構(gòu)及在陸生植物中的系統(tǒng)進(jìn)化

圖5 HnbHLH94和HtbHLH94不同海拔下的FPKM 值Fig.5 FPKM values of HnbHLH94 and HtbHLH94 at different altitudes

圖6 基于qRT-PCR 技術(shù)檢測HtbHLH94 和HnbHLH94在不同海拔下的基因表達(dá)量a，b 代表不同海拔下兩個物種bHLH94 基因表達(dá)量的差異顯著性（P<0.05）Fig.6 Gene expression at different altitudes of HnbHLH94 and HtbHLH94 based on the qRTPCR technology a，b represents the significant difference in bHLH94 gene expression between the two species at different altitude（sP<0.05）

植物為了適應(yīng)高海拔低溫、強輻射等極端環(huán)境，不僅在結(jié)構(gòu)和生理功能上表現(xiàn)出獨特的適應(yīng)性，還基于一系列基因的進(jìn)化來響應(yīng)逆境脅迫［9］。本研究對肋果沙棘HnbHLH94基因和西藏沙棘Ht?bHLH94基因的堿基序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)有多個堿基突變位點，且二者DNA 結(jié)構(gòu)域之外存在10 個非同義突變位點，推測這可能會造成HnbHLH94 和HtbHLH94蛋白二聚體存在差異，目前尚不清楚這10 個非同義突變位點對海拔的適應(yīng)性有無貢獻(xiàn)。生物信息學(xué)分析表明，HnbHLH94和HtbHLH94基因 分 別 編 碼338 和335 個 氨 基 酸，HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白沒有轉(zhuǎn)錄激活域，只有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。Murre等學(xué)者將bHLH轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)結(jié)構(gòu)域劃分為Ⅰ～Ⅶ七類，其中第Ⅳ類為MAD和MAX，這類轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活域缺失，只有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與MYC 二聚并調(diào)節(jié)其活性［3］，這與本研究的HnbHLH94 和HtbHLH94 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相似。雖然沒有轉(zhuǎn)錄激活域，但是MAD/MAX能相互形成同源或異源二聚體，以不同的方式影響轉(zhuǎn)錄途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖及程序性死亡［16］。推測HnbHLH94和HtbHLH94 轉(zhuǎn)錄因子也有類似的二聚體形成途徑。

進(jìn)一步將HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白序列與植物系統(tǒng)進(jìn)化樹關(guān)鍵節(jié)點上的13個物種同源蛋白序列進(jìn)行比對，其中在衣藻科的Chlamydomo?nas reinhardtii和歐洲云杉（Picea abies）中未發(fā)現(xiàn)bHLH94 的同源蛋白，將其他11 個陸生植物中找到的bHLH94 同源蛋白與HnbHLH94、HtbHLH94蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域五個氨基酸殘基（His-5，Glu-9，Arg-10，Arg-12 和Arg-13）形成了堿性部位，且該堿性部位的亮氨酸（Leu-23）非常保守，表明該殘基對促進(jìn)bHLH 蛋白二聚體的形成非常重要，這與以往研究結(jié)果一致［1］。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子通過其bHLH 結(jié)構(gòu)域相互作用形成同源或異源二聚體，然后通過二聚體中的保守堿性區(qū)域與特定的DNA序列進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)［17］。推測，本研究中，Hnb?HLH94 和HtbHLH94 蛋白形成二聚體后結(jié)合相同的DNA 序列從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明，藻類中的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子非常少，而大量的bHLH轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)于苔蘚和維管植物分化之前的陸生植物中，并推測bHLH蛋白多樣化與植物登陸對干旱環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)［18］。本研究在顫藻屬的Oscilla?toria acuminate、小球藻屬的Chlorella variabilis和紫菜（Neoporphyra haitanensis）等藻類植物均未發(fā)現(xiàn)bHLH94 轉(zhuǎn)錄因子的同源蛋白序列。這與Pires等學(xué)者研究結(jié)果［18］一致。而在銀杏（Ginkgo bi?loba）、買麻藤（Gnetum montanum）和蘇鐵（Cycas revoluta）等裸子植物中也未發(fā)現(xiàn)bHLH94 轉(zhuǎn)錄因子的同源蛋白序列。初步判斷，bHLH94轉(zhuǎn)錄因子在裸子植物中丟失，且該蛋白響應(yīng)干旱脅迫。

3.2 2 種沙棘中bHLH94 基因的表達(dá)對高海拔環(huán)境的響應(yīng)機制

3.2.1 bHLH94 基因可能參與2 種沙棘干旱脅迫途徑

HnbHLH94 和HtbHLH94 蛋白與擬南芥Atb?HLH94 和AtbHLH96 蛋白高度同源，可能與Atb?HLH94 和AtbHLH96 蛋白具有相似的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)AtbHLH94 和AtbHLH96 蛋白屬于擬南芥bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族中的Ia 類，該類轉(zhuǎn)錄因子主要參與植物氣孔發(fā)育機制［19］。bHLH94基因在肋果沙棘和西藏沙棘中參與氣孔發(fā)育合成途徑。研究表明，胡楊（Populus euphratica）中，Peb?HLH35基因通過調(diào)節(jié)氣孔發(fā)育和光合作用提高其對干旱脅迫的耐受性［20］。蘋果MdbHLH130基因通過維持活性氧（ROS）穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉提高植物耐旱性［21］。擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中bHLH122基因過表達(dá)，抑制脫落酸（ABA）的分解代謝，從而提高植物對干旱脅迫的耐受性［7］。當(dāng)氣候變冷時，通常伴隨大范圍的干旱，只有冰雪融化時，才能給生長在我國西北干旱半干旱地區(qū)的沙棘屬植物提供所需水分［22-23］。當(dāng)青藏高原迎來階段性干旱時，bHLH94基因可能參與肋果沙棘和西藏沙棘對干旱環(huán)境的脅迫響應(yīng)途徑。

3.2.2 bHLH94 基因可能在2 種沙棘耐冷機制中扮演重要角色

bHLH 轉(zhuǎn)錄因子在植物對寒冷脅迫的響應(yīng)中起積極作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsbHLH1基因參與植物冷脅迫信號通路，其過表達(dá)顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥冷脅迫的耐受性［25］。煙草（Nicotiana tabacum）中，NtbHLH123基因過表達(dá)，降低了丙二醛含量、H2O2和活性氧（ROS）的積累，有助于緩解冷脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞膜的氧化損傷［26］。山葡萄（Vitis amurensis）VabHLH1和葡萄（Vitis vinifera）VvbHLH1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)，激活CBF（C-重復(fù)結(jié)合因子）冷信號通路，增強其對寒冷的耐受性［27］。生長在青藏高原的沙棘屬植物常面臨低溫脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，不同品種沙棘的抗寒能力具有差異，但抗寒響應(yīng)機制相同［22］。推測bHLH94基因在肋果沙棘和西藏沙棘中可能參與低溫脅迫響應(yīng)途徑。

3.2.3 bHLH94 基因可能參與2 種沙棘對輻射的響應(yīng)途徑

輻射是高原植物必須應(yīng)對的脅迫之一，海拔越高輻射越強，強烈的輻射會造成植物DNA、RNA及蛋白質(zhì)損傷。當(dāng)高原植物受到紫外輻射后，體內(nèi)積累大量的黃酮類化合物，以此來減少輻射對核酸、蛋白等大分子的破壞［28］。Wang 等研究表明bHLH 轉(zhuǎn)錄因子Ascl1基因過表達(dá)，激活基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）和甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），增強DNA 的損傷修復(fù)水平［29］。Pablo 等學(xué)者研究表明UV-B 輻射可顯著提高葡萄果皮黃酮醇的積累，并鑒定3 個響應(yīng)UV 輻射的bHLH基因［30］。龍血樹DcbHLH2、DcbHLH5和DcbHLH56基因參與類黃酮的生物合成，DcbHLH5和黃酮類合成相關(guān)基因在UV 輻射條件下共表達(dá)［6］。本研究中，肋果沙棘和西藏沙棘響應(yīng)高海拔輻射脅迫時，bHLH94基因可能參與DNA 損傷修復(fù)機制，也可能與黃酮類化合物的合成機制有關(guān)。

3.2.4 2 種沙棘中bHLH94 基因?qū)０蔚倪m應(yīng)機制

大量研究表明，植物在應(yīng)對干旱、低溫及高輻射等極端環(huán)境時，bHLH基因發(fā)揮著重要作用。肋果沙棘和西藏沙棘在適應(yīng)青藏高原極端多變的環(huán)境時，bHLH94基因可能參與高海拔伴隨的干旱、低溫及強輻射等脅迫途徑。西藏沙棘海拔分布上限顯著高于肋果沙棘?；谛螒B(tài)及生理等特征的研究，肋果沙棘較原始，西藏沙棘更進(jìn)化，且二者適應(yīng)海拔的機制不同［10，13］。本研究發(fā)現(xiàn)肋果沙棘HnbHLH94基因和西藏沙棘HtbHLH94基因的FP?KM 值差異顯著（P＜0.05），HnbHLH94基因FPKM值隨著海拔的升高而減小，而HtbHLH94基因的FPKM 值隨著海拔的升高而增大。可見，相比于肋果沙棘，西藏沙棘通過上調(diào)HtbHLH94基因來適應(yīng)更高海拔伴隨的干旱、冷凍及強輻射環(huán)境。

綜上所述，本研究從序列結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控兩個方面分析了受環(huán)境選擇的轉(zhuǎn)錄因子bHLH94功能基因在肋果沙棘和西藏沙棘中對高海拔環(huán)境適應(yīng)機制的異同，為沙棘屬植物適應(yīng)海拔的分化機制及逆境響應(yīng)相關(guān)基因的開發(fā)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。