納米仿生技術(shù)在動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用研究進(jìn)展

楊詠琪,李洪亮,梁景巖

(揚(yáng)州大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,江蘇 揚(yáng)州,225001)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，然而他汀類藥物治療往往會(huì)對(duì)健康組織產(chǎn)生副作用，支架置入后也會(huì)產(chǎn)生再狹窄、炎癥、血栓等[1]。動(dòng)脈搭橋手術(shù)易引起并發(fā)癥且康復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)[2]。納米技術(shù)在靶向性、免疫原性、生物相容性等方面體現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，同時(shí)生物體的特有功能與納米技術(shù)密切相關(guān)，于是開啟了從宏觀設(shè)計(jì)向微觀分子排列跨越的納米仿生技術(shù)大門[3]。本研究從生物膜涂層、蛋白載體、仿生人造血管、仿生納米機(jī)器人4個(gè)方面闡述納米仿生技術(shù)在AS中的研究進(jìn)展，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 生物膜涂層

細(xì)胞膜或類細(xì)胞膜涂層技術(shù)近年來備受研究者關(guān)注，其沒有傳統(tǒng)修飾的冗雜過程且可循環(huán)運(yùn)用，細(xì)胞膜涂層的納米仿生顆粒是由內(nèi)層納米顆粒核和外層生物膜殼組成的核殼結(jié)構(gòu)[4]。不同細(xì)胞膜表面含有特定蛋白質(zhì)、多聚糖、脂質(zhì)層等，這賦予了納米顆粒多樣化的生物功能和廣泛化的應(yīng)用范圍。目前廣泛運(yùn)用于AS靶向治療的細(xì)胞膜來源有紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板、干細(xì)胞等，2種及以上的雜交膜可同時(shí)具備逃避免疫清除、延長(zhǎng)機(jī)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間和提高靶向性等多重功能，執(zhí)行更為復(fù)雜的任務(wù)。

1.1 RBC膜

RBC是血液中數(shù)量最多的細(xì)胞，于血液中壽命可達(dá)120 d。因此,RBC涂層技術(shù)所需的細(xì)胞膜來源豐富且于體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)。研究[5]表明，包裹了RBC膜的納米顆粒循環(huán)半衰期可長(zhǎng)約40 h,機(jī)制在于RBC膜表面的CD47與免疫受體SIRP-α可互相識(shí)別從而抑制巨噬細(xì)胞對(duì)RBC的吞噬作用。2019年WANG Y等[6]首次嘗試將RBC膜包裹在納米藥物雷帕霉素 (RAP)@聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)上，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病動(dòng)物模型進(jìn)行治療。此納米仿生療法靶向AS病變部位的藥物聚集量是一般納米藥物的2倍，治療效果是普通納米藥物的3倍，裸藥的6倍。鐘元[7]用RBC膜包裹的RBC@多西他賽(DTX)/靶向多肽(CR8)可主動(dòng)靶向炎性內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)過1個(gè)月的治療后，小鼠主動(dòng)脈斑塊面積減少至3.5%,壞死區(qū)域減小，易損斑塊穩(wěn)定性提高且長(zhǎng)期服用沒有任何毒副作用。紅細(xì)胞膜的“偽裝”降低了血液中免疫細(xì)胞對(duì)納米藥物的吞噬作用，增加了斑塊區(qū)域納米藥物的累積，實(shí)現(xiàn)了用藥的精準(zhǔn)、有效、安全。

1.2 炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞膜

AS是一種炎癥性疾病，大量的炎癥細(xì)胞被募集參與其發(fā)生發(fā)展過程。鑒于此,WU G H等[8]利用WBC膜包裹超順磁性良好的磁性納米簇(MNCs),然后依次嵌入抗炎藥物辛伐他汀(ST)和修飾靶向性載脂蛋白A-I模擬肽L-4F(AP)。由于WBC膜表面有CD45、CD3z等免疫標(biāo)記分子，制備的MNC@M-ST/AP可逃避免疫蛋白的吸附，在AS早期靶向移行內(nèi)膜泡沫細(xì)胞，遞送藥物減輕炎癥和氧化應(yīng)激，有顯著的抗AS作用。

中性粒細(xì)胞在白細(xì)胞中占比最高。腦缺血時(shí)，由于炎癥細(xì)胞因子對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨向性，中性粒細(xì)胞不受血流影響就可穿過血腦屏障(BBB)浸潤(rùn)腦缺血損傷區(qū)，與病變細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換。同時(shí)搭配與中性粒細(xì)胞高效率結(jié)合的納米藥物，可治療如腦缺血等炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[9]。這種基于炎癥因子自主引導(dǎo)藥物遞送的思路，對(duì)于運(yùn)用中性粒細(xì)胞膜涂層技術(shù)干預(yù)AS炎癥反應(yīng)具有重要意義。

巨噬細(xì)胞膜上高表達(dá)的整合素α4β1可以和血管內(nèi)皮黏附因子-1(VCAM-1)特異性結(jié)合。鑒于此,WANG Y等[10]將巨噬細(xì)胞膜包裹在納米藥物上，構(gòu)建了納米仿生藥物巨噬細(xì)胞膜/雷帕霉素納米粒MM/RAPNPs。該納米仿生藥物通過抑制巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖從而安全有效地抑制了AS發(fā)展，同時(shí)生物相容性良好的特性可使其成為慢性血管疾病的長(zhǎng)期治療藥物。與此同時(shí),GAO C等[11]首次將巨噬細(xì)胞膜包裹的活性氧(ROS)響應(yīng)性仿生納米制劑和吞噬藥物載體的活細(xì)胞制劑針對(duì)AS療效進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果表明仿生納米制劑可在避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除的同時(shí)，吸附斑塊中的炎癥因子抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，吞噬藥物載體的巨噬細(xì)胞制劑在斑塊炎癥環(huán)境中會(huì)啟動(dòng)促炎機(jī)制，抗炎效果不佳。這對(duì)于后續(xù)選擇有效治療AS的合適劑型給予了指導(dǎo)。

1.3 血小板膜

血小板貫穿整個(gè)AS發(fā)生發(fā)展過程。當(dāng)血管內(nèi)皮功能發(fā)生障礙時(shí)，血小板隨即被激活，靶向黏附在血管損傷處，緊接著募集炎癥細(xì)胞于此，后期斑塊破裂不斷放大血小板的聚集效應(yīng)，最終引發(fā)血栓導(dǎo)致梗死。運(yùn)用血小板膜涂層技術(shù)或者將膠原受體[12]、糖蛋白受體和vWF受體修飾納米顆粒，均可使納米顆粒靶向聚集于損傷血管壁，同時(shí)搭載藥物可減緩AS發(fā)展進(jìn)程和支架后的促內(nèi)皮化。此外，還可將磁共振造影劑修飾在血小板膜包裹的納米顆粒表面，給藥1h即可形成顯著陽(yáng)性對(duì)比增強(qiáng)效應(yīng)，觀察到主動(dòng)脈弓處縱向弛豫時(shí)間(T1)顯影，有利于實(shí)時(shí)追蹤AS的動(dòng)態(tài)變化[13]。

1.4 干細(xì)胞膜

干細(xì)胞區(qū)別于其他細(xì)胞，擁有無限自我更新與定向分化的獨(dú)特能力，多用于血管疾病的內(nèi)源性靶向修復(fù)。如TANG J N等[14]利用干細(xì)胞膜包裹載有干細(xì)胞分泌因子的納米顆粒，研究證明在心肌梗死后，該人工細(xì)胞模擬微粒能直接與心臟組織結(jié)合并促其生長(zhǎng)，靶向修復(fù)了AS所致的心肌損傷。此外，臨床試驗(yàn)證明間充質(zhì)干細(xì)胞通過免疫調(diào)節(jié)可抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)釋放生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)因子內(nèi)源性修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞，患者神經(jīng)功能得到恢復(fù)，這為運(yùn)用干細(xì)胞膜涂層技術(shù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了可能[15]。

1.5 外泌體

外泌體是一種可由多種活細(xì)胞分泌的直徑為40～150 nm的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，參與傳遞細(xì)胞間的通訊信息，同時(shí)內(nèi)部可包裹納米顆?；騺碜灶愅醇?xì)胞的遺傳物質(zhì)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子。低免疫原性、高靶向性、低毒性以及可穿越血腦屏障(BBB)等使其成為熱點(diǎn)生物標(biāo)記物和納米藥物載體[16]。

近年來，外泌體作為AS等血管疾病的潛在治療工具受到廣泛研究，可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、血管平滑肌增殖分化、血小板與巨噬細(xì)胞的活化、血管鈣化等影響AS發(fā)展進(jìn)程。為降低人力和時(shí)間成本，越來越多的研究旨在開發(fā)一種采用自上而下、自下而上或生物雜交策略的人工外泌體。已有研究團(tuán)隊(duì)制備出一種天然與合成材料相結(jié)合的“半人工模擬外泌體”，在結(jié)構(gòu)和功能上精確模仿天然外泌體的同時(shí)，產(chǎn)量將近500倍[17]。

此基礎(chǔ)上將不同細(xì)胞分泌的外泌體封裝納米顆粒，可構(gòu)建成外泌體-納米仿生遞藥系統(tǒng)。如采用電穿孔技術(shù)[18]將戊氨基酮戊酸己酯鹽酸鹽(HAL)載入M2型巨噬細(xì)胞衍生的外泌體(M2 Exo)中,M2 Exo表面的趨化因子受體和抗炎因子體現(xiàn)出了良好的炎癥區(qū)域靶向性和抗炎性，包裹的HAL經(jīng)過代謝和生物合成可產(chǎn)生一氧化碳和膽紅素，進(jìn)一步加強(qiáng)了抗炎作用，有利于緩解AS發(fā)展進(jìn)程。同時(shí)，內(nèi)源性代謝生成的中間體原卟啉IX(PpIX)可用于AS的熒光成像。因此，外泌體-納米仿生遞藥系統(tǒng)拓寬了從外泌體角度診治AS的思路。

2 蛋白載體

目前，具有穩(wěn)定性、良好生物相容性、制備簡(jiǎn)易性等優(yōu)勢(shì)的蛋白類納米仿生材料被用于合成醫(yī)學(xué)影像造影劑和納米載體藥物，實(shí)現(xiàn)深層組織的檢測(cè)診斷和靶向治療。成像方面，以蛋白為生物模板，利用仿生生物礦化原理，制備出的納米仿生無機(jī)復(fù)合材料較傳統(tǒng)造影劑對(duì)比度顯著增強(qiáng);治療方面，鑒于仿生核殼結(jié)構(gòu)自組裝的以蛋白為載體的納米顆粒，可躲避免疫系統(tǒng)的吞噬。應(yīng)用于診療AS的主要蛋白種類有脂蛋白與白蛋白，尤其是高密度脂蛋白(HDL)和牛血清白蛋白(BSA)較廣泛。

2.1 重組高密度脂蛋白(rHDL)

直徑5～12 nm的小顆粒HDL可自由進(jìn)出動(dòng)脈管壁，通過經(jīng)典的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇途徑能消退斑塊達(dá)到抗AS的作用，同時(shí)還具有抗氧化、抗炎及激活一氧化氮合酶等生物學(xué)功能[19]。但HDL制劑僅來源于成本高昂的血漿,rHDL與HDL組分相似，模仿了人類內(nèi)源性高密度脂蛋白生物學(xué)功能，可轉(zhuǎn)運(yùn)疏水藥物且生物相容性良好、體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、易大規(guī)模生產(chǎn)，是一個(gè)理想化的載藥體[20]。

然而，人類遺傳學(xué)和隨機(jī)臨床試驗(yàn)[21]表明，單純性地升高血液中的HDL不能起到抗動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)的作用且阻礙血管再生。約占70%HDL蛋白成分的載脂蛋白A-I(ApoA-I)同樣保留了促膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)和抗AS等生物學(xué)功能[22]。rHDL可基于 ApoA-Ⅰ α螺旋和重組ApoA-Ⅰ研發(fā)。其中，基于 ApoA-Ⅰα螺旋研發(fā)的模擬肽如5A、6F以及雙螺旋復(fù)合物ETC-642，具有促進(jìn)膽固醇外排、抗炎和抑制斑塊形成的顯著作用[23-24]?；谥亟MApoA-Ⅰ研發(fā)的ApoA-Ⅰ Milano同樣具有穩(wěn)定斑塊的作用，但由此研發(fā)的復(fù)合物ETC-216在臨床試驗(yàn)中產(chǎn)生了嚴(yán)重的免疫刺激副作用。DUIVENVOORDEN R 等[25]將造影劑釓和近紅外染料共標(biāo)記的圓盤狀他汀類重組高密度脂蛋白(S-rHDL)靜脈注射APOE-/-小鼠模型，血管壁的核磁信號(hào)和紅外成像表明該納米仿生顆粒主動(dòng)靶向聚集于主動(dòng)脈斑塊區(qū)域且直接作用于巨噬細(xì)胞，同時(shí)包裹的藥物他汀得以充分發(fā)揮抗炎作用。結(jié)果表明，無論是短期高劑量還是長(zhǎng)期低劑量注射S-rHDL,均具有良好的AS診療效果。

2.2 白蛋白自組裝

由于白蛋白水溶性和載藥率高、無毒性且體內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)，近年來興起了多種基于牛血清白蛋白(BSA)的自組裝納米仿生材料。同時(shí)研究[26]表明，血清白蛋白具有抗炎、抗氧化和抗凝血等生物功能，血清白蛋白水平與缺血性心臟病、血栓、腦卒中等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病有關(guān)。李祥[27]從分子層面設(shè)計(jì)了2種基于BSA的自組裝納米仿生材料，首先構(gòu)建以BSA為載體的光聲分子探針BSA-Cy-Mito,這種探針提高了監(jiān)測(cè)氧化應(yīng)激、炎癥過程和斑塊穩(wěn)定性的特異性、靈敏性，其次合成一種由巨噬細(xì)胞膜包裹的白蛋白姜黃素納米仿生藥物(MC-BSA-Cur),該藥物靶向聚集于易損斑塊處，具有顯著抗炎、抗氧化作用。因此,BSA憑借生物相容性好、包裹能力強(qiáng)、水溶性高、易吸收等特點(diǎn)可在分子水平上合成造影劑、納米藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)活體組織深部斑塊的精準(zhǔn)診療。

3 仿生人造血管(支架)

AS后期，老化和破損的血管急需移植替換，然而異體血管移植會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，自體移植存在血管長(zhǎng)度、大小不適配問題。模擬天然血管結(jié)構(gòu)和功能的仿生人工血管不僅形狀可控、血液相容性高、長(zhǎng)期安全有效，解決了不足4 mm小直徑人造血管帶來的血流速慢、剪切力弱、血壓低等問題，還可用于模擬建立體內(nèi)血管模型研究血管結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、新藥測(cè)試等[28]。目前，制備仿生人造血管的常用方法有靜電紡絲技術(shù)和3D生物打印技術(shù)。

3.1 靜電紡絲技術(shù)

運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)制備的人造血管纖維達(dá)到了納米級(jí)，多孔且表面積高，有利于細(xì)胞的黏附、增殖和組織的長(zhǎng)入，同時(shí)具有良好的力學(xué)和機(jī)械性能。鑒于此種技術(shù),LIU K 等[29]制備了由PLA/PCL/PU 3層納米纖維構(gòu)成的仿生人造血管，內(nèi)層有利于內(nèi)皮細(xì)胞的黏附;中層表現(xiàn)出了良好的機(jī)械性能;外層有利于平滑肌的排列，保證了良好的生物相容性和力學(xué)性能。在靜電紡絲技術(shù)的基礎(chǔ)上,CHENG S等[30]同時(shí)使用微流控技術(shù)模擬血管中的排布結(jié)構(gòu)，在纖維納米薄膜材料上種植內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞3種細(xì)胞，最終將二維的薄膜卷成含有細(xì)胞聚集體的三維人造血管，通過對(duì)兔子模型的血管移植觀察，該仿生人造血管對(duì)于機(jī)體無任何排斥反應(yīng)且具有同樣良好的力學(xué)性能。因此，靜電紡絲技術(shù)實(shí)現(xiàn)了移植物和天然血管的精準(zhǔn)匹配。

3.2 3D生物打印技術(shù)

納米3D打印技術(shù)近年來廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。較傳統(tǒng)打印技術(shù),3D生物打印技術(shù)的材料環(huán)保且?guī)缀鯇?duì)細(xì)胞無害。血管打印方面,3D生物打印技術(shù)采用連續(xù)纖維復(fù)合材料且同時(shí)包含了細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、生物材料支架三要素，從而精準(zhǔn)地仿造天然血管分級(jí)結(jié)構(gòu)和功能。仿生人造血管可用于構(gòu)建血管疾病模型，對(duì)復(fù)雜動(dòng)脈瘤進(jìn)行深層次的結(jié)構(gòu)與治療研究，或者移植入體內(nèi)[31]。然而材料高昂、打印速度慢及生物相容性差等一直以來都是生物組織工程在仿生人造血管中的難點(diǎn)[32]。ZHU W等[33]將醫(yī)學(xué)影像技術(shù)和計(jì)算機(jī)控制固化技術(shù)相結(jié)合，打印出來的人造血管血液循環(huán)正常、材料價(jià)格低廉且打印速度快，是一次突破性進(jìn)步。隨即而來的4D打印技術(shù)，模仿自然界生物含羞草的應(yīng)激形變?cè)?，利?D打印受到水、溫度或磁場(chǎng)等刺激時(shí)結(jié)構(gòu)或性能改變的原理，制造出可隨復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境變化而相應(yīng)變化的“活”的天然組織。

4 仿生納米機(jī)器人

仿生納米機(jī)器人是將納米技術(shù)與分子生物學(xué)相結(jié)合，參與細(xì)胞生命總過程的可編程分子機(jī)器人。仿生納米機(jī)器人具有養(yǎng)護(hù)血管的作用，當(dāng)易降解的納米機(jī)器人植入體內(nèi)后，巡邏到阻塞血液流動(dòng)的血栓，可在光源、磁場(chǎng)、超聲波等驅(qū)動(dòng)下精確地靶向遞送抗血小板、抗凝、擴(kuò)張血管等藥物，提前修復(fù)即將破裂的血管[34]。研究團(tuán)隊(duì)將L-精氨酸(LA)、β-珊瑚精和銅納米顆粒(Au NPs)三者共價(jià)結(jié)合，同時(shí)表面包被VCAM-1抗體，制備出一種一氧化氮(NO)和近紅外光(NIR)雙驅(qū)動(dòng)納米馬達(dá)機(jī)器人，當(dāng)納米機(jī)器人受到NIR照射時(shí)，通過Au NPs的光熱轉(zhuǎn)化，既能消融促炎巨噬細(xì)胞，又可被驅(qū)動(dòng)聚集到斑塊區(qū)域[35]。LA與斑塊中活性氧(ROS)生成的NO不僅能修復(fù)內(nèi)皮和降低氧化應(yīng)激水平，還能提供額外驅(qū)動(dòng)力。同時(shí)，β-珊瑚精溶解膽固醇從而有效減少斑塊的脂質(zhì)沉積。研究結(jié)果表明，該機(jī)器人能夠有效抗AS，為新型納米機(jī)器人的制備和AS的非藥物性治療提供新思路。加利福尼亞大學(xué)團(tuán)隊(duì)制備出一種人工材料硅制框架與天然鼠心肌細(xì)胞組成的納米機(jī)器人復(fù)合物，長(zhǎng)出的肌肉通過吸收溶液中的葡萄糖自主收縮與舒張從而帶動(dòng)硅制框架向前移動(dòng)，可推開動(dòng)脈中的脂肪沉積物從而恢復(fù)血管正常血流速度，這為研制納米機(jī)器人的動(dòng)力系統(tǒng)提供了思路[36]。此外，仿生納米機(jī)器人還可通過修復(fù)受損細(xì)胞或者割補(bǔ)、編輯相應(yīng)基因達(dá)到同樣的AS治療效果。

5 總結(jié)與展望

納米仿生技術(shù)在生物膜涂層、蛋白載體、仿生人造血管、仿生納米機(jī)器人等方面的研究對(duì)于AS的預(yù)防、診斷和治療有著重要意義，未來在動(dòng)脈粥樣硬化中的研究將逐漸增加且多樣，但應(yīng)用到臨床上仍面臨著諸多問題。其次，部分細(xì)胞供應(yīng)不充足，細(xì)胞膜提取技術(shù)復(fù)雜及過程中膜蛋白易變性或被污染，且膜上的部分蛋白作用并不能代表整體膜蛋白作用機(jī)制。再者，模擬肽、仿生人造血管、納米機(jī)器人等成本高昂，今后需增強(qiáng)不同學(xué)科間的合作與交流，應(yīng)用更多靶標(biāo)人群能承擔(dān)得起的材料。