呂擁芬，李 嬪

上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200062

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組常染色體隱性遺傳性疾病。其由于類固醇合成酶缺陷，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)多種類固醇激素合成不足，促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）升高，腎上腺皮質(zhì)增生，孕酮等前體物質(zhì)堆積而導(dǎo)致皮質(zhì)激素缺乏及繼發(fā)高雄激素等癥候群。21-羥化酶缺乏癥（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）導(dǎo)致的CAH 占90%～95%［1］。21-OHD 由編碼腎上腺類固醇21-羥化酶（P450c21）的CYP21A2基因變異引起。該酶將17-羥孕酮（17-hydroxyprogesterone，17-OHP）轉(zhuǎn)化為11-脫氧皮質(zhì)醇，將孕酮轉(zhuǎn)化為11-脫氧皮質(zhì)酮，這些產(chǎn)物是皮質(zhì)醇和醛固酮的前體。根據(jù)臨床表現(xiàn)、生化特征等，又可將21-OHD 導(dǎo)致的CAH 分為3 型：失鹽型（salt wasting，SW）、單純男性化型（simple virilizing，SV）和非經(jīng)典型CAH（nonclassic congenital adrenal hyperplasia，NCCAH）。SW 型和SV 型CAH 因具有顯著臨床特征以及生化特點(diǎn)，又稱為經(jīng)典型CAH。全球CAH 發(fā)病率為1/14 000～1/18 000［2］；美國非洲裔經(jīng)典型CAH 發(fā)病率低得多，在不同的研究中為1/25 000～1/42 000［3］。國內(nèi)報(bào)道的CAH發(fā)病率為1/16 466～1/12 200［4］。

目前，對于21-OHD 的診斷主要是通過臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢測。由于該病臨床譜帶廣，實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果受多種因素影響，易發(fā)生誤診或漏診。以17-OHP為例，其是21-OHD 新生兒篩查的一線指標(biāo)，檢測值受胎齡、出生體質(zhì)量、標(biāo)本采集時(shí)日齡及測定方法等因素影響，導(dǎo)致篩查結(jié)果有一定假陽性和假陰性率。而且，17-OHP 易受多種因素影響而波動(dòng)，如應(yīng)激、感染、服藥時(shí)間等，故不能單純根據(jù)17-OHP 濃度進(jìn)行疾病分型。2016 年以來，《先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥21-羥化酶缺陷診治共識》《先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥新生兒篩查共識》及《新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥篩查與診斷實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)專家共識》等相繼發(fā)表。這些共識都提到CAH 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是基因檢測，并建議常規(guī)開展，尤其對于臨床上疑似而實(shí)驗(yàn)室診斷困難，或診斷不明已予以糖皮質(zhì)激素治療者。當(dāng)其與其他疾病如21-OHD以外的CAH、先天性遺傳性腎上腺發(fā)育不良等進(jìn)行鑒別時(shí)，需行基因檢測助診。在先癥者及父母基因型明確的基礎(chǔ)上，基因檢測可為需要再生育的CAH 家庭提供產(chǎn)前診斷［5］。因此，分子檢測對于21-OHD 的診斷、鑒別診斷、治療、攜帶者檢測、遺傳咨詢等具有重要意義。鑒于以上共識中均未詳細(xì)提及21-OHD 基因變異的分子基礎(chǔ)，本文擬總結(jié)該病分子變異的致病形式、基因型與表型相關(guān)性、基因分型對治療及遺傳咨詢的指導(dǎo)，以期為臨床上21-OHD分子診斷提供參考。

1 21-OHD分子變異的致病形式

21-羥化酶由功能基因CYP21A2編碼，位于染色體6p21.3，長度3.3 kb，在人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）復(fù)合體Ⅲ內(nèi)；該區(qū)域基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在長度和拷貝數(shù)上有很大的變異性［6］。在CYP21A2基因約30 kb 處有一個(gè)非功能的假基因CYP21A1P。功能基因和假基因均含有10 個(gè)外顯子，外顯子和內(nèi)含子同源性分別達(dá)98%和96%。假基因CYP21A1P因存在小插入、缺失和點(diǎn)突變等多個(gè)致病變異而阻止了功能蛋白的合成。在CYP21A2和CYP21A1P基因附近有其他3個(gè)基因RP1、C4、TNXB以及2 個(gè)截短的假基因RP2和TNXA，共同構(gòu)成了RCCX 模塊（RP-C4-CYP21-TNX），并對應(yīng)著一個(gè)高度可變的約30 kb 的DNA 序列［7］。最常見的結(jié)構(gòu)形式是雙模塊，即串聯(lián)形成雙拷貝RCCX 模塊，帶有1個(gè)CYP21A1P假基因和1 個(gè)CYP21A2基因，其中基因從端粒到著絲粒的方向?yàn)镽P1-C4A-CYP21A1P-TNXARP2-C4B-CYP21A2-TNXB。也存在單RCCX 模塊、三RCCX 模塊和四RCCX 模塊。大多數(shù)三RCCX 模塊攜帶2 個(gè)CYP21A1P假基因和1 個(gè)CYP21A2基因，但也可能含有2個(gè)CYP21A2基因和1個(gè)CYP21A1P假基因，并且已經(jīng)在p.（Gln319*） 致病變異和CYP21A1P/CYP21A2基因嵌合的攜帶者中發(fā)現(xiàn)［8-9］。

由于真假基因序列的高度同源以及RCCX模塊的串聯(lián)重復(fù)，且處于重組活性很高的HLAⅢ區(qū)域，使得RCCX 模塊之間易于發(fā)生非等位基因同源重組，主要為不平衡交換和基因轉(zhuǎn)換。前者則可導(dǎo)致CYP21A2基因缺失、重復(fù)及形成嵌合基因，后者則導(dǎo)致真假基因間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)換，因此CYP21A2基因變異主要包括大的基因重排變異和小的來源于假基因轉(zhuǎn)換變異，非假基因來源的自發(fā)變異所占比例很少。在21-OHD 患者中，95%的致病變異是由于真假基因間重組所致。其中，75%是由于假基因上存在的變異通過有絲分裂時(shí)微轉(zhuǎn)化事件轉(zhuǎn)移至真基因而致?。?0］；20%～25%是由于減數(shù)分裂時(shí)非等位基因重組，不等交換而導(dǎo)致CYP21A2缺失或形成CYP21A1P/CYP21A2嵌合體。在CYP21A2基因中，只有不到5%的致病性變異不是由基因轉(zhuǎn)化引起的，可能不存在于假基因中［11］。1%～2%的變異來自CYP21A2基因的新發(fā)突變［12］。CAH也可以由單親二倍體引起，但非常罕見［13］。

2 21-OHD分子診斷策略

2.1 21-OHD基因型與表型的相關(guān)性

迄今為止，報(bào)道了21-OHD相關(guān)CYP21A2基因變異1 300余種，其中230種影響人類健康［14］。這230種致病變異中，156 種導(dǎo)致經(jīng)典型CAH，74 種導(dǎo)致NCCAH。19種變異位于該基因的非編碼區(qū)，其中4種影響啟動(dòng)子，包括c.-126C>T、c.-113G>A、c.-110T>C及c.-103A>G。據(jù)報(bào)道［15］，c-126C>T 引起NCCAH。230種變異中，153種是錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致各種形式的CAH，而無義和移碼變異通常導(dǎo)致經(jīng)典型CAH。

最常見的變異有10種［15］，包括大片段的基因缺失和轉(zhuǎn)換、8 種CYP21A2與CYP21A1P來源的點(diǎn)突變（p.P30L、I2G、p.I172N、E6 cluster、p.V281L、F306+T、p.Q318X、p.R356W）、外顯子3的p.G110fs（8個(gè)堿基丟失）。這10 種變異可以解釋大部分的臨床問題。有些變異不影響蛋白質(zhì)的合成，被認(rèn)為是多態(tài)性。如D183E 是一種不影響酶活性的基因轉(zhuǎn)換，也存在于CYP21A1P基因中；而其他如K102R、S268T和N493S等只存在于CYP21A2基因中。

總體來說，21-OHD 基因型和表型之間有良好的相關(guān)性。如大片段的基因缺失/轉(zhuǎn)換變異、p.Q318X、p.R356W、E6 cluster、Exon3 Del8bp 及I2G 與SW 型有關(guān)，導(dǎo)致殘存酶活性為0～1%，這些變異為嚴(yán)重致病變異；錯(cuò)義致病變異p.I172N 導(dǎo)致殘存酶活性為1%～2%，醛固酮合成接近正常，多與SV 型有關(guān)，為中間致病變異；第三組致病變異包括p.V281L、p.P30L、p.P453S、p.R339H、p.R369W、p.I230T 等導(dǎo)致殘存酶活性為20%～60%，多與NCCAH 相關(guān)，為輕度致病性變異。

由于大多數(shù)21-OHD 導(dǎo)致的CAH 患者是復(fù)合雜合子，經(jīng)典型患者攜帶2 個(gè)嚴(yán)重致病變異的等位基因，不攜帶輕度致病變異。NCCAH 患者可能攜帶2個(gè)輕度的致病變異（25%～50%），或1 個(gè)輕度和1 個(gè)嚴(yán)重致病變異（50%～75%）。嚴(yán)重致病變異致21-羥化酶活性<1%，但輕度致病變異可有部分酶的合成，活性最高可達(dá)正常的50%。有報(bào)道顯示，在NCCAH患者中，基因型為1 種輕度的致病變異和1 種嚴(yán)重的致病變異的患者，與2 個(gè)等位基因均為輕度致病變異的患者相比，其多毛程度和17-OHP 水平（基礎(chǔ)值和ACTH激發(fā)值）都增高［16-17］。

盡管基因型和表型之間有相對較高的一致性，但攜帶中間致病變異的患者有可變性。例如，IVS2-13（c.293-13A/C>G）和I172N［p.（Ile173Asn）］可導(dǎo)致不同程度的21-羥化酶活性受損。因此，通常被認(rèn)為是SV型的患者部分表現(xiàn)為失鹽，部分更接近NCCAH［18-19］。研究［20］顯示，P30L［p.（Pro31Leu）］與NCCAH及SV型CAH 相關(guān)。臨床表型與基因型預(yù)測一致性分別為100%（SW）、95%（SV）和70%（NCCAH）［21］。

2.2 21-OHD基因分型常用的分子診斷策略

由于CYP21A2基因拷貝數(shù)變異的頻繁出現(xiàn)，以及大量可能的遺傳變異，對CYP21A2等位基因的鑒定相當(dāng)困難。僅采用Sanger測序無法檢出CYP21A2基因大片段缺失，而多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA） 可 檢測大片段缺失，對早期診斷和干預(yù)有重要意義，且可以通過結(jié)合探針的峰高判斷是單等位基因的缺失，還是CYP21A2基因的完全缺失，是目前CYP21A2基因缺失診斷的較為可靠的方法［22］。21-OHD最佳的基因分析應(yīng)該是基于聚合酶鏈反應(yīng)的序列分析聯(lián)合MLPA，有助于檢測出多種類型的變異。

由于任何檢測均有局限性及CYP21A2基因座具復(fù)雜性，這些技術(shù)都不能識別所有的變異。應(yīng)該盡可能進(jìn)行家系分離研究，這樣可鑒別先證者2個(gè)被檢測到的致病變異是影響2個(gè)等位基因（反式構(gòu)型，trans），還是位于同一個(gè)等位基因（順式構(gòu)型，cis）［23］。如為cis，盡管CYP21A2基因有2個(gè)致病變異，但只有1個(gè)等位基因發(fā)生變異而另一個(gè)等位基因正常，則無臨床表現(xiàn)。

3 21-OHD基因分型指導(dǎo)治療

基因型與表型的特定關(guān)系可直接服務(wù)于臨床診斷，為新生兒篩查及陽性患兒臨床分型提供依據(jù)；而僅通過生化激素檢測，不能預(yù)知患兒疾病的嚴(yán)重程度及確定具體的臨床分型。同時(shí)，21-OHD 基因型-臨床表型的對應(yīng)關(guān)系可指導(dǎo)氫化可的松用藥劑量，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的治療以及預(yù)后判定。如基因型預(yù)測為SW 型，推薦使用氫化可的松聯(lián)合氟氫可的松，這樣可最大程度避免腎上腺危象，減少高鉀低鈉血癥發(fā)生，從而減少住院次數(shù)及縮短住院時(shí)間；如基因型預(yù)測為SV 型，則建議避免使用過量的氟氫可的松，以降低發(fā)生醫(yī)源性高血壓的風(fēng)險(xiǎn)。但基因型預(yù)測也存在不確定因素，尤其是中間致病變異，此時(shí)需結(jié)合臨床體征、實(shí)驗(yàn)室檢測以及診療過程中的密切隨訪來指導(dǎo)治療。

4 21-OHD基因分型指導(dǎo)遺傳咨詢

21-OHD 屬于常染色體隱性遺傳性疾病，即只有當(dāng)2 個(gè)等位基因同時(shí)發(fā)生變異時(shí)才會(huì)發(fā)病。如2 個(gè)等位基因存在相同的基因變異，即基因型為純合子；2個(gè)等位基因都有變異，但是在不同的位點(diǎn)，即為復(fù)合雜合子型。CYP21A2基因變異雖然種類繁多，但大多數(shù)患者基因型為復(fù)合雜合子型，臨床表現(xiàn)取決于酶活性受損較輕的等位基因［24］。

每個(gè)病例的兄弟姐妹都有25%的概率為CAH 患者，50%的概率為無癥狀攜帶者。根據(jù)1/10 000～1/20 000 的經(jīng)典型CAH 發(fā)病率推算，一般人群中1/50～1/71 是雜合子，中位數(shù)為1/60，經(jīng)典型CAH 的患者有1/120的概率生育患經(jīng)典型CAH子代。

對于NCCAH，幾乎70%的確診患者是復(fù)合雜合子，即攜帶1個(gè)導(dǎo)致經(jīng)典型CAH 的等位基因和1個(gè)導(dǎo)致NCCAH 的等位基因。2 個(gè)等位基因中，導(dǎo)致殘余酶活性較高的變異決定了表型。這意味著患者為NCCAH，其后代有50%的概率繼承經(jīng)典的CAH等位基因。從理論上講，NCCAH 患者子代患經(jīng)典型CAH的風(fēng)險(xiǎn)為1∶250［25］。然而，在2 項(xiàng)對NCCAH 婦女子代的回顧性研究中，其患病風(fēng)險(xiǎn)更高，為1.5%～2.5%［26］。在伴有經(jīng)典型CAH 和NCCAH 的男性混合組中也發(fā)現(xiàn)了類似的風(fēng)險(xiǎn)［27］。

由于CYP21A2變異的高攜帶率，家庭成員可能攜帶先癥者未檢測到的CYP21A2其他變異。因此，在高危親屬中，盡管有已知的家系CYP21A2變異類型，全面篩選CYP21A2變異（通過測序和MLPA 分析）與只分析先癥者中檢測到的已知的變異類型相比更具優(yōu)勢。

5 結(jié)語

分子檢測有助于21-OHD 患者的確診，尤其對于臨床疑似而實(shí)驗(yàn)室診斷困難者，或診斷不明已用糖皮質(zhì)激素治療者。在大多數(shù)情況下，疾病表型的嚴(yán)重程度可以通過基因型來預(yù)測?；蛐团c臨床表型的相關(guān)性可以為患者的短期和長期治療提供重要的指導(dǎo)；在先癥者及父母基因型明確的基礎(chǔ)上，可為需要再生育的CAH家庭提供產(chǎn)前診斷。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻(xiàn)/Authors'Contributions

呂擁芬和李嬪共同負(fù)責(zé)論文的撰寫和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The manuscript was drafted and revised by Lü Yongfen and LI Pin.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-11

·Accepted：2022-04-27

·Published online：2022-05-28