基于JNK通路研究改良型富血小板纖維蛋白與β-三磷酸鈣復(fù)合物誘導(dǎo)成骨的機制

付冬梅，王 浪，周 婧，王 勁，楊 昕，李素蘭，蘭 紅

（資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院口腔科，四川 資陽 641300）

骨缺損的傳統(tǒng)治療方法有骨水泥+ 螺釘技術(shù)、自體骨移植、同種異體骨移植等，但均存在愈合速度慢、療效差等缺點，因此近年來發(fā)展迅速的骨組織工程開始應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)治療中[1]。雖然在骨缺損處植入骨組織材料對骨缺損的修復(fù)具有促進作用，但大部分骨代替材料只有引導(dǎo)成骨作用，材料成本昂貴，且存在免疫反應(yīng)和疾病傳播的風(fēng)險[2]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，利用血液濃聚物中提取的生物材料進行改良富血小板纖維蛋（A-PRF）被證實可促進軟硬組織的愈合及再生，與β- 三磷酸鈣（β-TCP）結(jié)合為復(fù)合物后能有效應(yīng)用于口腔頜面外科、整形外科、運動醫(yī)學(xué)、牙周病學(xué)等多個領(lǐng)域[3]。作為改良型復(fù)合物，A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物在誘導(dǎo)成骨方面已被證實效果比普通PRF 更佳，但詳細機制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNK）通路對骨分化與骨形成有促進作用，也能誘導(dǎo)骨形成蛋白（BMPs）的合成，促進成骨。目前發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白2（BMP-2）可通過干預(yù)JNKs 而增加調(diào)控成骨的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Osx 的表達，而骨形成蛋白9（BMP-9）是目前已知的BMPs 誘導(dǎo)成骨中最強的因子，BMP-9 具有促進干細胞體內(nèi)外成骨的作用[4-5]。因此我們猜測A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物可能通過調(diào)節(jié)JNK 通路產(chǎn)生誘導(dǎo)成骨的作用。為此，本研究基于JNK 通路研究A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔股骨缺損區(qū)域的誘導(dǎo)成骨效果，為臨床治療骨缺損提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性新西蘭大白兔24 只，5 ～6 月齡，體重（3±0.5）kg，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189。

1.2 試劑

A-PRF 由資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院提供；β-TCP購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；兔堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）Elisa 試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；BMP-9、JNK、p-JNK抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 儀器

Multiskan Sky 酶 標 儀、CX33 顯 微 鏡（ 日 本Olympus 公司）、電泳儀、凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 主要實驗方法

1.4.1 構(gòu)建兔股骨缺損模型與給藥處理[6]將動物分為模型組、1:1 復(fù)合物組（A-PRF:β-TCP=1:1）、2:1 復(fù)合物組（A-PRF:β-TCP=2:1）與4:1 復(fù)合物組（A-PRF:β-TCP=4:1）四組，每組各6 只。各組動物均靜脈注射3% 戊巴比妥鈉溶液（1 mL/kg）進行麻醉，在后肢膝關(guān)節(jié)外側(cè)距前緣1.0cm 處做一弧形切口，長度約為5cm。暴露股骨外側(cè)髁后，用骨鉆制備直徑為6 mm、深約8 mm 的圓柱形骨缺損區(qū)域，同時在距離骨缺損中央約6 mm 處，左右對稱旋入1 枚直徑為2 mm的鈦釘進行定位。復(fù)合物組在骨缺損區(qū)域填充0.5 mL復(fù)合物，模型組不進行填充。各組動物均使用醫(yī)用膠原修復(fù)膜覆蓋切口處，之后每天肌內(nèi)注射80 萬U 青霉素鈉進行抗感染治療，持續(xù)3d。8 周后處死動物采集指標進行后續(xù)檢測。

1.4.2 大致觀察 術(shù)后觀察各組動物切口愈合的狀況，有無感染發(fā)生及飲食、活動狀況；術(shù)后8 周肉眼觀察骨缺損處的修復(fù)效果。

1.4.3 病理學(xué)檢測 采集各組動物股骨缺損區(qū)域組織，用4% 多聚甲醛固定24 h，脫鈣、脫水后制成石蠟切片，采用蘇木精- 伊紅（HE）染色法對切片進行染色，觀察骨缺損區(qū)域的愈合情況與新生血管的形成情況。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附（Elisa） 檢測采集各組動物血液，分離血清，按照免疫酶聯(lián)試劑盒說明書對樣本進行檢測操作，檢測兔血清中ALP 和OCN 的含量。

1.4.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot） 檢測將收集的各組動物股骨組織置于液氮中研磨，進行蛋白質(zhì)提取與定量，依次進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影處理，最后使用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行分析，計算蛋白質(zhì)的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔股骨缺損的修復(fù)效果

肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，模型組股骨缺損處修復(fù)尚未完全，2:1 復(fù)合物組缺損區(qū)域基本恢復(fù)，效果最佳，其次為4:1 復(fù)合物組與1:1 復(fù)合物組。HE 染色發(fā)現(xiàn)，模型組骨組織損傷區(qū)域明顯，纖維組織增生情況嚴重，細胞核呈長梭形，炎性細胞浸潤數(shù)量多，新生毛細血管形成數(shù)量少；1:1 復(fù)合物組骨組織損傷區(qū)域明顯，植入材料分布明顯，組織與材料之間出現(xiàn)少量纖維組織，炎性細胞浸潤數(shù)量較多，淋巴細胞和中性粒細胞少量聚集，新生毛細血管形成數(shù)量少；2:1 復(fù)合物組骨組織之間損傷區(qū)域基本消失，可見少量植入材料分布，材料與骨組織之間出現(xiàn)較多纖維組織，炎性細胞浸潤數(shù)量較少，大多數(shù)為淋巴細胞，同時可見大量新生毛細血管形成；4:1 復(fù)合物組骨組織之間損傷區(qū)域較少，可見少量植入材料分布，材料與骨組織之間出現(xiàn)纖維組織，可見炎性細胞浸潤，新生毛細血管形成數(shù)量較多。結(jié)果見圖1。

圖1 四組動物股骨缺損區(qū)域修復(fù)情況與病理學(xué)觀察結(jié)果（HE 染色）

2.2 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔血清OCN 與ALP 的影響

Elisa 檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，復(fù)合物組血清中ALP 與OCN 的含量均顯著升高（P＜0.05），復(fù)合物比例為2:1 時升高幅度最大。結(jié)果見表1。

表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況（± s）

表1 四組動物血清中ALP 與OCN 含量的變化情況（± s）

注：* 與模型組相比，P ＜0.05 ；** 與模型組相比，P ＜0.01。

組別 ALP OCN模型組（n=6） 28.43±2.88 10.46±0.81 1:1 復(fù)合物組（n=6） 47.83±5.58** 14.45±1.83**2:1 復(fù)合物組（n=6） 70.25±3.04** 21.55±2.99**4:1 復(fù)合物組（n=6） 61.93±2.55** 19.58±2.11**

2.3 不同比例的APRF 與β-TCP 復(fù)合物對兔新生骨組織中JNK 通路的影響

WesternBlot 檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，復(fù)合物組新生骨組織中BMP-9 與p-JNK 蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05），其中2:1 復(fù)合物組BMP-9、p-JNK 蛋白表達水平變化最大，JNK 蛋白表達水平則無明顯變化。結(jié)果見表2。

表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況（± s）

表2 四組動物新生骨組織中BMP-9、JNK 和p-JNK 蛋白的表達情況（± s）

注：* 與模型組相比，P ＜0.05 ；** 與模型組相比，P ＜0.01。

組別 BMP-9 JNK p-JNK模型組（n=6） 1.000±0.012 1.000±0.059 1.000±0.020 1:1 復(fù)合物組（n=6） 1.375±0.068** 1.008±0.028** 1.409±0.066**2:1 復(fù)合物組（n=6） 1.934±0.106** 0.982±0.028** 2.488±0.047**4:1 復(fù)合物組（n=6） 1.563±0.044** 0.936±0.016** 1.775±0.029**

3 討論

生物復(fù)合材料介導(dǎo)的骨再生技術(shù)是一種很有前景的骨再生治療策略。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，A-PRF 與β-TCP 在促成骨中可發(fā)揮重要作用，但A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物促進骨形成的潛在機制尚不清楚。本實驗通過建立兔股骨缺損模型發(fā)現(xiàn)，A-PRF 與β-TCP復(fù)合物能通過激活JNK 通路、誘導(dǎo)BMP-9 蛋白表達，產(chǎn)生骨修復(fù)作用，當A-PRF 與β-TCP 構(gòu)成比例為2:1 時誘導(dǎo)效果最明顯。ALP 是常見的成骨分化標志物[7]，通過成骨細胞分泌，促進鈣、磷沉積在骨骼中，其含量的高低可反映成骨細胞的成骨能力[8]。OCN 是成骨分化過程中最敏感的指標之一，一方面可以提高ALP 的活性并加速與之結(jié)合，促進成骨細胞的增殖與骨形成；另一方面，OCN 與鈣離子結(jié)合對促進骨沉積和骨生長有積極作用[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，OCN 的活性與成骨細胞分化和破骨細胞凋亡呈正相關(guān)[10-11]。因此，OCN 的高表達可增加骨基質(zhì)，增強骨質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，在骨缺損區(qū)域填充A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物8 周后，新生骨組織中的ALP 與OCN 含量均顯著上升，復(fù)合物比例為2:1 時效果最好，說明在該比例下的A-PRF 與β-TCP 復(fù)合物誘導(dǎo)骨形成的效果最佳。MAPK 家族主要有三個亞家族，即細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、JNK 和p38。多項研究表明JNK 信號通路在調(diào)控成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，JNK 磷酸化參與了成骨過程，大麻素受體通過激活JNK 通路可增強牙周韌帶干細胞的骨/ 牙本質(zhì)分化能力[12]，褐藻多糖通過激活JNK 通路可誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細胞成骨分化[13]。在JNK 參與成骨分化的調(diào)控因素中，BMPs 的作用是至關(guān)重要的，BMP-9 被認為是最具成骨能力的BMP，比BMP-2 表現(xiàn)出更多的骨再生潛能。自BMP-9 被發(fā)現(xiàn)以來，因其比其他BMP 家族成員具有更高的促進骨形成的能力而受到廣泛關(guān)注[14-15]。有研究通過比較發(fā)現(xiàn)，與其他BMP 相比，BMP-9 能更有效地增強ALP活性，誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細胞成骨分化，導(dǎo)致ALP、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、OCN、骨橋蛋白（OPN）mRNA 和蛋白的表達水平升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，A-PRF與β-TCP 復(fù)合物能誘導(dǎo)新生骨組織中顯著增加JNK蛋白磷酸化水平，激活JNK 通路，從而增加BMP-9蛋白的表達，誘導(dǎo)成骨分化與骨形成。

綜上所述，本研究證實A-PRF 與β-TCP 組成的復(fù)合物可通過激活JNK 信號通路促進股骨缺損區(qū)域成骨，這可能是該復(fù)合物促進成骨的機制之一，且構(gòu)成比例為2:1 時效果最佳。但由于JNK 通路與BMP-9蛋白刺激的骨形成涉及許多信號通路，因此A-PRF與β-TCP 復(fù)合物在骨再生技術(shù)中所起的骨形成作用機制還有待于進一步研究與發(fā)掘。