白術(shù)對急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

徐麗芳，李 鵬

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江西 南昌 330000 ；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006）

胃黏膜損傷是臨床上常見的消化道疾病之一，其發(fā)病因素多種多樣，發(fā)病率逐年增高。中醫(yī)認(rèn)為胃黏膜損傷屬于“胃脘痛”“痞證”“胃癰”等范疇，其病因可分為外邪客胃、飲食傷胃、七情內(nèi)傷、脾胃虛弱、瘀血阻絡(luò)等幾個方面[1]。臨床上胃黏膜損傷患者多存在脾虛，兼夾有濕、熱、瘀，故多選擇健脾益胃的中藥組方來治療。白術(shù)性溫，味甘、苦，入脾經(jīng)、胃經(jīng)，主要功效為健脾益氣、燥濕利水等，在治療胃黏膜損傷的復(fù)方中出現(xiàn)頻率極高。《醫(yī)學(xué)啟源》中記載：“（白術(shù)）除濕益燥，和中益氣，溫中，去脾胃中濕，除胃熱，強(qiáng)脾胃”[2]。故本實(shí)驗(yàn)擬探究白術(shù)對乙醇致急性胃黏膜損傷大鼠的保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)理作用，為白術(shù)的開發(fā)、利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物的預(yù)處理

稱取白術(shù)飲片（購于安徽某藥材市場），去除雜質(zhì)后置于粉碎機(jī)中粉碎，過60 目篩，臨用前用1%羧甲基纖維素鈉溶液配置成0.04g/mL、0.06g/mL、0.08g/mL 的受試物溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

健康Wistar 雄性大鼠（購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司），體重200g 左右。

1.3 試劑與儀器

奧美拉唑膠囊（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)），PBS 磷酸鹽緩沖液（北京萬佳首化生物科技有限公司生產(chǎn)），0.9% 生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室配制），無水乙醇（天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司生產(chǎn)），10% 甲醛溶液（德國默科公司生產(chǎn)）。A8 勻漿機(jī)（上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司生產(chǎn)），電子天平（上海精密儀器有限公司生產(chǎn)），AXTG16G 臺式高速離心機(jī)（鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)），SZ61 解剖顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司生產(chǎn)），三葉因子1、2（TFF1、TFF2）大鼠ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)），白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）檢測試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司生產(chǎn)），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 乙醇致急性胃黏膜損傷大鼠造模實(shí)驗(yàn)及分組

雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量在200g 左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，每組12 只，即：空白對照組、模型對照組、奧美拉唑組及白術(shù)低、中、高劑量組（0.4g/kg、0.6g/kg、0.8g/kg，以生藥計(jì)）?？瞻讓φ战M和模型對照組給予等體積的1% 羧甲基纖維素鈉溶液，奧美拉唑組給予3.5mg/kg 的奧美拉唑膠囊內(nèi)容物溶液，白術(shù)組給予不同劑量的受試液，灌胃體積均為10mL/kg，每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃28d。末次給藥后，將大鼠禁食不禁水12h，除空白對照組外，其余大鼠均灌胃1.0mL 無水乙醇，建立乙醇致急性胃黏膜損傷大鼠模型。以上實(shí)驗(yàn)及分組平行3 次，分別用于測定胃黏膜損傷指數(shù)、血清生化指標(biāo)及胃組織中三葉因子蛋白含量。

1.4.2 胃黏膜損傷指數(shù)及潰瘍抑制率的測定 第一組實(shí)驗(yàn)大鼠：灌胃無水乙醇1h 后處死大鼠，解剖腹部，結(jié)扎賁門和幽門，取出完整胃部，注射0.6mL 甲醛溶液（濃度為10%），隨后將胃浸泡在甲醛溶液中30min 并固定內(nèi)外層。沿胃大彎剪開，去除胃內(nèi)容物，用濾紙吸干表面水分，平鋪胃黏膜，用解剖顯微鏡觀察測量胃黏膜損傷數(shù)量及長度、寬度。依據(jù)陳蔚文[3]主編的《消化道藥理與臨床》中乙醇性胃潰瘍模型胃潰瘍指數(shù)的計(jì)分方法，大鼠計(jì)分總數(shù)即胃黏膜損傷指數(shù)，并根據(jù)下面公式計(jì)算潰瘍抑制率（%）。計(jì)分方法：完整胃黏膜計(jì)0 分；胃黏膜有點(diǎn)狀出血（直徑≤1mm）和點(diǎn)狀糜爛計(jì)0.5 分；胃黏膜有條索狀潰瘍，每1mm 長度計(jì)1 分，短徑＞1mm 時計(jì)分加倍。

1.4.3 血清生化指標(biāo)的測定 第二組實(shí)驗(yàn)大鼠：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌胃無水乙醇1h 后處死大鼠，腹主動脈取血，于3500r/min 離心機(jī)中離心10min，取上清液，根據(jù)試劑盒操作方法測定血清中SOD、MDA、NO 含量及血清中細(xì)胞因子IL-8、IL-2 含量。

1.4.4 胃組織中TFF1、TFF2 蛋白含量的測定[4]第三組實(shí)驗(yàn)大鼠：灌胃無水乙醇1h 后處死大鼠，解剖腹部，取出胃組織，用已預(yù)冷的PBD 磷酸鹽緩沖液沖洗，去除血液，電子天平稱重后將組織剪碎，按1:9體積加入PBS 磷酸鹽緩沖液，在冰盤上充分勻漿研磨，4℃時放入6000r/min 離心機(jī)中離心10min，取上清液于-80℃冰箱中保存待測，并檢測其中TFF1、TFF2蛋白含量，測定方法按ELISA 試劑盒說明書中的步驟操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均以±s表示，行t檢驗(yàn)，P＜0.05 表明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜損傷指數(shù)及潰瘍抑制率的影響

研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠胃潰瘍明顯，且潰瘍情況嚴(yán)重，提示無水乙醇能造成明顯的胃黏膜損傷。與模型對照組相比，奧美拉唑組和白術(shù)三個劑量組的胃潰瘍均有不同程度的改善，胃黏膜損傷指數(shù)下降，潰瘍抑制率上升（P＜0.05，P＜0.01），白術(shù)高劑量組效果最明顯，潰瘍抑制率高達(dá)55.21%（P＜0.05），與奧美拉唑組結(jié)果相近。詳見表1。

表1 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜損傷指數(shù)及潰瘍抑制率的影響

2.2 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠血清中SOD、MDA及NO 含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組大鼠胃黏膜損傷后血清中SOD 的活性減弱，氧化產(chǎn)物MDA 含量上升，NO 含量下降（P＜0.01）。與模型對照組相比，奧美拉唑組和白術(shù)中、高劑量組血清中SOD 活性提高，MDA 含量降低，NO 含量升高（P＜0.05）。詳見表2。

表2 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠血清中SOD、MDA 及NO 含量的影響

2.3 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠血清中細(xì)胞因子IL-8、IL-2 的影響

模型對照組血清中IL-2 含量低于空白對照組，IL-8 含量高于空白對照組（P＜0.05），提示胃黏膜損傷對細(xì)胞因子含量有影響。與模型對照組相比，奧美拉唑組和白術(shù)三個劑量組大鼠血清中IL-8 含量下降、IL-2 含量升高（P＜0.05）。詳見表3。

表3 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠血清中細(xì)胞因子IL-8、IL-2 的影響

2.4 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠胃組織中TFF1、TFF2蛋白含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組組胃組織中TFF1、TFF2 蛋 白 含 量 下 降（P＜0.05，P＜0.01）。與模型對照組相比，奧美拉唑組、白術(shù)三個劑量組胃組織中TFF1 蛋白含量升高（P＜0.05），奧美拉唑組和白術(shù)中、高劑量組胃組織中TFF2 蛋白含量升高（P＜0.05）。詳見表4。

表4 白術(shù)對胃黏膜損傷大鼠胃組織中TFF1、TFF2 蛋白含量的影響

3 討論

胃黏膜損傷指數(shù)是評價胃黏膜損傷模型建立成功與否的基本指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)通過無水乙醇灌胃，破壞了大鼠的胃表面黏液層和黏液細(xì)胞，進(jìn)而破壞了胃黏膜正常代謝所需的生理環(huán)境，出現(xiàn)生理和病理性損傷[5]。第一組實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)高達(dá)（42.2±5.8），說明本實(shí)驗(yàn)乙醇致急性胃黏膜損傷大鼠模型造模成功。而白術(shù)三個劑量組的胃潰瘍均有不同程度的改善，胃黏膜損傷指數(shù)下降，潰瘍抑制率上升，說明白術(shù)能提高胃黏膜抵抗力，維持胃黏膜正常代謝所需的生理環(huán)境，減少刺激性損傷，這與相關(guān)文獻(xiàn)[6]報道的“白術(shù)具有抗?jié)冏饔谩毕嘁恢?。氧自由基是急性胃黏膜損傷的重要致病因子，氧自由基易與多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，從而引起胃黏膜血流障礙，引發(fā)、加重胃黏膜損傷[7]。SOD 是機(jī)體中重要的抗氧化酶，可通過歧化反應(yīng)來清除氧自由基。MDA 是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，機(jī)體中MDA 含量的變化能反映組織細(xì)胞損傷的程度。因此，在治療胃黏膜損傷的過程中，應(yīng)注重提高SOD 的活性，加快清除MDA。第二組實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠胃黏膜損傷后，SOD 活性減弱，氧化產(chǎn)物MDA 含量上升，而白術(shù)中、高劑量組血清中SOD 活性提高，MDA 含量降低。說明白術(shù)可通過清除氧自由基來保護(hù)胃黏膜。NO 是評價胃黏膜損傷程度的重要指標(biāo)之一，它是一種內(nèi)源性血管舒張因子，能有效舒張血管，增加胃黏膜血流量[8]。當(dāng)胃黏膜損傷時，易產(chǎn)生血氧供應(yīng)不足，導(dǎo)致NO 含量降低，而NO 可改善胃黏膜的微循環(huán)，使血氧量上升，加快胃黏膜上皮細(xì)胞的更換和修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白術(shù)中、高劑量均能提高NO 含量，其中白術(shù)高劑量效果最好。提示白術(shù)可能通過增加NO 含量提高胃黏膜血流量，改善血氧供應(yīng)，加快胃黏膜細(xì)胞的修復(fù)。IL-2 是由T 細(xì)胞產(chǎn)生的保護(hù)因子，具有多向性，可起到免疫調(diào)節(jié)作用。IL-8是中性粒細(xì)胞趨化分子，是炎癥因子的重要介質(zhì)，與炎癥程度呈正相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)中，白術(shù)連續(xù)灌胃28d 后，胃黏膜損傷大鼠血清中IL-2 分泌上升，IL-8 分泌下降，提示白術(shù)可保護(hù)胃黏膜，其機(jī)制可能是通過控制血清中IL-2、IL-8 的分泌，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能，增強(qiáng)免疫能力，減輕炎癥程度。三葉因子家族（TTFs）是較新發(fā)現(xiàn)的小分子多肽，包含TFF1、TFF2、TFF3。其中TFF1、TFF2 主要分布于胃部，TFF3 則多分布在肺部及腸道[10]。研究表明，TFF1 以二聚體的形式通過二硫鍵與黏蛋白結(jié)合，組成網(wǎng)狀保護(hù)層，能減輕胃酸、胃蛋白酶水解對胃黏膜的損傷。TFF2 能加強(qiáng)黏液凝膠層，增強(qiáng)胃黏膜表層對有害物質(zhì)的抵抗，還能抑制胃酸分泌，刺激胃細(xì)胞增殖，提高胃黏膜的修復(fù)能力[11]。本實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)28d 灌胃白術(shù)可促使大鼠胃組織中TFF1、TFF2 蛋白的含量增加，起到保護(hù)胃黏膜的作用。目前對TFFs 的研究較少，需通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)詳細(xì)探究其對胃黏膜的保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，白術(shù)具有保護(hù)胃黏膜的作用，其機(jī)理可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、增加抗氧化酶活性、清除脂質(zhì)氧化產(chǎn)物、加強(qiáng)細(xì)胞修復(fù)作用等有關(guān)。