賀 涵，劉傳和，邵雪花，賴(lài) 多，匡石滋，肖維強(qiáng)

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省熱帶亞熱帶果樹(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

轉(zhuǎn)錄因子又稱(chēng)為反式作用因子，是真核生物中能與靶基因上游特定序列(順式作用元件)結(jié)合的一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白[1]。MYB是植物中一類(lèi)數(shù)目眾多、功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子超家族，在多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[2]。人們從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已鑒定出300多種MYB轉(zhuǎn)錄因子，約占轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的9%[3]。MYB轉(zhuǎn)錄因子的共同特征是氨基端具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，可將其分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB 4大類(lèi)。R2R3-MYB是植物特有且數(shù)量最多(約占MYB轉(zhuǎn)錄因子總數(shù)的一半)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與調(diào)控植物次級(jí)代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物與非生物逆境響應(yīng)等生理過(guò)程[4]。目前研究人員已完成了多種植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)鑒定，如擬南芥有125個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[5]，葡萄有108個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[6]，菠蘿有103個(gè)與激素響應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育和開(kāi)花調(diào)控等過(guò)程有關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[7]。

由于R2R3-MYB基因家族成員眾多，人們依據(jù)R2R3-MYB蛋白羧基端的保守基序，將擬南芥R2R3-MYB基因家族進(jìn)一步細(xì)分為22個(gè)亞族[5]，其中S20亞族包括MYB2、MYB62、MYB78、MYB108、MYB112和MYB116，與植物逆境脅迫響應(yīng)、衰老及后續(xù)的細(xì)胞凋亡過(guò)程有關(guān)。擬南芥AtMYB2參與缺氧反應(yīng)調(diào)控，能與缺氧響應(yīng)基因上游的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)結(jié)合并誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[8]；桉樹(shù)EgMYB2能與木質(zhì)素合成相關(guān)的肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)以及肉桂醇脫氫酶(CAD)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控木質(zhì)素生物合成和次生細(xì)胞壁形成[9]。AtMYB62受低磷信號(hào)(Pi starvation)誘導(dǎo)并參與維持磷穩(wěn)態(tài)，能與赤霉素降解基因GA2OX的啟動(dòng)子結(jié)合并激活GA2OX基因表達(dá)，是赤霉素信號(hào)途徑的重要負(fù)調(diào)控因子[10]。MYB78能通過(guò)影響活性氧相關(guān)及防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控活性氧依賴(lài)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[11]。MYB108參與植物應(yīng)對(duì)病原菌感染(生物脅迫)的早期細(xì)胞程序性死亡(PCD)過(guò)程，缺失MYB108可導(dǎo)致早期PCD失效并誘發(fā)植物細(xì)胞壞死過(guò)程(Necrosis)[12]；MYB108還與葉片衰老過(guò)程中的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程有關(guān)，AtMYB108能與NAC003基因的啟動(dòng)子結(jié)合介導(dǎo)葉片衰老過(guò)程[13]。玫瑰RhMYB108能與RhNAC053、RhNAC092和RhSAG113等凋亡相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控玫瑰花瓣的衰老過(guò)程，抑制RhMYB108基因的表達(dá)能延緩乙烯與茉莉酸介導(dǎo)的花瓣衰老過(guò)程[14]。擬南芥AtMYB112與鹽脅迫、高光脅迫響應(yīng)有關(guān)[15]；而葡萄VvMYB112受NaCl、低溫(4 ℃)以及PEG誘導(dǎo)，參與多種非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程[16]。MYB116與干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)，超表達(dá)甘薯IbMYB116能提高擬南芥IbMYB116轉(zhuǎn)基因植株的干旱脅迫抗性[17]。

菠蘿(AnanascomosusL. Merr.)又稱(chēng)鳳梨、黃梨、王梨，是單子葉鳳梨科鳳梨屬的多年生常綠草本果樹(shù)，為世界第三大熱帶水果。菠蘿原產(chǎn)于中南美洲的巴西、巴拉圭及阿根廷等國(guó)家，于16世紀(jì)引入我國(guó)，現(xiàn)主要分布于廣東、廣西、海南、福建、云南、臺(tái)灣等省(區(qū))。我國(guó)現(xiàn)有菠蘿種植面積約66 000 hm2，年產(chǎn)量約167萬(wàn)t，產(chǎn)值近40億元。菠蘿香味濃郁，甜酸適口，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已成為我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱之一。菠蘿在采后貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中易發(fā)生黑心病(一種采后生理性病害)，導(dǎo)致果肉褐變并失去商品性，嚴(yán)重影響菠蘿的流通與銷(xiāo)售，然而菠蘿黑心病的分子機(jī)理尚不清楚。最近，有研究者認(rèn)為蔬果采后劣變過(guò)程的實(shí)質(zhì)是逆境脅迫與衰老誘發(fā)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[18]。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥S20亞族基因AtMYB108的菠蘿同源基因AcMYB108a(基因ID：109718059)在菠蘿果實(shí)采后劣變過(guò)程中顯著上調(diào)，系統(tǒng)鑒別分析菠蘿S20亞族基因?qū)⒂兄诹私馄湓诓ぬ}采后劣變過(guò)程中的作用。本研究基于已報(bào)道的菠蘿基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，分離鑒定菠蘿S20亞族的全體成員，分析相關(guān)成員的轉(zhuǎn)錄本、蛋白結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子元件，克隆AcMYB108a基因并進(jìn)行原核表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究菠蘿S20亞族基因的生物學(xué)功能，解析其與菠蘿果實(shí)采后劣變的關(guān)系，及初步闡明菠蘿果實(shí)采后劣變的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘神灣菠蘿’無(wú)菌苗和原核表達(dá)載體pET28a，本課題組保存；大腸桿菌DH5α與Rossetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，上海唯地生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒(貨號(hào)DP452)，天根生物；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)R312-01)，諾維贊；TBST漂洗液、Anti-His單抗和AP偶聯(lián)羊抗鼠多抗，生工生物。

1.2 菠蘿S20亞族基因的鑒定

選取擬南芥S20亞族基因AtMYB2、AtMYB62、AtMYB78、AtMYB108、AtMYB112和AtMYB116的蛋白序列，利用TBtools軟件[19]的Find Best homology程序比對(duì)菠蘿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取菠蘿S20亞族候選蛋白。從Pfam下載MYB結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型(PF02701)，利用Hmmer 3.0軟件的Hmmsearch程序搜索菠蘿蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，去除冗余序列后利用Pfam進(jìn)行篩選，得到菠蘿MYB蛋白序列集。將TBtools鑒定到的菠蘿S20亞族候選蛋白與Hmmsearch獲得的菠蘿MYB蛋白序列集進(jìn)行聯(lián)合分析，確定菠蘿基因組中S20亞族成員。

1.3 菠蘿S20亞族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ClustalW軟件將菠蘿、水稻、玉米、番茄、擬南芥等植物的S20亞族蛋白以及作為外群的擬南芥S18、S19亞族蛋白進(jìn)行序列相似性比對(duì)，并通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展法(Bootstrap=1 000)進(jìn)行檢驗(yàn)，最后利用iTOL工具(https://itol.embl.de/)美化。

1.4 菠蘿S20亞族基因的結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)基因組注釋信息，獲取菠蘿S20亞族基因的染色體位置與核苷酸組成等信息。從NCBI下載相關(guān)基因的DNA序列，并利用在線工具GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖，展示相關(guān)基因的UTR、外顯子、內(nèi)含子等信息。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析相關(guān)基因啟動(dòng)子(基因轉(zhuǎn)錄起始ATG前1 500 bp序列)，預(yù)測(cè)各基因啟動(dòng)子的順式作用元件。

1.5 菠蘿S20亞族的基因表達(dá)分析

從NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載菠蘿RNA-seq數(shù)據(jù)，根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)中菠蘿S20亞族基因的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)(TPM值)，構(gòu)建矩陣并繪制基因表達(dá)量熱圖。

1.6 菠蘿S20亞族的蛋白序列特征分析

根據(jù)菠蘿S20亞族基因的蛋白序列，采用ExPASy的ProtParam功能(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白的等電點(diǎn)與分子質(zhì)量(molecular weight, MW)，用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白的亞細(xì)胞定位，用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)相關(guān)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用MEME軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)鑒定菠蘿S20亞族蛋白的保守基序(motif)，相關(guān)參數(shù)為經(jīng)典模式，zoops分布，最大結(jié)構(gòu)域數(shù)=10。

1.7 菠蘿AcMYB108a原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)

以‘神灣菠蘿’無(wú)菌苗幼葉為材料，采用RNA試劑盒提取葉片總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上AcMYB108a的基因序列(NCBI登錄號(hào)109718059)，用primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物pET28a-MYB108a-F和pET28a-MYB108a-R，引物序列為pET28a-MYB108a-F：5′-tataGGATCCATGGAGGACCATGAAAGGGTC-3′，pET28a-MYB108a-R：5′-tataAAGCTTTTATTGGTGCATGAACAGTATGTCC-3′。pET28a-MYB108a-F和pET-28a-MYB108a-R序列中下劃線部分分別為BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，tata為保護(hù)堿基，引物由生工生物合成。以菠蘿cDNA為模板，PCR擴(kuò)增菠蘿AcMYB108a基因序列。PCR反應(yīng)體系參考諾維贊2×Phanta Master Mix高保真酶說(shuō)明書(shū)配制。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段，用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的pET28a載體連接至并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，涂布LB平板(含50 mg/L 卡那霉素)后倒置培養(yǎng)12～16 h直至菌落長(zhǎng)出。次日，通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pET28a-MYB108a。

將pET28a-MYB108a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株Rossetta (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞并涂布LB平板(含50 mg/L卡那霉素)，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取轉(zhuǎn)化子接種于含50 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日，將種子液按照1∶50的比例加入到含50 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，并繼續(xù)培養(yǎng)至菌液在600 nm處吸光度(OD600)為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.8 AcMYB108a重組蛋白的優(yōu)化表達(dá)

為進(jìn)一步提高AcMYB108a重組蛋白的表達(dá)效率，對(duì)AcMYB108a的編碼序列進(jìn)行了密碼子分析與優(yōu)化。利用賽默飛公司研發(fā)的密碼子優(yōu)化工具Geneoptimizer，在不改變編碼氨基酸的前提下，依據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性對(duì)AcMYB108a的基因序列進(jìn)行堿基替換。密碼子優(yōu)化前，AcMYB108a含有較多稀有密碼子，其適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.56，密碼子優(yōu)化后重組蛋白編碼序列的CAI為0.81，且避免了稀有密碼子的使用。優(yōu)化后的基因序列由廣州艾基生物公司合成并克隆至pET28a載體上，命名為pET28a-MYB108R，對(duì)pET28a-MYB108R進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、檢測(cè)，方法同1.7節(jié)。

1.9 AcMYB108a重組蛋白的Western blot驗(yàn)證

對(duì)pET28a-MYB108a和pET28a-MYB108R誘導(dǎo)表達(dá)的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(12.5%分離膠)分離，通過(guò)電轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜在封閉液(TBST+50 g/L脫脂奶粉)中封閉2 h后，依次在一抗(TBST+30 g/L脫脂奶粉+Anti-His單抗)、二抗(TBST+30 g/L脫脂奶粉+AP偶聯(lián)羊抗鼠多抗)中各孵育1 h，最后采用NBT/BCIP法對(duì)目標(biāo)條帶(AcMYB108a重組蛋白)進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿S20亞族基因的鑒定

比對(duì)結(jié)果(表1)顯示，在菠蘿基因組(F153品種)中共鑒定到5個(gè)S20亞族基因成員，分布在染色體Chr4、Chr5、Chr12、Chr18和Chr23上。不同菠蘿S20亞族基因的長(zhǎng)度差異較大，最短的基因(ID：109723847)長(zhǎng)度為1 672 bp，最長(zhǎng)的基因(ID：109728373)長(zhǎng)度為6 959 bp，平均長(zhǎng)度為3 025 bp。菠蘿S20亞族基因的平均GC含量為39.28%，與菠蘿基因組平均GC含量(38.2%)相近。S20亞族中GC含量最高的是ID為109709211的基因(45.54%)，GC含量最低的是ID為109728373的基因(34.14%)。

表1 菠蘿S20亞族基因的位置與核苷酸組成

2.2 菠蘿S20亞族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以菠蘿、水稻、玉米、番茄、擬南芥的S20亞族蛋白和作為外群的擬南芥S18、S19亞族蛋白序列為樣本，通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖1)可知：菠蘿、水稻、玉米、番茄等物種的S20亞族蛋白均與擬南芥S20亞族蛋白聚類(lèi)在一起，進(jìn)一步證實(shí)了本研究鑒定的S20亞族基因的可靠性；雙子葉植物擬南芥與番茄S20蛋白的親緣關(guān)系較近，單子葉植物水稻與玉米S20蛋白的親緣關(guān)系較近，而菠蘿S20蛋白則傾向于單獨(dú)聚類(lèi)；除番茄XP_004240646蛋白外，S20亞族蛋白可進(jìn)一步劃分為2大類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)由AtMYB62、AtMYB116、XP_004236420、XP_004239413、XP_020089219、XP_015633684、NP_001334575和NP_001141174組成，第Ⅱ類(lèi)由AtMYB2、AtMYB78、AtMYB108、AtMYB112等25個(gè)S20亞族蛋白組成，表明S20亞族蛋白間存在功能差異。

圖1 菠蘿S20亞族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 菠蘿S20亞族成員的基因結(jié)構(gòu)與啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過(guò)比對(duì)菠蘿基因組，確定了S20亞族基因轉(zhuǎn)錄本的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，大多數(shù)S20亞族基因(除ID為109728373的基因外)的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)較為相似，均由3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子與序列兩端的5′UTR和3′UTR序列組成，而ID為109728373的基因轉(zhuǎn)錄本由5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子(包括1個(gè)4 kb的長(zhǎng)內(nèi)含子)與UTR組成。啟動(dòng)子PlantCARE順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，菠蘿S20亞族基因啟動(dòng)子均具有MYB、MYC與STRE元件，各基因啟動(dòng)子還分別具有W box、WUN motif等逆境響應(yīng)元件，說(shuō)明菠蘿S20亞族基因與植物逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程有關(guān)。除ID為109723847的基因外，其余4個(gè)S20亞族基因的啟動(dòng)子具有ERE元件，表明乙烯可能誘導(dǎo)S20亞族基因表達(dá)并參與調(diào)控與S20亞族相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。

圖2 菠蘿S20亞族成員的基因結(jié)構(gòu)

圖中數(shù)字代表各基因具有的順式作用元件數(shù)量

2.4 菠蘿S20亞族基因的表達(dá)分析

檢索NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，選取注釋信息明確的PRJNA305042、PRJNA356904和PRJNA393610共3組RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中PRJNA305042為菠蘿根、葉、花、不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)(未成熟期果實(shí)UF-1、UF-2、UF-3，成熟期果實(shí)RF-1、RF-2)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；PRJNA393610為乙烯處理菠蘿莖尖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分為對(duì)照組(CK-1、CK-2、CK-3)、低乙烯組(LE-1、LE-2、LE-3)、高乙烯組(HE-1、HE-2、HE-3)；PRJNA356904為采后短時(shí)熱處理菠蘿果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括2個(gè)對(duì)照組(CK-1、CK-2)與2個(gè)熱處理組(ETP-1和ETP-2)。另外，本研究還分析了菠蘿果實(shí)褐變進(jìn)程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(即菠蘿果實(shí)褐變轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù))，包括對(duì)照組(CK-1、CK-2、CK-3)、即將褐變組(AB-1、AB-2、AB-3)、褐變組(BH-1、BH-2、BH-3)。根據(jù)菠蘿S20亞族成員的基因ID檢索上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取相關(guān)基因在不同條件下的表達(dá)水平。從基因表達(dá)熱圖(圖4)可以看出：1)菠蘿S20亞族基因的表達(dá)具有組織特異性，ID為109718059的基因在各時(shí)期菠蘿果實(shí)中的表達(dá)水平均顯著高于其他組織，而ID為109709211的基因在花、葉中的表達(dá)水平較高，ID為109723847的基因在菠蘿根中的表達(dá)水平較高；2)盡管S20亞族基因在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)(PRJNA393610)的整體表達(dá)水平較低，乙烯處理仍提高了部分S20亞族基因(ID為109709211和109728373)的表達(dá)量；3)菠蘿S20亞族基因的表達(dá)水平與果實(shí)采后劣變過(guò)程正相關(guān)，即其表達(dá)水平隨菠蘿果實(shí)采后劣變進(jìn)程的推移逐步升高，而采后短時(shí)熱處理不僅可以延緩菠蘿果實(shí)采后的劣變進(jìn)程，還可以降低菠蘿S20亞族基因的表達(dá)水平(PRJNA356904)。

TPM.每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本數(shù)

2.5 菠蘿S20亞族蛋白的序列分析

根據(jù)菠蘿S20亞族基因的蛋白序列，利用ExPASy的ProtParam功能分析相關(guān)蛋白的等電點(diǎn)與分子量。由表2可知，除ID為XP_020114354的蛋白外，菠蘿S20亞族其余蛋白的分子質(zhì)量(31.2～32.8 ku)及等電點(diǎn)(4.82～6.47)均較為接近；而ID為XP_020114354的蛋白的氨基酸數(shù)目顯著多于同家族蛋白，等電點(diǎn)也與其他蛋白存在較大差異；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，菠蘿S20亞族蛋白主要由α螺旋(33.45%～54.76%)與無(wú)規(guī)則卷曲(34.87%～56.21%)組成，其他結(jié)構(gòu)占比較小。TMHMM分析表明，所有菠蘿S20亞族蛋白均不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于膜蛋白或分泌蛋白。經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，所有菠蘿S20亞族蛋白均定位于細(xì)胞核，這與菠蘿S20蛋白為轉(zhuǎn)錄因子蛋白的生物學(xué)功能相符。

表2 菠蘿S20亞族蛋白的序列及結(jié)構(gòu)分析

2.6 菠蘿S20亞族蛋白的保守基序分析

保守基序(motif)是蛋白質(zhì)中一段高度保守的氨基酸殘基，同一家族蛋白通常具有相似的保守基序。為進(jìn)一步研究S20亞族蛋白的結(jié)構(gòu)特征，采用MEME軟件分析了菠蘿與擬南芥、水稻、玉米、番茄S20亞族蛋白的保守基序，并利用TBtools軟件繪制了S20亞族蛋白的保守基序分布圖。結(jié)果(圖5)顯示，motif3在所有植物的S20亞族蛋白間高度保守，同時(shí)擬南芥S18亞族蛋白(AtMYB21、AtMYB24)與S19亞族蛋白(AtMYB120等)均不具有motif3，推測(cè)motif3為S20亞族的特征motif，查詢Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步確認(rèn)motif3歸屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的MYB108亞族(PTHR45675:SF45)。

圖5 不同物種S20亞族蛋白的保守基序分析

2.7 菠蘿AcMYB108a的基因克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)基因表達(dá)分析結(jié)果，選取果實(shí)褐變過(guò)程中表達(dá)量最高的ID為109718059的基因進(jìn)行原核表達(dá)分析，參考數(shù)據(jù)庫(kù)與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果將該基因命名為AcMYB108a。以菠蘿無(wú)菌苗RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增AcMYB108a基因片段，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為750～1 000 bp(圖6)，與理論大小831 bp相符。pET28a-MYB108a的雙酶切結(jié)果和pET28a-MYB108R的雙酶切結(jié)果均在750～1 000 bp處出現(xiàn)一清晰酶切條帶，證明插入序列完全正確(圖6)。

M.DNA標(biāo)樣；1.AcMYB108a基因的擴(kuò)增結(jié)果；2.重組質(zhì)粒pET28a-MYB108a雙酶切結(jié)果；3.重組質(zhì)粒pET28a-MYB108R雙酶切結(jié)果

2.8 菠蘿AcMYB108a的原核表達(dá)

SDS-PAGE結(jié)果顯示，與IPTG誘導(dǎo)前菌樣相比，轉(zhuǎn)化pET28a-MYB108a、pET28a-MYB108R質(zhì)粒的Rossetta(DE3)菌株誘導(dǎo)2和4 h菌樣均在35～48 ku處鑒定到目的蛋白AcMYB108a，且pET28a-MYB108R的蛋白表達(dá)量明顯高于pET28a-MYB108a(圖7)，表明密碼子優(yōu)化提升了AcMYB108a重組蛋白的翻譯效率和表達(dá)量。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)前菌樣；2，3.分別為誘導(dǎo)2和4 h的菌樣

2.9 菠蘿AcMYB108a重組蛋白的Western blot驗(yàn)證

由于SDS-PAGE分析中目標(biāo)蛋白條帶的分子質(zhì)量(35～48 ku)大于AcMYB108a重組蛋白的理論分子質(zhì)量(約35 ku)，故需要對(duì)其進(jìn)行二次驗(yàn)證。本研究利用組氨酸標(biāo)簽(His-tag)抗體進(jìn)行Western雜交，結(jié)果在SDS-PAGE電泳提示的蛋白條帶位置檢測(cè)到顯色條帶(圖8)，證明該條帶確為AcMYB108a重組蛋白。唐威華等[20]認(rèn)為，重組蛋白表達(dá)中常用的組氨酸標(biāo)簽(具有較強(qiáng)正電荷)是造成重組蛋白在SDS-PAGE電泳中出現(xiàn)遷移率異常的主要原因，此外遷移率還與特定蛋白序列有關(guān)，DNA結(jié)合蛋白常發(fā)生遷移率異常現(xiàn)象。P73-His重組蛋白在SDS-PAGE電泳中的表觀分子質(zhì)量為33 ku，遠(yuǎn)大于其實(shí)際分子質(zhì)量17.3 ku[20]。蘋(píng)果轉(zhuǎn)錄因子MdHB1重組蛋白在電泳中的表觀分子質(zhì)量為55 ku，大于其實(shí)際分子質(zhì)量44.4 ku[21]。因此，AcMYB108a重組蛋白所具有的組氨酸標(biāo)簽與DNA結(jié)合域可能是造成本研究中重組蛋白表觀分子量大于其實(shí)際值的原因。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.誘導(dǎo)前菌樣；2，3.分別為誘導(dǎo)2和4 h的菌樣

3 討論與結(jié)論

S20亞族是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)重要分支，在植物組織發(fā)育與逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8,10,14-15,17]。本研究基于菠蘿基因組與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定到5個(gè)菠蘿S20亞族基因(其中ID為109709211的基因具有可變剪切)，數(shù)目與擬南芥(6個(gè))相近，但少于番茄(7個(gè))、水稻(7個(gè))和玉米(9個(gè))。研究菠蘿S20亞族成員的進(jìn)化與功能對(duì)于探討菠蘿逆境脅迫響應(yīng)與果實(shí)品質(zhì)形成具有重要意義。S20亞族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，菠蘿及其他物種的S20亞族蛋白均可分為2大類(lèi)群。這一方面說(shuō)明S20亞族蛋白在菠蘿與其他物種間具有較高的保守性，不同物種S20亞族蛋白均具有保守結(jié)構(gòu)域motif3就進(jìn)一步印證了這一點(diǎn)；另一方面說(shuō)明菠蘿S20亞族內(nèi)部各蛋白間也存在功能差異。不同物種的S20亞族蛋白數(shù)目不同，這可能是不同植物基因復(fù)制與進(jìn)化模式不同所致。

順式作用元件在基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，啟動(dòng)子中順式元件的類(lèi)型和數(shù)量直接影響著基因的表達(dá)模式。GST1基因、香蕉MA-ACS1和MA-ACO1基因的啟動(dòng)子區(qū)均具有乙烯響應(yīng)元件ERE，可接受外源乙烯的誘導(dǎo)[22-23]；極端pH、乙醇等脅迫信號(hào)經(jīng)由HOG信號(hào)通路作用于酵母相關(guān)基因啟動(dòng)子的STRE元件，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)[24]；Manimaran等[25]采用不同長(zhǎng)度的OsIPP3啟動(dòng)子(具有數(shù)量不同的順式作用元件)驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，證實(shí)GUS的表達(dá)水平隨著順式作用元件數(shù)量的減少而降低。本研究發(fā)現(xiàn)，菠蘿S20亞族基因的啟動(dòng)子區(qū)具有MYB、MYC、STRE等逆境響應(yīng)元件以及乙烯響應(yīng)元件ERE，初步說(shuō)明菠蘿S20亞族基因與逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)，并且乙烯參與調(diào)控S20亞族基因的表達(dá)及其相關(guān)生物學(xué)過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究基因結(jié)構(gòu)、功能與表達(dá)的重要手段。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了由基因芯片技術(shù)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(SAGE)、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(MPSS)到RNA測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)的跨越式發(fā)展。目前應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)是基于二代測(cè)序的RNA-seq技術(shù)，具有高分辨率、高通量與高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，利用RNA-seq鑒定不同品種或不同處理間的差異基因已成為發(fā)掘功能基因的常見(jiàn)思路[26-27]。本研究通過(guò)分析不同來(lái)源的RNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)，乙烯能誘導(dǎo)部分菠蘿S20亞族基因表達(dá)(PRJNA356904)；菠蘿S20亞族基因的表達(dá)水平與菠蘿果實(shí)的褐變進(jìn)程正相關(guān)，采后熱處理不僅延緩了菠蘿果實(shí)的褐變進(jìn)程，而且也抑制了其S20亞族基因的表達(dá)(PRJNA393610)。

為進(jìn)一步研究菠蘿S20亞族基因的生物學(xué)功能，闡明相關(guān)基因與菠蘿果實(shí)采后褐變的關(guān)聯(lián)性，本研究選取果實(shí)中表達(dá)水平最高的S20基因AcMYB108a，采用pET表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)AcMYB108a重組蛋白。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、繁殖快、蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)[28]。外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，受到片段GC含量、密碼子偏好性、誘導(dǎo)條件等多重因素的共同影響[29]。本研究針對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)菠蘿AcMYB108a的編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化，篩選了合適的誘導(dǎo)條件，成功誘導(dǎo)了AcMYB108a重組蛋白，并通過(guò)Western blot進(jìn)行了雜交驗(yàn)證。后續(xù)將進(jìn)一步表達(dá)、純化AcMYB108a重組蛋白，用于AcMYB108a的EMSA等試驗(yàn)。