任亞倩，莊孟穎，劉興健，吳小平，張君麗，鄭明鋒，傅俊生

(1 福建農(nóng)林大學 a 食品科學學院，b 生命科學學院,福建 福州 350002；2 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院 蔬菜研究所, 西藏 拉薩 850000)

繡球菌(Sparasiscrispa)隸屬擔子菌門、傘菌綱、多孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬[1]，其子實體玲瓏似花瓣，晶瑩剔透，呈白色或奶黃色，是一種珍貴的食藥用菌。多糖是繡球菌的主要活性成分之一，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、調節(jié)免疫[4]等功能。由于繡球菌子實體野生資源有限，目前雖已實現(xiàn)人工栽培，但其栽培周期長、生產(chǎn)成本高，這在很大程度上限制了繡球菌相關產(chǎn)品的開發(fā)及應用[5]。然而，菌絲體具有生產(chǎn)周期短、提取加工方便等特點，被認為是一種潛在可替代子實體擴大食用菌開發(fā)利用的有效途徑，因此如何促進繡球菌菌株快速生長，高效生產(chǎn)菌絲體就顯得至關重要[6]。

雙向發(fā)酵是一種通過添加藥性基質促進目的菌株快速生長的方法，具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高、不受環(huán)境限制、成本低等優(yōu)點，在真菌的發(fā)酵生產(chǎn)中應用廣泛[7]。解文利等[8]探究了銀杏葉對紫紅曲霉雙向發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)其可以促進紫紅曲霉的生長。胡永樂等[9]研究了厚樸對蛹蟲草雙向液體發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)其能在短時間內(nèi)有效地提高蛹蟲草菌絲體生物量并釋放各類代謝產(chǎn)物。

馬尾松松針是松科植物馬尾松(PinusmassonianaLamb)的葉[10]，是一種重要的中藥材，其主要活性成分為揮發(fā)油類、木脂素類、黃酮類等，具有祛風活血、明目安神等功效[11-12]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松松針能夠有效地促進繡球菌菌絲體的生長，但目前還未見關于馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對菌絲體生產(chǎn)影響的研究。為進一步提高繡球菌菌絲體生物量，本研究采用單因素試驗和正交試驗對馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵的條件進行了優(yōu)化，并對菌絲體多糖的抗氧化活性進行了分析，以期為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 繡球菌菌種，由福建農(nóng)林大學生命科學學院田間1-11試驗室保藏，菌株編號RY01。

1.1.2 試劑和儀器 葡萄糖、蛋白胨、瓊脂等試劑，均為國產(chǎn)分析純試劑；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，購于Sigma公司。主要儀器有電熱鼓風干燥箱 (DHG-9070A，常州普天儀器制造有限公司)、高速萬能粉碎機(GN20，杭州旭眾機械設備有限公司)、恒溫搖床 (KH-300，常州市凱航儀器有限公司)、電子天平(FA104，上海力辰儀器科技有限公司)、pH計(PHS-3C，上海儀天科學儀器有限公司)和紅外光譜儀(德國Bruker有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1) 基礎培養(yǎng)基的制備。將土豆200 g于1.2 L沸水煮沸30 min，用3層紗布過濾，收集土豆浸提液，依次加入葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂2 g，攪拌溶解，加水定容至1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

(2) 繡球菌液體菌種制備。將繡球菌菌株接種于裝有100 mL基礎培養(yǎng)基的錐形瓶中，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)20 d，用無菌水稀釋，調整菌液質量濃度為50 g/L，備用。

1.1.4 馬尾松松針粉 馬尾松松針采自福建農(nóng)林大學中華名特優(yōu)植物園。將采摘的馬尾松松針于50 ℃烘干，粉碎后過孔徑0.175 mm的標準篩，備用。

1.2 雙向液體發(fā)酵單因素試驗

采用單因素試驗分別探究馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時間、繡球菌接種量及發(fā)酵液pH對繡球菌菌絲體生物量的影響。

1.2.1 馬尾松松針粉添加量 于90 mL基礎培養(yǎng)基中分別加入50，75，100，125，150 mg馬尾松松針粉，121 ℃滅菌30 min后，冷卻至室溫，然后每個搖瓶中接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，最終培養(yǎng)基中馬尾松松針粉添加量分別0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)16 d后，測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次，結果取平均值。菌絲體生物量的測定：對液體發(fā)酵產(chǎn)物于25 ℃條件下抽濾3 h，分離發(fā)酵液和菌絲體，用蒸餾水反復沖洗菌絲體至表面無馬尾松松針粉末殘留，用濾紙吸干表面殘留水分，于50 ℃烘干后稱質量。

1.2.2 發(fā)酵時間 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，121 ℃高壓滅菌30 min后，冷卻至室溫，然后每個搖瓶接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，于25 ℃、160 r/min條件下分別培養(yǎng)12，16，20，24，28，32 d，測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.3 繡球菌接種量 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，分別接入不同體積50 g/L的繡球菌液體菌種，控制培養(yǎng)基總體積為100 mL，繡球菌的最終接種量分別為25，50，75，100，125，150 mL/L，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d，測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 發(fā)酵液pH 于90 mL基礎培養(yǎng)基中加入125 mg馬尾松松針粉(最終添加量為1.25 g/L)，用氫氧化鈉和鹽酸分別調節(jié)pH至4，5，6，7和8，121 ℃滅菌30 min，冷卻至室溫，然后每個搖瓶接入10 mL質量濃度為50 g/L的繡球菌液體菌種(最終接種量為100 mL/L)，于25 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)24 d，測定菌絲體生物量。每組試驗重復3次，結果取平均值。

1.3 雙向液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

基于雙向液體發(fā)酵單因素試驗結果，以菌絲體生物量為考察指標，對馬尾松松針粉添加量、發(fā)酵時間、接種量和發(fā)酵液pH進行4因素3水平的正交試驗，篩選最佳發(fā)酵條件。試驗設計見表1。

表1 繡球菌液態(tài)發(fā)酵條件正交試驗因素及水平

在正交試驗優(yōu)化得到最佳條件的基礎上，控制其他條件一致，試驗設置了馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組(以下簡稱雙向發(fā)酵組)和未添加馬尾松松針粉的對照組2個處理，每組3個重復，對最佳條件進行驗證。

1.4 菌絲體多糖制備

以未添加馬尾松松針粉的處理為對照組，參照李瑞雪等[13]的方法，將烘干后的對照組和雙向發(fā)酵組繡球菌菌絲體粉碎，過孔徑0.175 mm的標準篩，取一定量菌絲體粉末，按料液比1 (g)∶30 (mL)比例加入蒸餾水，90 ℃提取3 h，離心收集上清液后旋蒸濃縮，4 ℃醇沉過夜，收集沉淀，加水復溶后，采用Sevage法除去蛋白雜質，冷凍干燥得到繡球菌菌絲體多糖(Sparassiscrispapolysaccharides，SCP)。

1.5 菌絲體多糖的結構分析

參照李晉等[14]的方法，分別稱取對照組和雙向發(fā)酵組SCP粉末2 mg，加入200 mg烘干至恒質量的KBr粉末，混勻后充分研磨，利用壓模機壓成片后，采用紅外光譜對其進行結構表征。

1.6 菌絲體多糖的抗氧化活性分析

1.6.1 對ABTS自由基清除率 參考雷燕妮等[15]的方法并略作調整進行試驗。配置雙向發(fā)酵組不同質量濃度(0.25，0.5，1，2，4 mg/mL)的SCP溶液，以相同質量濃度的維生素C為對照，測定SCP對ABTS自由基清除率。具體方法為：在試管中分別加入0.8 mL的ABTS工作液和0.2 mL不同質量濃度的樣品溶液，振蕩混勻10 s，于25 ℃條件下避光反應6 min，在波長734 nm處測定吸光值(Ai)，以蒸餾水分別替代樣品溶液和ABTS工作液，在波長734 nm處測定吸光值(分別記為Aj和Aij)。每組試驗重復3次，結果取平均值。計算ABTS自由基的清除率：

ABTS自由基清除率=[1-(Ai-Aij)/Aj]×100%。

1.6.2 對羥基自由基的清除率 參考Lai等[16]的方法并略作調整進行試驗。以相同質量濃度的維生素C為對照，采用水楊酸-硫酸亞鐵法測定SCP對羥基自由基的清除率。具體方法為：在試管中依次加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L的FeSO4溶液、不同質量濃度的樣品溶液和8.8 mmol/L的H2O2溶液各0.1 mL，加蒸餾水補足至1 mL，渦旋混勻5 s，于37 ℃條件下反應30 min，在波長510 nm處測定吸光度(Aa)，以0.1 mL蒸餾水分別替代樣品溶液和H2O2溶液，于波長510 nm處測定吸光度(分別記為Ab和Aab)。每組試驗重復3次，結果取平均值。計算SCP對羥基自由基的清除率：

羥基自由基清除率=[1-(Aa-Aab)/Ab]×100%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。采用SPSS 24.0軟件分析處理，組間比較采用Duncan’s檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同單因素對繡球菌液體發(fā)酵的影響

2.1.1 馬尾松松針粉添加量 圖1顯示，當馬尾松松針粉添加量為0.50～1.25 g/L時，繡球菌菌絲體的生物量隨著松針粉添加量的增加而顯著提高；當松針粉添加量大于1.25 g/L時，繡球菌菌絲體生物量趨于穩(wěn)定，從節(jié)約資源的角度考慮，馬尾松松針粉添加量選取1.25 g/L較為合適。

2.1.2 發(fā)酵時間 圖2顯示，當發(fā)酵時間為12～24 d時，繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加；當發(fā)酵時間超過24 d，隨著發(fā)酵時間的延長菌絲體生物量不再發(fā)生顯著變化。從縮短發(fā)酵周期的角度考慮，發(fā)酵時間選取24 d較為合適。

圖柱上標不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同

2.1.3 繡球菌接種量 圖3顯示，當繡球菌接種量為25～100 mL/L時，繡球菌菌絲體生物量隨著接種量的增大而顯著增加；接種量大于100 mL/L時，菌絲體生物量呈下降趨勢，這可能與菌株在單位體積內(nèi)對營養(yǎng)成分的過度競爭致使培養(yǎng)基中溶氧不足，菌絲體的生長受到抑制有關。因此，選取100 mL/L為繡球菌適宜接種量。

圖3 繡球菌接種量對菌絲體生物量的影響

2.1.4 發(fā)酵液pH 圖4顯示，在供試pH范圍內(nèi)，繡球菌菌絲體生物量隨著pH的提高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH為5時，菌絲體生物量達到最高。因此，發(fā)酵液pH設定為5較為合適。

2.2 繡球菌雙向液體發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

表2顯示，馬尾松松針粉添加量中k3最大，發(fā)酵時間中k2最大，pH中k1最大，接種量中k3最大，此條件(第8試驗組)下菌絲體生物量最高。試驗過程中觀察菌絲顏色及大小情況發(fā)現(xiàn)，第3試驗組和第7試驗組菌絲體顏色偏黃，且菌球顆粒大小不一；第8試驗組菌絲體顏色偏白，且顆粒均勻。綜上可以得出，繡球菌雙向液體發(fā)酵的最佳條件為：馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時間24 d、pH 4、接種量125 mL/L，在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達到(11.25±0.18) g/L。

表2 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗結果

表2顯示，4個單因素中，pH的極差(R)最大，馬尾松松針粉添加量次之，接種量和發(fā)酵時間均較小，表明影響雙向液體發(fā)酵產(chǎn)繡球菌菌絲體的主要因素是pH和馬尾松松針粉添加量。結合方差分析結果(表3)可知，pH的F值最大，為404.209；馬尾松松針粉添加量的F值次之，為15.589；接種量和發(fā)酵時間的F值均較小，分別為8.051和0.401。由R值和F值可知，4個因素對銹球菌菌絲體生物量影響大小的順序為：發(fā)酵液pH>馬尾松松針粉添加量>繡球菌接種量>發(fā)酵時間。

表3 繡球菌雙向液體發(fā)酵正交試驗結果的方差分析

2.3 繡球菌雙向液體發(fā)酵最佳條件的驗證

在2.2節(jié)正交試驗得到的最佳條件下，馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵組菌絲體生物量可達(11.16±0.22) g/L，與未添加馬尾松松針粉的對照組((4.26±0.19) g/L)相比，菌絲體生物量顯著提高了約162.10%，可知馬尾松松針能夠顯著地提高繡球菌菌絲體的生物量。

2.4 繡球菌菌絲體多糖的結構分析

圖5結果顯示，雙向液體發(fā)酵獲得的繡球菌菌絲體多糖紅外光譜主要特征吸收峰與對照組一致，說明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對菌絲體多糖的結構影響較小。

圖5 雙向液體發(fā)酵繡球菌菌絲體多糖的紅外光譜分析

2.5 繡球菌菌絲體多糖的抗氧化活性分析

圖6-A結果顯示，在設定質量濃度范圍內(nèi)，SCP對ABTS自由基的清除能力隨其質量濃度的增大而不斷增強，當SCP質量濃度為4 mg/mL時，其對ABTS自由基清除率可達到99.72%。由圖6-B可知，在設定質量濃度范圍內(nèi)，SCP對羥基自由基的清除率隨其質量隨濃度的增大而不斷提高，當SCP質量濃度為4 mg/mL時，其對羥基自由基的清除率可達到68.22%。

圖柱上標不同小寫字母表示同一種物質不同質量濃度間差異顯著(P<0.05)

3 討論與結論

液體發(fā)酵技術是菌株擴繁的重要方法，但傳統(tǒng)液體發(fā)酵手段難以實現(xiàn)菌株的高效快速生長，雙向液體發(fā)酵是利用中藥材所富含的活性成分刺激菌絲體的生長，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)菌株的快速繁殖[17]?；陔p向發(fā)酵的原理，本試驗嘗試通過馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵來提高菌絲體的生物量。單因素試驗發(fā)現(xiàn)，當馬尾松松針粉添加量大于1.25 g/L，菌絲生物量不再明顯提高，這可能是由于馬尾松松針中的活性成分在達到一定量后對繡球菌菌絲體生長的促進作用達到了平臺期。當發(fā)酵時間超過24 d后，繡球菌菌絲體生物量隨著發(fā)酵時間的延長而下降，這可能是由于發(fā)酵后期培養(yǎng)基中溶氧量降低從而引起菌絲體老化自溶所致。當接種量為125～150 mL/L時菌絲體生物量明顯下降，這可能是由于接種量過大，菌株對物質能量的消耗過快，導致單位體積培養(yǎng)體系內(nèi)營養(yǎng)成分和溶氧不足，使得菌絲體的生長受到抑制[18]。當pH≥6時，繡球菌菌絲體生物量顯著下降，可知偏中性或堿性環(huán)境對其生長產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，且發(fā)酵中后期菌球顏色逐漸加深，呈現(xiàn)不同程度的灰色，菌絲幾乎無法生長，這可能是由于pH的升高抑制了與菌株生長相關的酶的活性[19]，此時馬尾松松針粉不能發(fā)揮對繡球菌菌絲生長的促進作用。

采用正交試驗進一步優(yōu)化馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵條件，得到最佳發(fā)酵條件為：馬尾松松針粉添加量1.25 g/L、發(fā)酵時間24 d、接種量125 mL/L、pH為4，在此條件下繡球菌菌絲體生物量可達11.16 g/L。已有關于繡球菌液體培養(yǎng)的研究多集中于發(fā)酵條件的優(yōu)化，2006年Kurosumi等[20]研究得出繡球菌的液體培養(yǎng)條件為：葡萄糖添加量為30 g/L、pH值為5，該條件下菌絲體的產(chǎn)量可達7.95 g/L。胡爽[21]對繡球菌突變菌株液體培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，使菌絲體的生物量較優(yōu)化前提高了約60%。本研究利用雙向發(fā)酵原理探究馬尾松松針對繡球菌菌絲體生長的影響，試驗結果表明，馬尾松松針可以顯著促進繡球菌菌絲體的生長，與對照組相比，雙向發(fā)酵組菌絲體生物量提高了約162.10%。

為探究馬尾松松針是否會對繡球菌菌絲體多糖的結構產(chǎn)生影響，本試驗進一步對添加馬尾松松針與未添加馬尾松松針發(fā)酵的繡球菌菌絲體多糖的結構進行了紅外光譜分析。結果表明，兩組菌絲體多糖的紅外光譜主要吸收峰一致，表明馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵對繡球菌菌絲體多糖的結構影響較小。多糖作為繡球菌的重要活性成分，一直是科研工作者探究的熱點之一。于韋韋[22]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖可通過誘導乳腺癌細胞凋亡抑制腫瘤生長；高淵等[23]研究發(fā)現(xiàn)，繡球菌多糖可能通過調控機體氨基酸代謝和脂質代謝緩解高脂血癥大鼠的血脂異常。在繡球菌多糖的活性功能探究中，關于菌絲體多糖抗氧化活性的研究相對較少，因此本試驗對其抗氧化活性進行了研究，結果顯示，繡球菌菌絲體多糖對ABTS自由基、羥基自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量依賴性，具有較好的抗氧化能力。機體氧化代謝過程中產(chǎn)生的活性氧自由基過量時會誘發(fā)脂質過氧化，導致細胞膜和核酸的氧化損傷，進而造成免疫力下降，引發(fā)多種疾病[24-25]。目前越來越多的研究表明，多糖具有良好的自由基清除能力和抑制脂質過氧化作用，初步認為多糖的抗氧化能力與其結構、官能團、分子量、單糖組成等有關[26]，本試驗對繡球菌多糖的結構及單糖組分未進行深入研究，后續(xù)試驗可通過多糖分離純化、結構解析結合細胞試驗進一步探究其抗氧化機理。

綜上，馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵可有效提高繡球菌菌絲體生物量，在最適條件下其菌絲體生物量可達11.16 g/L，而且所得菌絲體多糖具有良好的抗氧化活性。馬尾松松針-繡球菌雙向液體發(fā)酵方法為繡球菌菌絲體的高效生產(chǎn)提供技術支持。