史欣儀，殷浩文，胡傳銀，鐘潤(rùn)芳，張?jiān)娏?，趙云濤，陳紹紅

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心/廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023）

卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）是指女性40 歲之前出現(xiàn)卵巢功能衰退、月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)，并伴有雌激素分泌低下、促性腺激素水平較高等現(xiàn)象，甚至?xí)?dǎo)致喪失生育能力，且低水平的雌激素會(huì)增加骨質(zhì)疏松、血管疾病的患病率，對(duì)女性的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[1]。近年來(lái)，POF 的發(fā)病呈現(xiàn)年輕化且逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，在人群中的發(fā)病率達(dá)1%～2%，其中90%的病例病因仍未明確，10%的病例與自身免疫、感染、基因和醫(yī)源性等有關(guān)[2]。POF 的病因復(fù)雜，至今尚未有完全有效的治療方案。臨床上，激素替代療法（hormone replacement therapy,HRT）是一種廣泛應(yīng)用改善POF 的治療方法。HRT 有助于通過(guò)抑制負(fù)反饋調(diào)節(jié)的下丘腦-垂體-性腺軸分泌促卵泡刺激素（FSH）和促黃體生成素（LH），從而減少高水平FSH 對(duì)卵巢的破壞作用[3]。然而，長(zhǎng)期應(yīng)用HRT 會(huì)引起一系列的副作用如惡心、皮疹、子宮內(nèi)膜癌、心血管疾病等[4]。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）是一種烷基化藥物，廣泛應(yīng)用于癌癥和自身免疫性疾病的化療方案[5]。研究表明，注射CTX 會(huì)引起大鼠動(dòng)情周期紊亂、降低雌二醇（E2）水平、促進(jìn)FSH 的分泌，CTX 通過(guò)破壞卵母細(xì)胞，引起卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，并加速卵泡衰竭和卵巢嚴(yán)重的血管損傷，形成卵巢間質(zhì)纖維化，對(duì)卵巢造成不可逆的損害[6]。研究發(fā)現(xiàn)，CTX 可誘導(dǎo)卵巢的顆粒細(xì)胞發(fā)生過(guò)度自噬，卵泡閉鎖，從而使卵巢的儲(chǔ)備功能降低，造成POF[7]。小鼠通過(guò)注射CTX 所引起的卵巢功能衰退，卵巢組織形態(tài)學(xué)和激素水平的變化與臨床醫(yī)學(xué)POF 患者的病癥相似，因此可通過(guò)注射一定量的CTX 來(lái)建立小鼠POF模型，用于實(shí)驗(yàn)研究。

半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum）歸屬褐藻門(mén)、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬，廣泛分布于我國(guó)東海、南海沿岸。半葉馬尾藻中巖藻聚糖硫酸酯（fucoidan,SPF）含量豐富，研究表明巖藻聚糖硫酸酯具有多種不同的生物活性，包括抗凝血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌活性、抗肥胖等[8-13]。近期研究發(fā)現(xiàn)，海地瓜SPF 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TLRs/MyD88 信號(hào)通路來(lái)改善CTX 造成的小鼠小腸黏膜損傷[14]。目前，SPF對(duì)POF的影響尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探索SPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的POF小鼠模型是否有保護(hù)作用，為治療POF尋找新的治療途徑與方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 半葉馬尾藻SPF 制備 半葉馬尾藻采摘于廣東省湛江市硇洲島低潮帶巖石上，經(jīng)廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院謝恩義教授鑒定確認(rèn)為半葉馬尾藻。半葉馬尾藻經(jīng)過(guò)沖洗、干燥、粉碎后通過(guò)超聲波浸提工藝提取SPF，采用乙醇分級(jí)沉淀法分離純化，再經(jīng)過(guò)脫脂和脫蛋白的工藝得到初步純化的SPF，具體制作方法參照諶素華等[15]的提取方法。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 27 只7～8 周齡ICR 雌性小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2018-0002，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將小鼠飼養(yǎng)在（23±2）℃相對(duì)濕度40%～70%環(huán)境下進(jìn)行12 h 光照和12 h 黑暗循環(huán)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)施自由飲食和飲水。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行（批準(zhǔn)文號(hào)：2019090502）。

1.1.3 主要試劑 CTX（C3250000）購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；小鼠FSH、E2酶聯(lián)免疫試劑盒（H101-1-2，ML-elisa-A11412）分別購(gòu)于南京建成生物科技有限公司和上海酶聯(lián)生物科技有限公司；瑞氏-姬姆薩染色液（PH1793）購(gòu)于福州Phygene 公司；BCA 試劑盒（23225）購(gòu)于上海博彩生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（A001-3-2,A003-1-2）購(gòu)于南京建成生物科技有限公司；兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（LC-3）抗體（NB910-40752）購(gòu)于美國(guó)Novus 公司；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體和HRP 標(biāo)記抗兔二抗（2118L,7074S）購(gòu)于美國(guó)Cell signaling technology公司；化學(xué)發(fā)光液（ECL）試劑盒（08-110）購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及POF 模型建立 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將27只ICR小鼠隨機(jī)分為3組：空白組（Con）、模型組（CTX）、實(shí)驗(yàn)組（CTX+SPF）。CTX組和CTX+SPF均連續(xù)2 d腹腔注射CTX 70 mg/（kg·d）[16]，Con 組注射等量生理鹽水。建模后第1天，CTX+SPF組小鼠給予200 mg/（kg·d）的SPF 灌胃治療，Con 組和CTX 組給予生理鹽水（1 mL/100 g），連續(xù)灌胃4 周，每周稱(chēng)質(zhì)量1次。

1.2.2 動(dòng)情周期觀察 小鼠灌胃治療2 周后，連續(xù)2周取陰道脫落細(xì)胞涂片觀察小鼠動(dòng)情周期的變化。使用加樣槍吸取30 μL 生理鹽水反復(fù)沖洗小鼠陰道并涂片，涂片自然干燥后，用50 μL 甲醇固定細(xì)胞，瑞氏-姬姆薩染色后，在顯微鏡下觀察[3]。

1.2.3 卵巢和脾臟指數(shù) 小鼠連續(xù)治療4周后，于小鼠動(dòng)情間期采用小鼠頸椎脫位處死法處死小鼠，剖腹取出小鼠卵巢和脾臟。冰浴條件下，剝離卵巢和脾臟周?chē)鷼埩舻闹窘M織后，迅速置于分析天平上精密稱(chēng)重記錄。

1.2.4 血清中性激素濃度測(cè)定 注射10%（φ）水合氯醛麻醉小鼠，采用心臟取血法收集血液，靜置1 h后，以5 000 r/min，4 ℃冷凍離心15 min，取血清并于-20 ℃凍存，ELISA 法檢測(cè)小鼠血清中E2及FSH激素水平。檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 生化分析 將收集的卵巢組織置于2 mL離心管，每管加入300 μL RIPA+3 μL PMSF+3 μL PI，并放入2顆鋼珠，在預(yù)冷的組織破碎機(jī)上將卵巢破碎，取出，12 000 r/min 離心10 min，取上清液。參照說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)，使用BCA試劑盒測(cè)定上清液中蛋白濃度后，使用SOD 試劑盒和MDA 試劑盒測(cè)定卵巢組織中SOD活性和MDA水平。

1.2.6 Western blot分析 Western blot分析參照文獻(xiàn)[17]報(bào)道并加以適當(dāng)?shù)男薷?。卵巢組織預(yù)處理參考“1.2.5”，按照樣品上清液體積加入1/3 體積的4×蛋白上樣緩沖液，混勻，煮沸5 min，冷卻后置于-20 ℃冰箱中保存。卵巢組織蛋白經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯薄膜（PVDF）上。經(jīng)過(guò)封閉、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜后，化學(xué)發(fā)光液孵育PVDF膜，于化學(xué)發(fā)光成像儀成像。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示。組間比較使用單因素方差分析，所有檢驗(yàn)均采取T多重比較法進(jìn)行二次檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPF對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠建模前各組體質(zhì)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，注射CTX 建模后體質(zhì)量都有大幅度的下降，但Con 組的下降程度比CTX 組及CTX+SPF 組低，通過(guò)灌胃治療后，小鼠體質(zhì)量均緩慢上升。連續(xù)灌胃治療2 周后，CTX 組和Con 組體質(zhì)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；灌胃治療3 周后，CTX 組和CTX+SPF 組體質(zhì)量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示小鼠CTX 建模成功，且SPF 具有改善CTX造成的小鼠體質(zhì)量下降的作用。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠的體質(zhì)量變化Table 1 Body weight changes of mice in each group(±s,n=9)m/g

表1 各組小鼠的體質(zhì)量變化Table 1 Body weight changes of mice in each group(±s,n=9)m/g

與Con組比較：*P<0.05，**P<0.01；與CTX組比較：#P<0.05。

5周29.38±0.93 27.16±1.34**28.83±1.71#組別Con CTX CTX+SPF 0 27.11±1.13 26.8±1.61 27.3±1.32 1周24.18±0.97 23.02±1.10 23.65±1.36 2周28.67±1.30 26.66±1.60**27.86±1.06 3周28.77±1.15 26.99±1.82*28.83±1.69#4周29.08±0.98 27.11±1.30**28.86±1.28#

2.2 SPF對(duì)小鼠動(dòng)情周期的影響

小鼠一個(gè)完整的動(dòng)情周期包括4個(gè)部分：動(dòng)情間期、動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期。各期間對(duì)應(yīng)的小鼠陰道脫落細(xì)胞的形態(tài)不同。動(dòng)情間期：小鼠卵巢上黃體開(kāi)始功能性退化，陰道涂片的細(xì)胞中幾乎全是白細(xì)胞；動(dòng)情前期：小鼠卵泡開(kāi)始發(fā)育，陰道涂片中多數(shù)為橢圓形的有核上皮細(xì)胞，少數(shù)白細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞；動(dòng)情期：小鼠卵泡發(fā)育成熟，陰道涂片中幾乎全是無(wú)核的角化鱗片狀細(xì)胞，細(xì)胞呈大而扁平的形狀，邊緣不整齊；動(dòng)情后期：小鼠卵巢中生成黃體，陰道涂片中細(xì)胞形態(tài)混雜，同時(shí)含有有核上皮細(xì)胞、無(wú)核鱗片狀上皮細(xì)胞和白細(xì)胞[18]。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠動(dòng)情周期各階段脫落細(xì)胞示意圖（瑞氏-姬姆薩染色，標(biāo)尺：100 μm）Figure 1 Cast-off cells at each stage of estrous cycle in mice（Wrignt's-Giemsa Stain，bar：100 μm）

本實(shí)驗(yàn)中，以動(dòng)情周期在4～5 d 且各周期分布均勻?yàn)檎Ｖ芷?，周?4 d 或>5 d 且周期紊亂為不正常周期。Con 組小鼠均維持正常的動(dòng)情周期，CTX 組中有77.78%的小鼠動(dòng)情周期紊亂，CTX+SPF 組動(dòng)情周期紊亂的占22.22%，提示SPF 能夠有效改善CTX造成的動(dòng)情周期紊亂。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠動(dòng)情周期的變化Figure 2 Changes of estrous cycle of mice in each group（n=9）

2.3 SPF對(duì)小鼠卵巢指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

CTX組小鼠與Con組小鼠的卵巢指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明CTX可以降低小鼠的卵巢指數(shù)，對(duì)小鼠的卵巢造成一定的損傷。CTX+SPF組小鼠的卵巢指數(shù)與CTX 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明SPF 能夠有效改善CTX 誘導(dǎo)的小鼠卵巢損傷。CTX組小鼠的脾臟指數(shù)與Con組小鼠比較、CTX+SPF 組小鼠的脾臟指數(shù)與CTX 組小鼠比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明CTX會(huì)對(duì)小鼠的脾臟造成損傷，降低機(jī)體的免疫能力，而SPF治療后能夠有效增加小鼠的脾臟指數(shù)，減少CTX 對(duì)脾臟造成的損傷，提高小鼠的免疫能力。見(jiàn)圖3。

圖3 SPF對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Figure 3 Effect of SPF on organ index in mice(±s,n=9)

2.4 SPF對(duì)小鼠性激素分泌的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠注射CTX 會(huì)顯著升高血清中FSH、減少E2的分泌（P<0.01），對(duì)小鼠的激素分泌水平造成影響，說(shuō)明CTX 會(huì)對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸產(chǎn)生干擾，影響小鼠的正常生長(zhǎng)發(fā)育。與CTX 組相比，SPF能夠有效地減少FSH的分泌和增加E2的分泌（P<0.05），緩解CTX對(duì)小鼠造成的損傷。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠的激素水平變化Figure 4 Hormone level changes of mice in each group(±s,n=3)

2.5 SPF對(duì)小鼠卵巢SOD和MDA的影響

與Con組比較，CTX 組小鼠卵巢的SOD 活性顯著降低（P<0.01），MDA 含量顯著增加（P<0.01），這表明CTX 破壞了小鼠卵巢中氧化還原反應(yīng)的平衡。經(jīng)過(guò)SPF 灌胃治療后，CTX+SPF 小鼠卵巢的SOD活性顯著上升（P<0.05），MDA 含量顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 SPF對(duì)小鼠卵巢SOD和MDA的影響Figure 5 Effect of SPF on SOD and MDA in ovary of mice(±s,n=3)

2.6 SPF對(duì)卵巢LC3蛋白的影響

細(xì)胞的自噬水平以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ為指標(biāo)，比值增大時(shí)，其自噬水平提高，比值減少時(shí)，其自噬水平降低。CTX組小鼠卵巢中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大（P<0.05），且LC3 蛋白的含量升高；CTX+SPF 組小鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減?。≒<0.05），且LC3蛋白的含量減少，其自噬水平明顯降低，說(shuō)明SPF能夠有效抑制細(xì)胞的自噬，維持機(jī)體平衡。見(jiàn)圖6。

圖6 SPF對(duì)卵巢LC3蛋白的影響Figure 6 Effect of SPF on ovarian LC3 protein(±s,n=4)

3 討論

POF 不僅會(huì)對(duì)卵巢的功能造成影響，還會(huì)影響機(jī)體的內(nèi)分泌平衡，導(dǎo)致其他器官和系統(tǒng)也造成一定的損傷[19]，營(yíng)養(yǎng)療法（nutritherapy）是預(yù)防和干預(yù)POF 的重要途徑之一。研究表明，半葉馬尾藻中SPF 含量豐富，且SPF 具有多種不同的生物活性，包括抗凝血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌活性、抗肥胖等。本實(shí)驗(yàn)研究了半葉馬尾藻SPF 在CTX 誘導(dǎo)的小鼠POF的作用及相關(guān)機(jī)制。

結(jié)果顯示，腹腔注射CTX后，小鼠的體質(zhì)量第2周開(kāi)始出現(xiàn)大幅度下降，灌胃SPF 后能夠明顯改善POF小鼠的體質(zhì)量下降。卵巢指數(shù)能夠反映小鼠的卵巢功能，且小鼠的動(dòng)情周期也是受卵巢功能調(diào)控的一項(xiàng)生理反應(yīng)，當(dāng)卵巢功能受到破壞時(shí)，其卵巢質(zhì)量會(huì)有所降低且動(dòng)情周期也會(huì)發(fā)生紊亂。表明SPF能夠增加由CTX 造成的卵巢質(zhì)量下降，并且能有效改善動(dòng)情周期的規(guī)律性。另一方面，SPF 還能通過(guò)改善小鼠脾臟指數(shù)，增強(qiáng)小鼠自身的免疫能力[20]。

卵巢內(nèi)分泌水平是反映卵巢功能的間接指標(biāo)，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控著其各種激素的分泌水平，即下丘腦通過(guò)分泌促性腺激素釋放激素（GnRH）作用于垂體，并促使垂體分泌FSH 等激素，正反饋?zhàn)饔糜诼殉?，從而使卵巢分泌E2，當(dāng)E2分泌的含量過(guò)高時(shí)，通過(guò)負(fù)反饋抑制GnRH和FSH，從而維持正常的激素水平[3，21]。正常女性體內(nèi)的激素水平是在一定范圍內(nèi)上下波動(dòng)，維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。動(dòng)情周期也是受到激素水平的調(diào)節(jié)，從而出現(xiàn)有規(guī)律的周期變化。FSH 的作用主要是促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞分化成熟，控制卵泡的發(fā)育，當(dāng)FSH 的含量偏高時(shí)，其促進(jìn)卵泡的過(guò)早成熟及提早排放，造成卵泡的衰竭[22]。E2是卵巢內(nèi)成熟卵泡分泌的一種雌激素，其作用是促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖分化，調(diào)控顆粒細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)類(lèi)固醇激素水平等，當(dāng)E2分泌水平過(guò)低時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體的性功能及女性第二特征等造成影響。FSH和E2被視為評(píng)價(jià)卵巢功能的重要指標(biāo)，當(dāng)FSH 的分泌水平過(guò)高且E2的分泌水平過(guò)低時(shí)，可初步判斷出其卵巢的儲(chǔ)備功能，對(duì)判斷卵巢早衰有重要的作用[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SPF 能夠顯著改善由CTX 造成的FSH 升高、E2降低的現(xiàn)象，表明SPF 可直接或間接作用于下丘腦-垂體-卵巢性腺軸，從而調(diào)節(jié)內(nèi)分泌水平，緩解POF的影響。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在POF 的發(fā)生中有一定的作用。SOD 是一種存在于生物體中的抗氧化金屬酶，在機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)平衡中起到重要作用。而MDA 是氧自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，MDA 水平的變化反映了氧化應(yīng)激作用[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，CTX 組小鼠卵巢中SOD 活性顯著下降（P<0.01），MDA水平顯著上升（P<0.01），這與Zhao等[3]報(bào)道的一致。提示SPF 具有抗氧化功能，因此推測(cè)半葉馬尾藻SPF 可能改善CTX 誘導(dǎo)的小鼠卵巢氧化應(yīng)激作用。

自噬是維持機(jī)體內(nèi)平衡的一種方式，通過(guò)降解衰老或損傷的細(xì)胞或器官，使機(jī)體能夠正常運(yùn)行[26]。研究表明，當(dāng)自噬機(jī)制啟動(dòng)時(shí)，機(jī)體內(nèi)的LC3-Ⅰ會(huì)向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，因此機(jī)體自噬水平的大小可通過(guò)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的大小來(lái)衡量，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大時(shí)，機(jī)體的自噬水平提高，相反LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減小時(shí)，機(jī)體的自噬水平降低。自噬對(duì)機(jī)體的正常運(yùn)行起一定的作用，但當(dāng)自噬水平過(guò)高時(shí)，機(jī)體的正常細(xì)胞或器官受到溶解，破壞機(jī)體的內(nèi)平衡[27]。當(dāng)組織中的自噬水平增高，其可能是由于卵巢顆粒細(xì)胞或卵母細(xì)胞的過(guò)度自噬，造成卵泡衰竭，從而導(dǎo)致卵巢早衰[28]。本研究表明，CTX 處理后的小鼠卵巢組織中的自噬水平增高，而經(jīng)過(guò)SPF 治療后的小鼠，能夠顯著降低小鼠的自噬能力，并維持在正常的水平。因此，SPF可能通過(guò)恢復(fù)小鼠的自噬水平，保護(hù)卵泡細(xì)胞，從而預(yù)防POF。

綜上所述，半葉馬尾藻SPF 可以改善由CTX 誘導(dǎo)的小鼠POF，其改善機(jī)制可能是與通過(guò)改善性周期紊亂、調(diào)節(jié)雌激素分泌、改善卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)、調(diào)節(jié)自噬水平有關(guān)。結(jié)果提示半葉馬尾藻SPF可以作為基礎(chǔ)原料開(kāi)發(fā)日常保健品，延緩POF 的發(fā)生，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。