基于多元統(tǒng)計(jì)分析的不同品種和嫩度大葉種茶樹(shù)新梢主要滋味物質(zhì)的比較

王近近，袁海波, ，滑金杰，楊艷芹，沈 帥，龐丹丹，江用文, ，朱佳依，俞燎遠(yuǎn)

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310008；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南西雙版納傣族自治州 666201；3.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江杭州 310020）

茶是世界上消費(fèi)量?jī)H次于水的第二大飲料，由于其獨(dú)特的風(fēng)味和保健功效備受消費(fèi)者喜愛(ài)[1]。茶葉的滋味是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)的重要因素，茶葉鮮葉原料及加工技術(shù)可通過(guò)影響多酚類、茶黃素、氨基酸、生物堿等茶葉主要滋味物質(zhì)的含量而形成不同的茶葉風(fēng)味[2]。茶由茶樹(shù)新梢制成，鮮葉原料的內(nèi)含成分是形成茶葉品質(zhì)的基礎(chǔ)，其與茶葉品質(zhì)高低、茶葉適制性密切相關(guān)，進(jìn)一步?jīng)Q定了茶樹(shù)品種資源的利用價(jià)值和茶葉的經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。鮮葉原料生化成分的種類和含量因茶樹(shù)品種、鮮葉嫩度、種植環(huán)境的不同而不同。研究表明不同品種的中小葉種茶樹(shù)單芽至一芽二葉鮮葉中主要滋味物質(zhì)的分布存在差異，其中可溶性糖、簡(jiǎn)單兒茶素等隨嫩度的降低而增加，茶多酚、氨基酸等隨嫩度的降低而下降[5]。Chen等[6]研究結(jié)果顯示影響烏龍茶滋味品質(zhì)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素沒(méi)食子酸酯等在高海拔烏龍茶中的含量顯著高于低海拔烏龍茶。

中國(guó)云南處于熱帶向亞熱帶的過(guò)渡區(qū)域，天然的自然氣候孕育和保留了豐富的茶樹(shù)種質(zhì)資源，是世界茶樹(shù)資源多樣性分布中心之一[7]。云南地方良種清水3號(hào)和香歸銀毫、國(guó)家級(jí)（審）認(rèn)定品種云抗10號(hào)和云抗14號(hào)、云南省農(nóng)業(yè)主導(dǎo)品種云茶普蕊等均為云南代表性的無(wú)性系茶樹(shù)種質(zhì)資源，其芽葉肥壯、育芽力強(qiáng)、內(nèi)含成分豐富。目前關(guān)于云南大葉種鮮葉的研究多集中于不同品種間茶多酚、氨基酸、咖啡堿等常規(guī)成分多樣性的分析及基于常規(guī)成分的不同品種的茶類適制性研究[8-9]。堵源康等[10]對(duì)清水3號(hào)、香歸銀毫、云抗10號(hào)、云抗14號(hào)等云南茶樹(shù)良種進(jìn)行了表型多樣性探究及適制性分析，但關(guān)于云南大葉種品種、嫩度間關(guān)于滋味成分的系統(tǒng)綜合研究較少，影響大葉種茶湯澀味和甜味的黃酮苷、可溶性糖組分的相關(guān)研究尚未有報(bào)道。鮮葉采摘后的分級(jí)是進(jìn)行鮮葉分類加工的基礎(chǔ)，分級(jí)后不同等級(jí)或類別的鮮葉通過(guò)制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化工藝可加工出優(yōu)質(zhì)和不同特色的茶葉，但是生產(chǎn)中鮮葉分級(jí)主要依靠經(jīng)驗(yàn)判斷，缺少多指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)探討，對(duì)鮮葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)尚沒(méi)有形成系統(tǒng)、科學(xué)的評(píng)價(jià)體系，不利于茶葉的標(biāo)準(zhǔn)化加工，且隨著茶鮮葉采茶工短缺、勞動(dòng)力成本上升，越來(lái)越多的企業(yè)選用機(jī)械化采摘代替人工采摘，機(jī)械采摘的鮮葉老嫩不一，無(wú)法有效實(shí)現(xiàn)鮮葉分類及分級(jí)加工。

基于此，本研究以清水3號(hào)、香歸銀毫、云抗10號(hào)、云抗14號(hào)、云茶普蕊的單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉等共4個(gè)嫩度的鮮葉原料為研究對(duì)象，進(jìn)行茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素類、黃酮苷類、可溶性糖等化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定，旨在明確不同品種間滋味品質(zhì)成分的差異性，探究不同嫩度云南大葉種的原料特性，并運(yùn)用偏最小二乘法（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）、層次聚類（Hierarchical cluster analysis，HCA）、Fisher判別分析等多元統(tǒng)計(jì)分析方法明確鮮葉嫩度差異的關(guān)鍵化合物、建立鮮葉類別判別模型，以期為優(yōu)質(zhì)茶葉資源的篩選及茶葉標(biāo)準(zhǔn)化加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮葉原料 本研究選用了云南具有代表性的無(wú)性系品種清水3號(hào)、香歸銀毫、云抗10號(hào)、云抗14號(hào)（圖1）、云茶普蕊。實(shí)驗(yàn)基地位于云南省西雙版納州勐?？h，處于東經(jīng)100°25'，北緯21°59'，海拔在1185 m，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候，降雨主要集中在6～9月，年平均溫度18.1 ℃，年均積溫6600 ℃，年平均降雨量1467 mm，年平均日照時(shí)數(shù)2030 h，年平均相對(duì)濕度82%，干、濕季節(jié)分明。該茶園土壤肥力均勻，灌溉良好。清水3號(hào)、香歸銀毫的樹(shù)齡為17年，云抗10號(hào)、云抗14號(hào)、云茶普蕊的樹(shù)齡是45年。在茶園中隨機(jī)選取生長(zhǎng)良好的茶樹(shù)，采摘無(wú)蟲(chóng)害、無(wú)病理學(xué)特征的生長(zhǎng)良好的單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉的新梢。采摘時(shí)間為2020年9月中旬。采摘后的鮮葉各取150 g置于液氮罐中進(jìn)行冷凍固樣，然后經(jīng)過(guò)低溫冷凍干燥后放于-20 ℃的冰箱中待測(cè)滋味品質(zhì)成分；采摘后的鮮葉取30 g放置于液氮罐中用于酶活性的測(cè)定；茚三酮、氯化亞錫、福林酚等 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；咖啡堿（Caffeine，CAF）、兒茶素系列標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；黃酮苷系列標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司；糖組分標(biāo)準(zhǔn)品 上海金穗生物科技有限公司。

圖1 不同嫩度的云抗14號(hào)鮮葉Fig.1 Yunkang No.14 fresh leaves with different tenderness

UV-2800分光光度計(jì) 上海誠(chéng)麗生物科技有限公司；XMTD-204電加熱恒溫水浴鍋 上海谷寧儀器有限公司；JGZX-9246MBE風(fēng)熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LGJ-50C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Waters 1525型高效液相儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多酚、氨基酸、咖啡堿、沒(méi)食子酸、兒茶素類的測(cè)定 茶多酚的測(cè)定參照茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法（GB/T 8313-2018）；氨基酸的測(cè)定參照茚三酮比色法（GB/T 8314-2013）；咖啡堿的測(cè)定參照高效液相色譜法（GB/T 8313-2018）；沒(méi)食子酸、兒茶素類的測(cè)定參照茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法（GB/T 8313-2018），并按照公式（1）～（4）計(jì)算兒茶素相關(guān)指標(biāo)：

式中：TSC、TETC和TAC分別表示簡(jiǎn)單兒茶素、酯型兒茶素和兒茶素總量；EGC、GC、EC、C、EGCG、CG、GCG、ECG分別代表表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯，結(jié)果均基于質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.2.2 多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的測(cè)定 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性采用鄰苯二酚比色法[11]進(jìn)行測(cè)定；過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚比色法[11]進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 黃酮苷組分的測(cè)定 黃酮苷組分的測(cè)定參照劉陽(yáng)等[12]的檢測(cè)方法。色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器。流動(dòng)相A相：0.15%甲酸水溶液，B相：乙腈。流動(dòng)相洗脫梯度：0～2 min，6%～17% B；2～22 min，17%～19% B；

22～23 min，19%～30%；23～25 min，30% B；25～26 min，30%～6%；26～30 min，6%。流速為1 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.2.4 可溶性糖組分的測(cè)定 可溶性糖組分的檢測(cè)方法參照陳琦等[13]方法進(jìn)行。色譜柱：Waters X bridge BEH Amide Column（4.6×250 mm，5 μm）。檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。流動(dòng)相：0.02%氨水與乙腈按照25%和75%的體積比例混合。流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL。霧化管加熱動(dòng)力：60%（36 ℃），漂移管溫度：70 ℃，高純氮?dú)饬魉伲?5 psi，增益6。并按照式（5）計(jì)算可溶性糖總量，按照公式（6）計(jì)算甜度值[14]。

式中：SS為可溶性糖總量，%；SV為甜度值；FT為β-D-呋喃果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；SR為蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；GS為α-D-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有生化成分?jǐn)?shù)據(jù)的檢測(cè)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)圖片采用Origin 8.0軟件繪制。數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用SPSS 22.0軟件分析（Tukey法，P＜0.05）。采用SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行PLS-DA分析，以VIP值大于1.2，P＜0.05進(jìn)行差異性指標(biāo)的篩選。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行HCA聚類分析，以平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，以Ward聯(lián)結(jié)為聚類方法進(jìn)行聚類。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行Fisher判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 云南大葉種茶樹(shù)新梢的滋味品質(zhì)特性

2.1.1 不同品種與嫩度鮮葉茶多酚、氨基酸、酚氨比、咖啡堿的變化規(guī)律 茶多酚是茶樹(shù)的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物，是茶湯滋味濃度和強(qiáng)度的主體成分，也是茶湯呈澀味的主要物質(zhì)之一。鮮葉中的茶多酚在茶葉加工過(guò)程中通過(guò)發(fā)生氧化、聚合、降解、異構(gòu)等復(fù)雜的反應(yīng)而影響茶葉滋味、湯色等品質(zhì)。由圖2A可知，相同品種不同嫩度間，各品種的茶多酚含量隨著嫩度的降低先升后降，且各品種均為一芽三葉含量較低（質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為19.39%～24.12%），一芽一葉、一芽二葉含量較高且均顯著高于一芽三葉（P＜0.05）（質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為22.07%～23.81%、22.55%～24.53%）；相同嫩度不同品種間，以云抗14號(hào)、云茶普蕊的茶多酚含量相對(duì)較高。氨基酸是以鮮味為主的物質(zhì)[15]；由圖2B可知，各品種的氨基酸含量隨著嫩度的降低而降低，這與Zhang等[16]研究結(jié)果一致；單芽的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為3.26%～4.16%，相比一芽三葉（2.51%～3.43%）平均高出了26.12%；相同嫩度不同品種間，以云抗14號(hào)的氨基酸含量整體較高。酚氨比指茶葉中茶多酚含量與氨基酸含量的比值，反應(yīng)了茶葉的醇厚感、鮮爽度與澀味之間的關(guān)系[17]；由圖2C可知，各品種的酚氨比隨著嫩度的降低而升高，一芽三葉的酚氨比值范圍為6.78～9.98，均顯著高于單芽的酚氨比（4.88～7.21）（P＜0.05），本研究的酚氨比范圍與陳春林等[8]研究結(jié)果一致；相同嫩度不同品種間，以香歸銀毫的酚氨比值相對(duì)較高，云抗14號(hào)的酚氨比值相對(duì)較低?？Х葔A是茶葉中含量最多的生物堿，為苦味物質(zhì)[18]；由圖2D可知，香歸云毫、云抗14號(hào)的咖啡堿含量隨著嫩度的降低而降低，清水3號(hào)、云抗10號(hào)、云茶普蕊的咖啡堿含量隨著嫩度的降低先升后降；整體上各品種的咖啡堿均為一芽三葉嫩度含量最低，這與Zhang等[16]研究結(jié)果中咖啡堿在成熟葉的含量中較低的結(jié)果類似，這可能與咖啡堿主要在茶芽的生長(zhǎng)旺盛部位合成和積累有關(guān)；相同嫩度不同品種間，以云茶普蕊的咖啡堿含量相對(duì)較高且各嫩度間差異較?。≒＞0.05），平均值為4.01%。

圖2 各品種鮮葉嫩度間茶多酚（A）、氨基酸（B）、酚氨比（C）、咖啡堿（D）的變化Fig.2 Changes of contents of tea polyphenols (A), amino acids(B), the ratio of tea polyphenols to amino acids (C) and caffeine(D) of fresh leaves with different tenderness of all cultivars

由以上可知，茶鮮葉在不同品種、嫩度間存在生化成分的差異性和規(guī)律性。Huang等[19]研究表明茶樹(shù)中的生化成分一般呈向上積累的趨勢(shì)，嫩葉中含量較高，成熟葉中含量較少，與本研究結(jié)果相似；這可能與嫩葉的呼吸速率比老葉快，而呼吸產(chǎn)物是茶多酚、咖啡堿等次生代謝物的合成前提物質(zhì)有關(guān)[20]。

2.1.2 不同品種和嫩度鮮葉沒(méi)食子酸、兒茶素組分的變化規(guī)律 沒(méi)食子酸（Gallic acid，GA）是茶葉中酸澀味覺(jué)屬性的呈味成分[21]。兒茶素類成分是茶葉中的主要多酚類物質(zhì)，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分為簡(jiǎn)單兒茶素和酯型兒茶素，影響茶葉的苦味、澀味[22]，相同濃度下兒茶素組分滋味強(qiáng)度大小順序?yàn)椋篍CG、EGCG、EC、EGC[23]。

由表1可知，相同品種不同嫩度間，嫩度越高，GA含量越高，這與Xu等[24]研究結(jié)果一致；其中云抗14號(hào)的單芽和一芽一葉間、一芽二葉和一芽三葉間的GA含量差異較小（P＞0.05），但前者顯著高于后者（P＜0.05），其余品種單芽GA含量均顯著高于一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉、一芽四葉（P＜0.05），各品種單芽的GA平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%，相比一芽三葉的0.03%，高出了1.24倍。不同品種相同嫩度間，單芽嫩度中的云抗10號(hào)及一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉嫩度中的云茶普蕊具有相對(duì)較高的GA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.06%～0.12%，各嫩度中清水3號(hào)的GA含量相對(duì)較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為0.03%～0.04%。由以上可知，各品種不同嫩度間的GA含量有差異但有相似的變化規(guī)律。研究顯示，簡(jiǎn)單兒茶素和GA與綠茶的回甘程度正相關(guān)[25]；Li等[26]研究表明，GA對(duì)紅茶的甜味具有負(fù)面的影響，同時(shí)，GA在紅茶加工過(guò)程中會(huì)隨酯型兒茶素的降解而產(chǎn)生[27]。

表1 各品種鮮葉嫩度間沒(méi)食子酸、兒茶素類含量的變化（%）Table 1 Changes of gallic acid and catechin components contents of fresh leaves with different tenderness of all cultivars (%)

本文檢測(cè)到8種兒茶素單體，其含量大小順序依次為：EGCG、ECG、EGC、EC、GC、C、GCG、CG。相同品種不同嫩度間，嫩度越高，GC、EGC、C、EC、CG、TSC、TAC等 值 越低，同時(shí)GCG、TETC/TSC等值越高；其中EGC、EC、CG、TSC、GCG、TETC/TSC等在不同嫩度間均差異顯著（P＜0.05）。兒茶素單體中EGCG是影響茶湯澀味的主要物質(zhì)[28]，云抗14號(hào)和香歸銀毫的EGCG為嫩度越高，其含量越高，其余品種的EGCG含量均隨著嫩度的降低先升后降，且在一芽一葉或一芽二葉含量較高；清水3號(hào)和香歸銀毫的ECG均為嫩度越高，其含量越高，云抗10號(hào)為嫩度越高，其含量越低，其余品種為隨著嫩度的降低先升后降，且在一芽二葉含量較高；各品種的TETC均隨著嫩度的降低先升后降，均在一芽二葉含量較高。本研究結(jié)果與Xu等[24]、Song等[29]研究結(jié)果中隨著茶葉新梢的成熟EGCG、ECG等含量顯著下降、EGC、C、EC等含量增加的結(jié)論一致?？梢?jiàn)，TSC及其單體、TAC整體上隨著新梢的成熟而增加；TETC整體上隨著新梢的成熟而先升后降，其中一芽二葉的TETC、TAC均同時(shí)最高，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.10%、16.18%，即中等成熟度的芽葉新梢的兒茶素總量較高；單芽的TSC、TAC均同時(shí)最低，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.59%、12.92%，酯型兒茶素相對(duì)較低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.23%；鮮葉的成熟度越高，簡(jiǎn)單兒茶素相對(duì)酯型兒茶素的含量越高。隨著茶鮮葉成熟度的增加，酯型兒茶素的下降及簡(jiǎn)單兒茶素的增加可能是由于成熟葉中的酯型兒茶素被酯型兒茶素水解酶水解為簡(jiǎn)單兒茶素所致[30]。

2.1.3 不同品種和嫩度鮮葉酶活性的變化規(guī)律 茶多酚的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素等茶色素是影響茶湯色澤、茶湯滋味強(qiáng)度和濃度的重要成分，而PPO和POD是茶葉中催化兒茶素類氧化轉(zhuǎn)化形成茶色素的關(guān)鍵酶類，PPO主要催化兒茶素類氧化聚合生成茶黃素，POD既影響茶黃素的酶促合成又影響茶黃素的酶促過(guò)氧化[31]，即PPO和POD均對(duì)茶葉滋味品質(zhì)的形成有極其重要的作用，故本文將其作為滋味相關(guān)成分進(jìn)行分析。

由圖3A可知，清水3號(hào)、香歸銀毫、云茶普蕊的PPO活性隨著嫩度的降低先降后升，均為單芽、一芽四葉的PPO活性較高；云抗10號(hào)PPO活性隨著嫩度的降低先升后降，一芽一葉的PPO酶活性較高，其次為單芽；云抗14號(hào)PPO酶活性為單芽較高，其余嫩度間差異較小。由以上可知，各品種的單芽嫩

度鮮葉均具有相對(duì)較高的PPO活性（平均值為1.32 U·g-1·min-1），較一芽二葉（0.99 U·g-1·min-1）增加了33.33%。相同嫩度不同品種間，單芽、一芽二葉和一芽三葉以清水3號(hào)、香歸銀毫的PPO活性相對(duì)較高，一芽一葉以云茶普蕊的酶活性較高。因此，鮮葉的酶活性因品種和成熟度的不同存在差異。由圖3B可知，相同品種不同嫩度間，各品種的POD活性隨著嫩度的降低而升高，且各品種的一芽二葉和一芽三葉間均存在顯著差異（P＜0.05），五個(gè)品種的一芽三 葉POD平 均 活 性（22.34 U·g-1·min-1）較 單 芽（2.13 U·g-1·min-1）增加了9.49倍；相同嫩度不同品種間，單芽、一芽二葉、一芽三葉以云抗14號(hào)的POD活性整體相對(duì)較高，一芽一葉以香歸銀毫的POD活性較高。由以上分析可知，酶活性在品種、嫩度間均存在差異，這種差異可能與酶相關(guān)基因在不同品種間、不同部位間的表達(dá)有關(guān)；不同嫩度間POD的差異大于PPO，這與Xu等[32]研究結(jié)果相似。Ramaswamy等[33]研究指出鮮葉與萎凋葉PPO區(qū)別較大，在萎凋過(guò)程中有新的PPO形成，并且紅茶成品的質(zhì)量與萎凋葉PPO的活性有更密切的關(guān)系，即酶活性與茶葉品質(zhì)的關(guān)系需結(jié)合成品茶進(jìn)一步分析研究確定。

圖3 各品種鮮葉嫩度間PPO（A）和POD（B）活性的變化Fig.3 Changes of activities of PPO (A) and POD (B) of fresh leaves with different tenderness of all cultivars

2.1.4 不同品種和嫩度鮮葉黃酮苷組分的變化規(guī)律

茶葉中的黃酮苷類化合物是茶湯澀味的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，黃酮苷不僅在口中產(chǎn)生干燥和光滑的澀味，還可通過(guò)強(qiáng)化咖啡堿的苦味增加茶湯的苦味[34-36]，對(duì)茶葉滋味產(chǎn)生不利的影響，但同時(shí)黃酮苷是綠茶茶湯中的主要成分，它們以水溶性黃色色素的形式存在于茶湯中構(gòu)成綠茶的茶湯色澤[37]。茶樹(shù)品種、生長(zhǎng)氣候、加工工藝、貯藏條件等對(duì)茶葉中黃酮苷類物質(zhì)的分布和含量均有一定的影響[36,38]。研究表明楊梅素3-O-半乳糖苷和槲皮素3-O-蘆丁苷的濃度與綠茶澀味密切相關(guān)[39]，蘆丁對(duì)紅茶的甜醇口感有消極的影響[26]，但目前關(guān)于云南大葉種茶葉黃酮苷含量及嫩度間的變化情況未有報(bào)道。本研究共測(cè)定了8種黃酮苷組分，含量由大到小均依次為蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、牡荊素葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷。由表2可知，相同品種不同嫩度間，除槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷外，各品種的黃酮苷組分及黃酮苷總量為一芽二葉或者一芽三葉含量較高，單芽含量較低，其中一芽三葉的蘆丁、總黃酮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.62%、1.65%，相比單芽的0.04%、0.23%分別增加了13.21、6.31倍。相同嫩度不同品種間，清水3號(hào)的楊梅素-3-O-半乳糖苷和牡荊素葡萄糖苷、香歸銀毫的山柰酚-3-O-蕓香糖苷、云抗10號(hào)的槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷、云抗14號(hào)的牡荊素鼠李糖苷等整體含量相對(duì)較高；清水3號(hào)的蘆丁、牡荊素鼠李糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖苷、香歸銀毫的槲皮素-3-O-葡萄糖苷、云抗10號(hào)的楊梅素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷、云抗14號(hào)的槲皮素-3-O-β-D-龍膽雙糖苷和牡荊素葡萄糖苷、云茶普蕊的山柰酚-3-O-葡萄糖苷等整體含量相對(duì)較低。相同嫩度不同品種間比較，單芽、一芽一葉、一芽二葉嫩度時(shí)，分別以云抗10號(hào)、清水3號(hào)、清水3號(hào)的黃酮苷總量最低，均以云抗14號(hào)黃酮苷總量顯著較高（P＜0.05）（且分別比最低值高出了82.50%、63.85%、145.36%）；一芽三葉嫩度時(shí)，以清水3號(hào)的黃酮苷總量最低，以香歸銀毫的黃酮苷總量顯著較高（P＜0.05）（且比最低值高出了98.09%）。由以上可知，不同茶樹(shù)品種的黃酮苷類物質(zhì)的含量不同，且在不同嫩度鮮葉間的分布具有一定的規(guī)律性，整體上均為嫩度越高，黃酮苷含量越低。

2.1.5 不同品種和嫩度鮮葉可溶性糖組分的變化規(guī)律 可溶性糖是茶湯甜醇滋味形成的重要基礎(chǔ)物質(zhì)[40]，目前關(guān)于云南大葉種糖組分的研究較少，本研究共檢測(cè)到3種可溶性糖組分，即β-D-呋喃果糖（以下簡(jiǎn)稱果糖）、蔗糖、α-D-葡萄糖（以下簡(jiǎn)稱葡萄糖）。由表3可知，檢測(cè)到的3種可溶性糖的單體以蔗糖的含量相對(duì)較高，單芽、一芽一葉、一芽二葉、一芽三葉蔗糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.47%、0.30%、0.34%、0.83%，這與潘科等[41]研究結(jié)果顯示古樹(shù)茶鮮葉的糖組分以蔗糖含量最高的結(jié)果相似。相同品種不同嫩度間，各品種可溶性糖組分隨著嫩度的降低先降后增，或均隨著嫩度的降低而增加，整體上為一芽三葉時(shí)含量相對(duì)較高。即鮮葉的成熟度較高時(shí)，其可溶性糖含量相對(duì)較高，這與陳義等[5]研究結(jié)果相似。五個(gè)品種一芽三葉的果糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性糖、總甜度值的平均值相比單芽分別增加了194.74%、78.11%、62.96%、84.48%、97.75%。這可能是由于隨著鮮葉成熟度的增加，葉片中的葉綠素接受光能進(jìn)行“碳素同化”積累碳水化合物，淀粉、蔗糖的含量逐漸增加[42]，而可溶性糖主要來(lái)自于淀粉分解，從而導(dǎo)致了相對(duì)成熟的鮮葉中可溶糖含量較高。相同嫩度不同品種間，單芽的云抗14號(hào)同時(shí)具有相對(duì)較高的蔗糖、葡萄糖、可溶性糖總量、總甜度值；一芽一葉、一芽二葉的清水3號(hào)同時(shí)具有相對(duì)較高的果糖、蔗糖、可溶性糖總量、總甜度值；一芽三葉的云茶普蕊同時(shí)具有相對(duì)較高的可溶性糖組分、可溶性糖總量及總甜度值。可見(jiàn)不同品種的鮮葉在相同的嫩度下對(duì)滋味甜醇度的影響不同，體現(xiàn)了不同品種的茶樹(shù)在呼吸作用、光合作用等的差異。茶葉加工過(guò)程中的逆境脅迫和熱處理等會(huì)通過(guò)引起多糖的水解及可溶性糖的美拉德反應(yīng)而導(dǎo)致可溶性糖含量的變化，因此在明確鮮葉嫩度間可溶性糖的變化規(guī)律的同時(shí)，通過(guò)加工技術(shù)調(diào)控其含量可有效提升茶葉品質(zhì)。

表3 各品種鮮葉嫩度間可溶性糖組分含量的變化（%）Table 3 Changes of soluble sugar component contents of fresh leaves with different tenderness of all cultivars (%)

對(duì)于綠茶加工，茶多酚含量低的鮮葉所制綠茶茶湯的澀味感會(huì)相對(duì)減弱；相對(duì)高含量的氨基酸及低的酚氨比值（小于8）可增加茶湯的鮮爽度[43]；鮮葉咖啡堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于3.8%時(shí)有利于綠茶品質(zhì)的形成[44]；綠茶茶湯中的苦味與EGCG和ECG濃度高度相關(guān)，澀味與ECG密切相關(guān)[39]。對(duì)于紅茶加工，相對(duì)高含量的茶多酚、總兒茶素有利于氧化聚合成與紅茶品質(zhì)正相關(guān)的茶黃素、茶紅素等物質(zhì)；相對(duì)較高含量的簡(jiǎn)單兒茶素和相對(duì)較低含量的GA，有利于降低茶湯的苦澀味；咖啡堿可提高大葉種紅茶品質(zhì)[45]，且紅茶茶湯中的咖啡堿可與茶湯中的綠原酸形成復(fù)合物，減弱茶湯的粗澀味，提高茶湯的鮮爽度[46]。故結(jié)合2.1.1～2.1.2的結(jié)果可知，大葉種茶樹(shù)單芽、一芽二葉嫩度的鮮葉分別具備了加工綠茶和紅茶的較佳物質(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)一步綜合2.1.3～2.1.5的研究結(jié)果可知，單芽嫩度中的云抗14號(hào)同時(shí)具有相對(duì)高含量的氨基酸、可溶性糖，較低的酚氨比、總酯型兒茶素、總兒茶素、黃酮苷等值，相對(duì)適制綠茶；一芽二葉嫩度中的清水3號(hào)同時(shí)具有較高的總兒茶素、總簡(jiǎn)單兒茶素、PPO、POD、可溶性糖等值，較低含量的GA、黃酮苷，相對(duì)更適制紅茶。茶葉品質(zhì)及適制性不是單一物質(zhì)的表現(xiàn)結(jié)果，是各成分通過(guò)復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)綜合作用的呈現(xiàn)，除了本研究中涉及到物質(zhì)外，其他有機(jī)酸、氨基酸組分等滋味品質(zhì)成分在云南大葉種新梢中的分布規(guī)律仍需進(jìn)一步研究。

2.2 不同嫩度大葉種茶樹(shù)新梢滋味相關(guān)物質(zhì)的聚類與判別模型分析

2.2.1 不同嫩度大葉種茶樹(shù)新梢滋味相關(guān)物質(zhì)的PLS-DA和HCA分析 為進(jìn)一步分析不同嫩度間鮮葉滋味品質(zhì)的差異性，運(yùn)用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）分析上述33個(gè)成分指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖4。PLS-DA模型可將4個(gè)嫩度分為2類，單芽和一芽一葉差異較小，可視為一類，一芽二葉和一芽三葉間的差異較小，可視為一類。采用交叉驗(yàn)證法對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證，共篩選出了4個(gè)主成分，4個(gè)主成分解釋了79.8%的自變量，4個(gè)主成分解釋了90.4%因變量，對(duì)不同嫩度鮮葉品質(zhì)的預(yù)測(cè)能力為72.3%，表明該模型較穩(wěn)定。

圖4 各品種不同嫩度茶樹(shù)新梢滋味相關(guān)物質(zhì)的PLS-DA模型散點(diǎn)圖（A）、200次置換檢驗(yàn)圖（B）、因子載荷圖（C）和VIP條形圖（D）Fig.4 PLS-DA model score scatter plot (A), 200 crossvalidation test plot (B), factor loading plot (C) and VIP bar chart(D) of flavoring substances in new shoots of tea trees with different tenderness of various varieties

通過(guò)PS-DA模型的載荷圖和VIP圖可進(jìn)一步解釋兩個(gè)等級(jí)的貢獻(xiàn)變量指標(biāo)，GA、AA、GCG、TETC/TSC與單芽和一芽一葉具有較高的相關(guān)性；TSC、TAC、TPA、POD、FlVs與一芽二葉、一芽三葉具有較高的相關(guān)性。

為了獲得PLS-DA模型下不同嫩度下的鮮葉的滋味品質(zhì)的關(guān)鍵差異指標(biāo)，通過(guò)PLS-DA模型的VIP值進(jìn)一步篩選得到了9個(gè)差異性指標(biāo)，即TETC/TSC、TSC、GCG、TAC、TPA、POD、FLVs、GA、AA等為2類嫩度區(qū)分貢獻(xiàn)度較大的指標(biāo)，可見(jiàn)特征差異性指標(biāo)值的不同導(dǎo)致不同等級(jí)下茶鮮葉的品質(zhì)差別。由圖5可見(jiàn)，這9個(gè)指標(biāo)在不同類別的鮮葉中均差異顯著。在云南大葉種茶葉的制作過(guò)程中，這可用于指導(dǎo)茶鮮葉的分級(jí)采摘及分級(jí)加工。

圖5 兩類別鮮葉的特征差異化合物的散點(diǎn)圖Fig.5 Scatter plot of differential compounds between two groups of fresh leaves with different tenderness

HCA為一種無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別方法，可將樣本數(shù)據(jù)按照相似度進(jìn)行自然聚集。為進(jìn)一步驗(yàn)證和分析不同嫩度鮮葉的分類結(jié)果，基于33個(gè)品質(zhì)成分采用HCA系統(tǒng)聚類分析方法，對(duì)茶鮮葉滋味指標(biāo)進(jìn)行了分類。由圖6可知，在20的距離水平上，樣品被聚類為兩類，其中單芽和一芽一葉聚為一類，一芽二葉和一芽三葉聚為一類?？梢?jiàn)HCA結(jié)果與PLS-DA結(jié)果一致。

圖6 各品種不同嫩度茶葉的樹(shù)狀分布圖Fig.6 Cluster dendrogram of tea samples from different tenderness

2.2.2 基于Fisher判別的云南大葉種鮮葉原料嫩度的多指標(biāo)分級(jí) 采用Fisher判別分析方法，對(duì)已知的鮮葉樣本進(jìn)行訓(xùn)練分析，根據(jù)不同分類的指標(biāo)分布情況，建立起相應(yīng)的判別函數(shù)。

根據(jù)PLS-DA和HCA的結(jié)果，將鮮葉分為2類，作為初始分類結(jié)果供Fisher判別模型進(jìn)行訓(xùn)練，并將PLS-DA識(shí)別到的9個(gè)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)鮮葉分類的初始影響指標(biāo)。按照Fisher判別分析，建立了鮮葉分類的判別模型：

式中，F(xiàn)為判別值，X1～X9分別代表GA、GCG、TETC/TSC、TSC、TAC、FLVs、AA、TPA、POD。其特征值為5.494，方差貢獻(xiàn)率為100%，說(shuō)明該方程可以解釋原始樣本100%的信息。在該判別函數(shù)下，單芽～一芽一葉的平均判別值即中心值為10.89，一芽二葉～一芽三葉的中心值為35.11，判別函數(shù)的臨界值為23.00。根據(jù)公式（7）對(duì)20組樣本的分類情況利用回代估計(jì)法計(jì)算分類誤判率，回判結(jié)果見(jiàn)表4。同時(shí)采用留一交叉驗(yàn)證法[47]進(jìn)行Fisher交叉分類的驗(yàn)證。由表4可知，原始樣本的回判正確率為90%，只有2個(gè)樣本判斷錯(cuò)誤；判別模型Fisher交叉分類對(duì)鮮葉的分類結(jié)果與實(shí)際結(jié)果的一致性達(dá)到85%，只有3個(gè)樣本的分類結(jié)果不同，說(shuō)明本模型的判別函數(shù)準(zhǔn)確度較高；同時(shí)外部驗(yàn)證模型的正確率為81.25%?？梢?jiàn)，所建立的判別函數(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)鮮葉嫩度品質(zhì)的區(qū)分，且區(qū)分效果明顯。

表4 鮮葉類別的Fisher判別結(jié)果Table 4 Fisher discriminant results of categories of fresh leaves

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)闡明了不同品種和嫩度大葉種茶樹(shù)新梢主要滋味相關(guān)物質(zhì)的分布差異性。對(duì)于云南大葉種，茶樹(shù)新梢的成熟度越高，TPA、TSC、TAC、蘆丁、FLVs、POD、SS等值相對(duì)越高，但GA、AA等值相對(duì)越低；TPS、TETC、CAF等值均隨著嫩度的降低而先升后降，一芽二葉時(shí)相對(duì)較高，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.81%、11.10%、3.79%，比相對(duì)較低含量的一芽三葉的分別增加了7.67%、13.77%、10.22%。單芽為適制綠茶的較佳原料，以云抗14號(hào)略優(yōu)，一芽二葉為適制紅茶的較佳原料，以清水3號(hào)略優(yōu)。大葉種鮮葉黃酮苷組分中含量較高的為蘆丁，單芽～一芽三葉蘆丁的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.04%、0.16%、0.45%、0.62%。可溶性糖組分中含量較高的為蔗糖，單芽～一芽三葉蔗糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為

0.47%、0.30%、0.34%、0.83%。

另外，本研究揭示了不同嫩度大葉種茶樹(shù)新稍的品質(zhì)分類。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)大葉種鮮葉嫩度可分為單芽和一芽一葉、一芽二葉和一芽三葉2類，TETC/TSC、TSC、GCG、TAC、TPA、POD、FLVs、GA、AA為2類鮮葉中的差異物質(zhì)，其中GA、AA、GCG、TETC/TSC等在單芽和一芽一葉顯著較高（P＜0.05）；TSC、TAC、TPA、POD、FlVs等在一芽二葉、一芽三葉中顯著較高（P＜0.05），在此基礎(chǔ)上構(gòu)建立了不同類別鮮葉的判別函數(shù)模型，判別函數(shù)的臨界值為23.00，回判的正確率為90%，交叉驗(yàn)證的正確率為85%，外部驗(yàn)證的正確率為81.25%，該模型可以用于不同類別鮮葉品質(zhì)的定性判別。

本研究將有助于進(jìn)一步了解云南大葉種茶樹(shù)新梢滋味物質(zhì)的分布規(guī)律及茶芽成熟過(guò)程中茶葉品質(zhì)的形成機(jī)制，對(duì)云南大葉種的生產(chǎn)及品質(zhì)調(diào)控具有指導(dǎo)意義，同時(shí)為其原料的采摘分級(jí)及標(biāo)準(zhǔn)化加工提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，為茶鮮葉品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了技術(shù)支撐。有關(guān)大葉種鮮葉不同葉、梗等部位中滋味和香氣相關(guān)成分的分布，以及季節(jié)、海拔對(duì)大葉種品質(zhì)成分的影響有待進(jìn)一步深入研究。