易曉雷 肖 浩 李旭輝 劉志鵬 謝 明

長沙市中醫(yī)醫(yī)院 （長沙市第八醫(yī)院）肝膽胰·血管外科，湖南長沙 410100

肝癌是全球發(fā)病率高、病死率高的惡性腫瘤之一，5年內(nèi)生存率僅為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命性腫瘤[1]。肝癌是一種常見的原發(fā)性肝癌類型，占85%左右，其顯著特點主要為易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差及高病死率[2]。肝切除、肝移植、射頻消融、經(jīng)動脈化療栓塞和放射性栓塞術(shù)是目前肝癌治療中常見的方法[3]，但大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時都已經(jīng)到了中、晚期，錯過了最好的處理時間，因此大多數(shù)患者的預(yù)后較差[4-5]。第一個經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）通過用于治療晚期肝癌的多靶點抗腫瘤一線藥為索拉非尼（sorafenib，SORA）[6]，能通過對絲氨酸-蘇氨酸激酶（c-RAF）的抑制，阻斷RAF/MEK/ERK 介導(dǎo)的信號途徑，從而達到抑制癌細胞生長的目的；有研究表明還可通過酪氨酸激酶受體的抑制，如血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR），從而阻止新的腫瘤血管生成，具有抑制腫瘤細胞生長和腫瘤新生血管形成的雙重作用[7]。但是大多數(shù)患者在服用SORA 數(shù)月后會產(chǎn)生對藥物的抗藥性，目前尚未充分了解其作用機制，降低藥物耐藥性是改善肝癌治療效果的一個重要因素。雙芐基異喹啉生物堿—甲基蓮心堿（neferine，Nef）由睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽中提取[8]，研究發(fā)現(xiàn)Nef 具有抗腫瘤作用，而且可以減少腫瘤對化療藥物的耐藥性。有研究報道，Nef 對SGC7901/VCR 的多藥物抗性有明顯的抑制作用[9]。但Nef 在肝癌耐藥中的研究尚未見報道。故本研究通過觀察Nef 對耐SORA 肝癌HepG2 細胞株耐受性的影響，探討其對人肝癌耐藥細胞株HepG2/SORA 耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機制，為Nef 應(yīng)用于肝癌的臨床化療增敏治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細胞 人肝癌耐藥細胞株HepG2/SORA（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑 含胎牛血清（10%）的DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、SORA 和Nef 購自濟南精合醫(yī)藥科技有限公司。噻唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；二甲亞砜（DMSO，濟南廣宇化工有限公司）；多聚甲醛（南京高和化學(xué)工業(yè)有限責(zé)任公司）40 ng/L；上海實驗試劑有限公司購買的磷酸鹽緩沖劑（PBS）；購自濟寧泰華化工科技有限公司的熒光消除劑；末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）反應(yīng)液、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、雙蒸水均于北京酷來博科技有限公司購買；TUNE 細胞凋亡檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。RIPA 蛋白裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗人Akt 和p-Akt（Ser473）多克隆抗體及β-actin 一抗及二抗（HRP，美國Abcam 公司）。

1.1.3 主要儀器 TGL16M 臺式高速離心機（凱特實驗儀器有限公司）；YCP-400Q 細胞CO2培養(yǎng)箱（美長沙華曦電子科技有限公司）；88-55030 光學(xué)顯微鏡（寶視德有限公司）；天諾翔TN-60 熒光倒置顯微鏡（深圳天諾翔網(wǎng)絡(luò)科技有限公司）；賽默飛全波長酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；THT-96G 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增儀（上海凈信實業(yè)有限公司）；DYCZ-24DN 電泳槽（冠兆儀器旗艦店）；DYCZ-24DN 蛋白凝膠電泳儀（北京六一儀器廠）；Trans-Bloy Turbo 轉(zhuǎn)膜儀（上海艾研生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 首先用含胎牛血清（10%）的DMEM 高糖細胞培養(yǎng)基對人肝癌耐藥細胞HepG2/SORA進行初次的細胞培養(yǎng)，然后將其放置在5% CO2濃度的細胞培養(yǎng)箱中，且箱內(nèi)溫度控制在37℃左右，當(dāng)細胞融合達80%時，將細胞接種于6 孔板中，并隨機分為4 組：空白對照組、SORA 組（IC50 濃度）、Nef 組[（5.00±0.57）μmol/L]、SORA[（IC50 濃度）+Nef（5.00±0.57）μmol/L]聯(lián)合組。將對應(yīng)濃度的藥劑分別添加到不同的培養(yǎng)基中，空白對照組添加相同體積的培養(yǎng)基。然后進行56 h 的細胞培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖抑制作用檢測 采用MTT 法檢測細胞增殖抑制率。將細胞接種于96 孔板中培養(yǎng)，添加0.5% MTT 反應(yīng)溶液后，將細胞放入5% CO2濃度，且箱內(nèi)溫度控制在37℃左右的細胞培養(yǎng)箱中，再進行4 h 的培養(yǎng)。棄上清，搖動培養(yǎng)10 min 后，各孔加入150 μl 二甲基亞砜，然后用酶標(biāo)記器讀取每個樣品的孔光吸收率（OD），在570 nm 處。細胞增殖抑制率=[1-實驗組（Nef 組、SORA 組及聯(lián)用組）OD 值/空白對照組OD 組]×100%。

1.2.3 細胞凋亡檢測 待給藥結(jié)束后，用TUNEL法檢測不同組間細胞凋亡指標(biāo)。收集細胞，將細胞涂片后自然晾干，再放入40 ng/L 多聚甲醛溶液中，進行1 h 左右的浸泡，用PBS 漂洗后，樣本浸泡于3% H2O2中30 min，PBS 漂洗后，將試樣浸泡于PBS中，此處需用含1% Triton-X-100 的PBS 浸泡30 min；然后再進行PBS 漂洗，滴入50 μl 的TdT反應(yīng)溶液到樣品中，用遮光法進行1 h 的遮光處理；然后用PBS 沖洗，加入50 μl 的染料，在陰涼下進行30 min 的處理，然后用DAPI 對細胞進行復(fù)染；經(jīng)PBS 清洗后，用熒光消除劑密封，并用熒光顯微鏡進行觀察。在各標(biāo)本中，隨機挑選3 個視野，統(tǒng)計各組凋亡的陽性細胞數(shù)和視野中能看見的總細胞數(shù)。細胞凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4 Western Blot 法測定各組p-Akt、Akt 表達 待各組細胞給藥結(jié)束后，收集各組細胞至離心管中，然后將等濃度細胞裂解液加入各組試管內(nèi)，于4℃下?lián)u動培養(yǎng)一晚，培養(yǎng)結(jié)束后收集各組細胞液，10 000×g，4℃，進行10 min 的離心，然后各組上方清液即為細胞總蛋白，加上樣緩沖液，在沸水中煮5 min。取各組蛋白上樣，進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用體積分數(shù)5%脫脂牛奶于搖床上室溫封閉2 h，PBST 清洗3 次，加一抗4℃孵育過夜，PBST 清洗3 次，加二抗溫孵育2 h，曝光。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用SNK-q檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同藥物對HepG2/SORA細胞凋亡率的影響

SORA 組、Nef 組、SORA+Nef 組與空白對照組相比，細胞凋亡率有明顯差異，空白對照組的凋亡率低于SORA 組、Nef 組和SORA+Nef 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）；而SORA 組、Nef 組和SORA+Nef組比較，SORA+Nef組的凋亡率高于SORA組、Nef組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。見表1。

表1 不同藥物對HepG2/SORA細胞凋亡率的影響

2.2 不同藥物對HepG2/SORA細胞增殖抑制率的影響

SORA 組、Nef 組、Nef+SORA 聯(lián)合組的增殖抑制率明顯高于空白對照組（P< 0.05）；與SORA相比，Nef 組和Nef+SORA 聯(lián)合組的細胞增殖抑制率明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）；SORA+Nef 聯(lián)合組細胞增殖抑制率明顯高于Nef 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05）。見表2。

表2 不同藥物對HepG2/SORA細胞增殖抑制率的影響

2.3 不同藥物對HepG2/SORA細胞p-Akt、Akt和β-actin蛋白表達影響

Western Blot 法測定各組p-Akt、Akt 表達。蛋白印跡結(jié)果表明，SORA 聯(lián)合Nef 能顯著降低p-Akt及Akt 的表達，而SORA 組中p-Akt 及Akt 的表達高于空白對照組及Nef 組。見圖1。

3 討論

多個信號途徑和多個遺傳基因聯(lián)合導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生，在某些方面，化學(xué)療法和靶向藥物能有效地延長其無病生存和總體生存時間，并能改善患者的預(yù)后，但是對原藥和繼發(fā)藥的抗藥性依然是決定其預(yù)后的主要原因[10]。在這之中，PI3K-Akt 通路是肝癌關(guān)鍵通路，在30%～50%的肝癌患者中，其體內(nèi)這一通路被明顯活化，Akt 活化是影響肝癌生存期較低的一個重要因子[11]。當(dāng)前，PI3K-Akt通路與肝癌耐藥的相關(guān)性引起廣泛關(guān)注。有研究表明在耐藥細胞株SORA 持續(xù)作用下激活了PI3K-Akt通路[12]。Nef 是一類雙芐基異喹啉藥物，近年開始成為研究腫瘤耐藥的熱點。Qin 等[13]實驗顯示，Nef 可以明顯減少人慢性髓性白血病細胞株K562/G01對伊馬替尼的藥物敏感性，這可能與ABC 轉(zhuǎn)運素P-gp 的激活密切相關(guān)。Zhou 等[14]也證實Nef 與高熱作用可使ABC 中Pgp、MDR1 mRNA 含量下降，從而使SGC7901/ADM 多藥耐藥性下降，從而降低SGC7901/ADM 的多藥耐藥水平。另外，MCF-7/ADR對乳癌的抗藥性也得到了證實[15]。Nef 能抑制卵巢腫瘤細胞的生長，其作用機制是活化p38MAPK/JNK通路，抑制mTOR 通路活化，進而誘發(fā)腫瘤細胞的自噬[14]。在肺癌A549 細胞株中，有研究[16]表明Nef 可通過富集氧自由基、抑制PI3K-Akt/mTOR 而誘導(dǎo)自噬，從而抑制肺癌細胞增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)SORA 耐藥細胞HepG2/SORA 中p-Akt、Akt 蛋白表達顯著上調(diào)（P< 0.05），表明耐藥細胞中PI3K-Akt 通路被激活。Nef 與SORA 聯(lián)用能顯著降低p-Akt、Akt 蛋白表達（P< 0.05），表明該通路已受抑制，提示Nef 與SORA 聯(lián)用可以通過多靶點逆轉(zhuǎn)耐藥、增強藥物作用敏感性，因此具有潛在應(yīng)用價值。已有研究發(fā)現(xiàn)在SORA 耐藥的肝癌細胞中，能通過抑制Akt 將自噬從細胞保護作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳鰴C制，逆轉(zhuǎn)對SORA 的獲得性耐藥[17]。本研究也證實Nef 抑制SORA 獲得性耐藥關(guān)鍵靶點Akt的磷酸化，抑制PI3K-Akt 通路。提示Nef 與SORA聯(lián)用可能將自噬從細胞保護作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳觯瑸檠邪l(fā)調(diào)控自噬的抗腫瘤藥物提供了新思路，但具體機制還需要后續(xù)深入探究。綜上所述，本研究結(jié)果提示Nef 能增強SORA 敏感性，有效逆轉(zhuǎn)HepG2/SORA 耐藥細胞對SORA 的耐藥，其機制可能與抑制PI3K-Akt 信號通路相關(guān)。因此，進一步深入研究對臨床解決SORA 耐藥問題具有重要意義。