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      視網(wǎng)膜缺血性損傷動物模型與發(fā)病機制的研究進展

      2022-12-17 12:52:45秦亞麗冀美琦訾迎新鄧婷婷韓夢雨金明
      中國中醫(yī)眼科雜志 2022年10期
      關(guān)鍵詞:視神經(jīng)線粒體視網(wǎng)膜

      秦亞麗,冀美琦,訾迎新,鄧婷婷,韓夢雨,金明

      視網(wǎng)膜缺血性損傷(retinal ischemic injury,RII)是許多眼底血管性疾病的病理基礎(chǔ)之一,如視網(wǎng)膜血管阻塞、缺血性視神經(jīng)病變等[1-2]。RII 導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織內(nèi)長期低灌注,并誘發(fā)不可逆的視神經(jīng)細胞退行性病變,最終造成患者視力下降或視覺障礙。選擇理想的RII 模型,深入探索其潛在的發(fā)病機制,可以為全面認識該病變并尋求有效的治療方法提供研究基礎(chǔ)。近年來,許多學(xué)者通過建立不同類型的急、慢性缺血性視網(wǎng)膜病變的動物模型,針對不同病變階段的多個機制環(huán)節(jié)做了大量研究,取得了一定的進展。本文對近年來與RII相關(guān)動物模型與發(fā)病機制的研究進展進行歸納總結(jié)。

      1 RII常見動物模型

      用于研究視網(wǎng)膜疾病的動物主要包括大鼠、小鼠、獼猴、家兔、家豬、貓和犬等[3]。常見的視網(wǎng)膜缺血模型包括升高眼壓法、視神經(jīng)或血管結(jié)扎法、光動力或藥物注射誘導(dǎo)法等。

      1.1 升高眼壓法

      升高眼壓法主要是通過輸液管將37℃的生理鹽水引入前房,增加輸液管的高度使眼內(nèi)壓提升至70~90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),維持時間一般為45~60 min,顯微鏡下可以觀察到虹膜變白和視網(wǎng)膜動脈白化等現(xiàn)象[4]。這種方法多用于制作急性視網(wǎng)膜缺血或急性青光眼模型。也有采用前房注射聚苯乙烯珠誘導(dǎo)慢性高眼壓模型,在單次注射聚苯乙烯珠后,高眼壓至少能夠維持3 個月,導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell,RGC)發(fā)生漸進性萎縮[5]。

      1.2 視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法

      大鼠眼動脈在視神經(jīng)鞘膜內(nèi)與視神經(jīng)伴行,采用視神經(jīng)結(jié)扎或鉗夾法等機械性損傷可有效阻斷視網(wǎng)膜血供。KONRAD K 等[6]持續(xù)結(jié)扎大鼠球后視神經(jīng)束60 min 后,觀察到視網(wǎng)膜血流中斷,視網(wǎng)膜電流圖顯示a、b 波振幅明顯降低,超微結(jié)構(gòu)觀察中可見細胞核固縮和殘留線粒體。JONAS JB 等[7]采用鉗夾球后視神經(jīng)束法制作恒河猴視網(wǎng)膜中央動脈(central artery retina,CRA)閉塞模型,鉗夾時間為97~300 min,通過眼底照相和熒光素眼底血管造影證實CRA閉塞成功。在中老年動脈粥樣硬化和動脈高血壓的恒河猴中,CRA閉塞的持續(xù)時間與視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的可見性降低和視盤蒼白程度之間具有相關(guān)性,CRA 閉塞的持續(xù)時間為240 min 或以上,神經(jīng)纖維層幾乎全部出現(xiàn)損傷和嚴重視神經(jīng)萎縮[8]。

      1.3 血管結(jié)扎法

      雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)或聯(lián)合雙側(cè)椎動脈結(jié)扎,即2 或4 血管閉塞法,是研究視網(wǎng)膜缺血模型的常用方法[9]。BCCAO 誘導(dǎo)的低灌注性視網(wǎng)膜病變典型病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡和膠質(zhì)細胞活化增生[10]。有學(xué)者[11-12]通過建立BCCAO 模型,觀察到視網(wǎng)膜動脈變細、靜脈擴張等眼底表現(xiàn),形態(tài)學(xué)研究顯示視網(wǎng)膜感光細胞發(fā)生明顯的病理性損害。局部血管結(jié)扎主要是將視網(wǎng)膜中央動脈、靜脈和視神經(jīng)束一起進行結(jié)扎,或剪開球后視神經(jīng)鞘膜,僅分離并鉗夾CRA,60 min后松開,可以觀察到眼底視網(wǎng)膜血流中斷和再灌注現(xiàn)象[13]。

      1.4 光動力誘導(dǎo)法

      此法通常采用注射誘導(dǎo)劑聯(lián)合激光制作眼底分支血管缺血模型,單純激光或單純誘導(dǎo)劑干預(yù)并不能成模。WANG RS 等[14]通過注射血卟啉衍生物2 h 后再給予氪紅色激光照射(波長647 nm)誘導(dǎo)前部缺血性視神經(jīng)病變大鼠模型,病變早期可見視盤水腫,后期出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄。也有學(xué)者[15]采用注射赤蘚紅素B 染液加激光誘導(dǎo)制備后部缺血性視神經(jīng)病變模型。國內(nèi)有研究[16]采用光化學(xué)法誘導(dǎo)兔視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞模型,觀察到阻塞區(qū)域單位面積內(nèi)血液灌注量明顯下降。

      1.5 藥物誘導(dǎo)法

      常用誘導(dǎo)劑如血管內(nèi)皮素-1(endothefin,ET-1),由于其強大的血管收縮作用,會導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血和氧化應(yīng)激,加重RGC 凋亡和視神經(jīng)軸突退行性損傷[17]。在大鼠眼球后植入ET-1 滲透式微型泵,通過熒光標記法監(jiān)測發(fā)現(xiàn)了RGC 存活時間減少,伴有視神經(jīng)血流灌注量減少68%[18]。在兔視神經(jīng)周圍植入ET-1 微型泵后,觀察到2 周時視神經(jīng)微血管中氧蛋白的表達增加,8周后RGC 數(shù)量減少,內(nèi)、外核層隨著時間的推移變得越來越薄[19]。

      2 RII主要發(fā)病機制

      2.1 氧自由基損傷

      正常情況下,細胞內(nèi)存在的氧自由基和氧化物處于較低水平,維持細胞內(nèi)的多種生理活動。然而組織缺血、缺氧時活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量增加,通過介導(dǎo)線粒體呼吸鏈、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,NOS)等多種途徑產(chǎn)生細胞毒性作用[20]。NADPH 氧化酶的非吞噬細胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase,NOX)有許多亞型,其中,在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮、周細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和小膠質(zhì)細胞中表達的亞型主要包括NOX1、NOX2 和NOX4 等,其過度表達增加了ROS 的形成,誘發(fā)視網(wǎng)膜新生血管形成、毛細血管阻塞、血管滲漏和視網(wǎng)膜色素上皮細胞加速衰老等病變[21-22]。體外研究[23]發(fā)現(xiàn),巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞的過度活化使誘導(dǎo)型NOS 表達上調(diào),釋放大量一氧化氮(nitric oxide,NO),過量NO 通過與超氧陰離子結(jié)合形成強氧化物,也會加重視網(wǎng)膜組織的氧化損傷。

      2.2 線粒體功能障礙

      線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)介導(dǎo)的神經(jīng)元細胞死亡被認為是RII導(dǎo)致線粒體功能障礙后的一個重要病理機制[24]。線粒體基質(zhì)特異性蛋白親環(huán)素D(cyclophilinD,CypD)是MPTP 的重要結(jié)構(gòu)組成部分,在MPTP 的開放中起著關(guān)鍵作用,CypD 水平升高,導(dǎo)致局部缺血后線粒體膜電位異常和ROS 的過度生成[25]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,MTFA)是一種細胞核編碼的DNA 結(jié)合蛋白,在線粒體基因表達和線粒體DNA 維護中起著重要作用[26]。KIM SY 等[27]研究發(fā)現(xiàn),急性視網(wǎng)膜缺血可以誘發(fā)MTFA 蛋白和CypD 蛋白的過度表達,二者是介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡的重要因素。

      2.3 興奮性氨基酸毒性作用

      Na+的細胞轉(zhuǎn)運依賴于Müller 細胞內(nèi)谷氨酸-天冬氨酸轉(zhuǎn)運體(glutamate-aspartate transporter,GLAST),GLAST 的喪失會導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞退行性損害[28]。興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(excitatory amino acid transporter-1,EAAT-1)的功能紊亂往往是導(dǎo)致興奮性細胞死亡的關(guān)鍵因素[29]。研究[28]發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜缺血、缺氧時激活p38 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路,肌動蛋白細胞骨架不穩(wěn)定,使細胞膜上Na+/K+-ATP 酶減少,細胞能量生成障礙,Müller 細胞內(nèi)Na+濃度增加,對細胞外谷氨酸的攝取減少,導(dǎo)致Ca2+通道異常開放,細胞內(nèi)Ca2+超載,激活線粒體膜上半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)通路,細胞色素C 釋放增加,啟動細胞凋亡。Ca2+超載導(dǎo)致的線粒體功能障礙引起氧自由基過量釋放,加重氧化損傷,使神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞,直到死亡,被稱為興奮性神經(jīng)毒性作用[30]。

      2.4 炎癥反應(yīng)

      視網(wǎng)膜缺血時,組織中許多炎性因子和趨化因子被激活,如白細胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)過度表達,細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule,ICAM-1)、組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等含量增加,趨化蛋白如細胞因子誘導(dǎo)的中性粒細胞化學(xué)引誘物(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,CINC)和巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein,MIP)等表達水平也明顯增加[31]。在眼缺血綜合征模型中發(fā)現(xiàn),Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)介導(dǎo)的髓樣分化因子(myeloid differentiation factor88,MYD88)信號通路被激活,并啟動下游炎癥信號,激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB,NF-κB)和轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等,進一步調(diào)控炎性因子的表達[32]。

      2.5 細胞凋亡

      細胞凋亡是一種在多種內(nèi)源性或外源性因素誘導(dǎo)下,相關(guān)基因調(diào)控機制被激活,導(dǎo)致細胞發(fā)生特異性程序化死亡的現(xiàn)象。缺血時ROS 過度釋放,對B 細胞原癌基因(B-cell lymphocyte/leukemia-2,Bcl-2)家族參與的神經(jīng)細胞凋亡具有調(diào)控作用[33]。Bcl-2 為凋亡抑制蛋白,主要位于線粒體外膜,拮抗細胞質(zhì)內(nèi)的促凋亡因子對線粒體的攻擊;Bcl-2關(guān)聯(lián)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)為凋亡促進蛋白,與線粒體內(nèi)膜的腺苷轉(zhuǎn)位因子和外膜的電壓依賴性陰離子通道結(jié)合,介導(dǎo)線粒體跨膜通道開放,釋放細胞色素C 進入細胞質(zhì),激活細胞質(zhì)內(nèi)一系列促凋亡因子,最后激活下游Caspase-3,完成蛋白質(zhì)降解。在視網(wǎng)膜缺血模型中觀察到,RGC層、內(nèi)核層和內(nèi)、外叢狀層可見Bax蛋白表達增加、Bcl-2表達降低現(xiàn)象[34]。GALINA D 等[4]將RGC 進行氧糖剝奪離體培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn),細胞中有引發(fā)壞死的受體相互作用蛋白激酶(receptor-interacting protein kinase,RIPK)表達。MESTER L等[35]發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜低灌注可以誘導(dǎo)細胞毒性信號通路中的c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kainse,JNK)和MAPK 磷酸化,在介導(dǎo)缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元退行性病變過程中發(fā)揮了重要作用。

      3 小結(jié)

      本文總結(jié)發(fā)現(xiàn),RII與腦低灌注損傷關(guān)系密切,已成為神經(jīng)科和眼科等領(lǐng)域交叉疾病的研究熱點。誘導(dǎo)RII 動物模型的方法以血管壓迫類或血管結(jié)扎類為主。氧自由基損傷是視網(wǎng)膜缺血發(fā)病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié),并伴隨出現(xiàn)線粒體能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用等現(xiàn)象,最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡的結(jié)局。因此在本病的治療上,緩解視網(wǎng)膜缺血、缺氧狀態(tài),阻止細胞凋亡的發(fā)生與加重,是改善視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞功能,進而提高患者視覺質(zhì)量的關(guān)鍵點。在今后的工作中,還需要更深入地展開RII的防治研究。

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