張思琪 馮馨儀 楊財(cái)容 羅智文 祁偉亮 劉松青

（成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130）

雞腿菇（Coprinus comatus）又名毛頭鬼傘，隸屬真菌門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬。雞腿菇營(yíng)養(yǎng)豐富，且可藥用，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于食用菌栽培基質(zhì)中的玉米芯、秸稈等在生長(zhǎng)過程中會(huì)對(duì)土壤等栽培環(huán)境中的重金屬產(chǎn)生一定的吸附和轉(zhuǎn)化作用，而食用菌在生長(zhǎng)發(fā)育過程吸收了這些原料中的重金屬，導(dǎo)致食用菌產(chǎn)品會(huì)涉及重金屬污染問題。此外，培養(yǎng)基質(zhì)中所添加的石灰、過磷酸鈣等輔料中的重金屬通過食用菌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化，也會(huì)富集到食用菌體內(nèi)。在眾多重金屬污染中，鉛、砷、汞、鎘和鋁是食用菌中最常見的重金屬元素[1]。

一般來(lái)說(shuō)，在食用菌生長(zhǎng)過程中，其菌絲的生長(zhǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng)，子實(shí)體的生長(zhǎng)周期較短，因而吸收重金屬的主要途徑是通過菌絲吸收而非子實(shí)體。菌絲會(huì)通過被動(dòng)運(yùn)輸、主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞轿赵耘喹h(huán)境中的重金屬，重金屬離子通過這些方式穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部干擾、破壞食用菌的生理活性[2]。王松華等[3]報(bào)道靈芝菌絲在不同鎘（Cd）濃度處理下，菌絲鮮重及總糖、脯氨酸、還原糖含量與Cd濃度呈負(fù)相關(guān)，超氧化物歧化酶（SOD）活性與Cd 濃度呈正相關(guān)，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。楊小紅等[4]研究在不同Pb、Cd、Hg、As 濃度處理下的平菇菌絲生長(zhǎng)狀況和子實(shí)體產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)在較高濃度條件下，菌絲的生長(zhǎng)狀況較差，生長(zhǎng)速率減慢，子實(shí)體產(chǎn)量也顯著降低；且子實(shí)體富集重金屬的情況與環(huán)境中的重金屬濃度呈正相關(guān)關(guān)系。張琳[5]通過液體培養(yǎng)黃傘菌絲并且添加不同濃度的Mn2+、Pb2+，測(cè)定其各項(xiàng)生理指標(biāo)及富集情況，結(jié)果表明當(dāng)Pb2+和Mn2+濃度為700 mg/L 時(shí)，黃傘菌絲體內(nèi)所含鉛和錳的量達(dá)到峰值。盧嬌嬌[2]發(fā)現(xiàn)不同銅（Cu）濃度對(duì)平菇菌絲生長(zhǎng)的影響不同，低濃度下菌絲生長(zhǎng)速度加快，濃度持續(xù)增加時(shí)，能明顯抑制菌絲生長(zhǎng)；菌絲體內(nèi)的抗氧化酶活性也發(fā)生變化。Liu 等[6]用重金屬處理食用菌，探究其抗氧化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)食用菌體內(nèi)的一些酶會(huì)受到影響，刺激體內(nèi)分泌抗氧化酶來(lái)響應(yīng)。熊曉斌等[7]研究不同濃度的鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）、砷（As）等重金屬對(duì)杏鮑菇和金針菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)Pb、Cd、Hg、As 能夠不同程度地抑制這兩種菇的菌絲生長(zhǎng)。

前人已研究重金屬脅迫對(duì)部分食用菌菌絲及子實(shí)體可能產(chǎn)生的影響，包括菌絲或子實(shí)體富集重金屬的能力及其生理變化等，不同食用菌菌絲在不同的重金屬環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況有所差別。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB7096—2014《食用菌及其制品》和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2762—2012《食品中污染物限量》對(duì)食用菌及其制品的重金屬鉛（以Pb 計(jì)）的含量限定值為≤1.0 mg/kg。雞腿菇作為人們?nèi)粘Ｏ矏鄣氖秤镁?，具有非常大的?jīng)濟(jì)價(jià)值。本文通過探究在不同Pb2+濃度下雞腿菇菌絲的生長(zhǎng)速率及各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，為人工栽培雞腿菇中的重金屬脅迫響應(yīng)研究及重金屬控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌種。雞腿菇（特大9201）一級(jí)種，購(gòu)于江蘇省高郵市聯(lián)誼食用菌場(chǎng)。

（2）主要試劑。硝酸鉛、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲硫氨酸、氮藍(lán)四唑、EDTA-Na2、核黃素、創(chuàng)愈木酚、過氧化氫、高氯酸、硝酸。

（3）主要儀器和設(shè)備。高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、分光光度計(jì)、火焰原子吸收分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）雞腿菇菌絲固體培養(yǎng)。配制PDA 固體培養(yǎng)基，高溫滅菌30 min，待稍冷卻后加入適量的已滅菌硝酸鉛母液，使培養(yǎng)基中Pb2+的濃度分別為0 mg/mL（對(duì)照）、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL 和25 mg/mL，注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成固體培養(yǎng)基。在超凈工作臺(tái)下，將供試菌種接種于培養(yǎng)基中心位置。將培養(yǎng)皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 天，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況。每個(gè)處理3 次重復(fù)。

（2）雞腿菇菌絲液體培養(yǎng)。配置PDA 液體培養(yǎng)基，高溫滅菌30 min，冷卻后分裝至錐形瓶中，每瓶約100 mL。用已滅菌的直徑5 mm 打孔器在已活化的雞腿菇菌落中取菌種塊，接種至錐形瓶中，置于160 r/min、25 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)5 天。在錐形瓶中添加標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉛溶液，使Pb2+濃度分別為0 mg/L（對(duì)照）、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L和25 mg/L，每個(gè)處理3 次重復(fù)，置于25 ℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)2 天。培養(yǎng)完成后將其倒入離心管中，于4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min，去上清液留取沉淀，然后將沉淀取出，用于制備粗酶液。

（3）菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定。采用十字交叉法分別在1 天、7 天時(shí)測(cè)量菌落直徑并記錄，每個(gè)處理測(cè)定3 次，計(jì)算其平均值及菌絲生長(zhǎng)速率。

（4）菌絲體鉛離子含量測(cè)定。依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 5009.12—2010《食品中鉛的測(cè)定》方法測(cè)定。首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L 和40.0 mg/L的鉛標(biāo)準(zhǔn)液各10 μL，按照濃度從低到高依次進(jìn)樣，測(cè)定其吸光值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后采用濕法消解處理樣品，并通過火焰原子分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值，計(jì)算結(jié)果。

（5）菌絲體丙二醛含量、抗氧化酶活性測(cè)定。參照李合生[8]著的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》測(cè)定菌絲中的丙二醛含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定參照Beauchamp 等[9]的氮藍(lán)四唑法；過氧化物酶（POD）活性測(cè)定參照Velikova 等[10]改進(jìn)的愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定參照Aebi[11]的方法，測(cè)定240 nm 處的吸光值，計(jì)算其活性。

（6）數(shù)據(jù)分析及制圖。數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS statistics 20 軟件進(jìn)行分析，使用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，用Pearson 法進(jìn)行指標(biāo)間相關(guān)性分析，所有數(shù)值均為3 次平行測(cè)定的算術(shù)平均值。采用Orgin 8.5 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Pb2+濃度處理的菌絲生長(zhǎng)速率及長(zhǎng)勢(shì)

雞腿菇菌絲經(jīng)金屬鉛處理后，菌絲顏色以對(duì)照處理較白（圖1），生長(zhǎng)速率隨培養(yǎng)基中Pb2+濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)Pb2+濃度為10 mg/L 時(shí)，生長(zhǎng)速率達(dá)到峰值，顯著快于其他處理（圖2）。說(shuō)明培養(yǎng)基中低濃度Pb2+對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但隨Pb2+濃度增加，雞腿菇菌絲生長(zhǎng)逐漸受到抑制，濃度越大，受抑制越明顯。

圖1 不同Pb2+濃度處理的雞腿菇菌絲生長(zhǎng)速率比較

圖2 不同Pb2+濃度處理的雞腿菇菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)

2.2 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體鉛含量

制作的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3 所示。

圖3 Pb2+標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖4 可知，在培養(yǎng)基中加入不同含量的Pb2+標(biāo)準(zhǔn)溶液后，雞腿菇菌絲生長(zhǎng)過程會(huì)吸收栽培環(huán)境中的Pb2+，導(dǎo)致菌絲體內(nèi)鉛含量逐漸增加，且其鉛含量與環(huán)境中的Pb2+濃度呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)Pb2+濃度為25 mg/L 時(shí)，富集量達(dá)到最大值，為1.45 mg/kg，超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。而正是由于富集到的Pb2+越多，菌絲所受到的損傷就越大，遂使菌絲生長(zhǎng)受到抑制。

圖4 雞腿菇菌絲對(duì)Pb2+的富集程度

2.3 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體丙二醛含量

丙二醛（MDA）含量能夠反映機(jī)體內(nèi)的抗氧化狀況，如脂質(zhì)過氧化速率及強(qiáng)度，也間接說(shuō)明機(jī)體組織內(nèi)的過氧化損傷程度[12]。由圖5 可知，隨著Pb2+濃度的增大，菌絲體內(nèi)的MDA 含量先顯著上升，Pb2+濃度為20 mg/L時(shí)，達(dá)最大值0.73 μmol/L，是對(duì)照處理的2.6 倍；而后隨著Pb2+濃度的繼續(xù)增大，則MDA 含量開始下降。

圖5 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的丙二醛含量

2.4 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體SOD 活性

當(dāng)機(jī)體受到脅迫生成自由基時(shí)，其體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化物歧化酶（SOD）能將有害的自由基分解成對(duì)機(jī)體無(wú)害的O2和H2O，消除機(jī)體組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化狀況，減小細(xì)胞受到的損害，是酶促防御系統(tǒng)不可或缺的組成部分[13]。如圖6 所示，雞腿菇菌絲在遭到Pb2+脅迫時(shí)，菌絲受損傷，進(jìn)而激活菌絲的一系列防御反應(yīng)。當(dāng)Pb2+濃度在0～10 mg/L時(shí)，SOD 活性增加較緩慢；當(dāng)Pb2+濃度在15～20 mg/L 時(shí)，SOD 活性顯著提升，并在20 mg/L 濃度下達(dá)到最大值，說(shuō)明在這一濃度區(qū)間，菌絲富集到更多的鉛，導(dǎo)致受到的氧化損傷逐漸加大，使得菌絲體內(nèi)抗氧化酶SOD大量增加以抵御脅迫。當(dāng)Pb2+濃度在25 mg/L 時(shí)，菌絲體SOD 活性降低，這可能是由于脅迫濃度高，導(dǎo)致酶活性降低。

圖6 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的SOD 活性

2.5 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體POD 活性

生物體內(nèi)含有多種還原劑，過氧化物酶（POD）能夠利用這些還原劑作為電子受體，以H2O2為底物，清除機(jī)體因受外界脅迫而產(chǎn)生的過氧化物，進(jìn)而使生物體受到的損害顯著降低[14]。雞腿菇菌絲體中的POD 活性隨Pb2+濃度變化的趨勢(shì)與SOD 相似，當(dāng)Pb2+濃度為20 mg/L 時(shí)，POD 活性達(dá)到最大值（圖7）。在菌絲受到逐漸加大的氧化損傷后，POD作為活性氧清除酶，也會(huì)增加其酶活來(lái)清除活性氧，減輕菌絲損傷；當(dāng)Pb2+濃度過高時(shí)，POD 活性也會(huì)受到抑制。

圖7 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的POD 活性

2.6 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體CAT 活性

過氧化氫酶（CAT）和其他抗氧化酶類似，能夠清除機(jī)體內(nèi)因環(huán)境脅迫所產(chǎn)生的過氧化氫（H2O2），使機(jī)體內(nèi)H2O2大大減少，恢復(fù)較為良好的狀態(tài)[14]。雞腿菇菌絲體中的CAT活性隨著Pb2+濃度的增加呈先增加后降低趨勢(shì)，各處理差異顯著，當(dāng)Pb2+濃度為10 mg/L時(shí)，CAT活性達(dá)到最大值（圖8）。與SOD、POD 的變化情況不同，CAT 活性的峰值在Pb2+濃度為10 mg/L 時(shí)即出現(xiàn)，隨后開始下降。其原因或許是因?yàn)镃AT 是一種含有Fe3+的金屬酶，Pb2+處理后可能會(huì)取代Fe3+，或因自由基的積累間接引起CAT 空間構(gòu)型的改變，導(dǎo)致CAT 活性下降[15]。

圖8 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的CAT 活性

2.7 不同Pb2+濃度脅迫下菌絲體不同指標(biāo)的相關(guān)性分析

當(dāng)受到外界Pb2+脅迫時(shí)，雞腿菇菌絲體會(huì)產(chǎn)生形態(tài)、生理生化方面的變化，而這些變化之間具有一定的相關(guān)性。對(duì)受Pb2+脅迫后的雞腿菇菌絲體生長(zhǎng)、Pb2+富集程度，以及與氧化相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果（表1），菌絲生長(zhǎng)速率與Pb2+富集量及SOD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)，這是由于Pb2+脅迫抑制了菌絲的生長(zhǎng)，從而使得菌絲的防御性增強(qiáng)。菌絲體內(nèi)的鉛含量與丙二醛含量及SOD、POD 活性呈極顯著正相關(guān)，這是因?yàn)榫z富集到的Pb2+越多，受到的氧化損傷就越嚴(yán)重，從而會(huì)激活菌絲體內(nèi)的抗氧化酶活性來(lái)進(jìn)行防御。此外，丙二醛含量與SOD、POD、CAT 活性均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，原因在于SOD、POD、CAT 是菌絲體內(nèi)重要的活性氧清除酶，而丙二醛含量代表菌絲受到的氧化損傷程度，因此菌絲體在受氧化損傷大時(shí)需要激活這些防御酶來(lái)進(jìn)行修復(fù)。

表1 Pb2+脅迫對(duì)雞腿菇菌絲的不同指標(biāo)相關(guān)性分析

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果顯示，在5～10 mg/L 低濃度Pb2+脅迫下，雞腿菇菌絲生長(zhǎng)速率比對(duì)照快，當(dāng)Pb2+濃度逐漸升高后，菌絲生長(zhǎng)速率變慢，生長(zhǎng)表現(xiàn)變差。菌絲體鉛含量與培養(yǎng)基中Pb2+濃度呈正相關(guān)，25 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值為1.45 mg/kg，超過國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)不同濃度Pb2+脅迫處理，菌絲體MDA含量及SOD、POD、CAT 的活性隨Pb2+濃度的增大呈先增后減趨勢(shì)。

本研究測(cè)定了雞腿菇在不同Pb2+濃度處理后菌絲生長(zhǎng)速率以及生理指標(biāo)的變化趨勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)速率在低Pb2+濃度下得到促進(jìn)，這一結(jié)果與胡清秀等[16]報(bào)道的低銅條件能促進(jìn)杏鮑菇菌絲生長(zhǎng)，表現(xiàn)菌絲粗壯、顏色潔白的結(jié)論相似。可能的原因是菌絲受到外界環(huán)境輕微刺激時(shí)，會(huì)提高自身的生活力來(lái)抵御逆境，表現(xiàn)出生長(zhǎng)旺盛的現(xiàn)象；而刺激濃度繼續(xù)提高則會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)。

在前人的研究中，隨著Pb2+、Mn2+濃度的升高，均會(huì)增加黃傘菌絲體SOD、CAT、POD 的活性，在金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)，這些抗氧化酶活性則會(huì)下降[5]。不同濃度重金屬鎘處理的靈芝菌絲[3]、不同濃度鎘和鉛處理的長(zhǎng)根菇菌絲[17]，其試驗(yàn)結(jié)果均表現(xiàn)菌絲體內(nèi)的抗氧化酶活性隨著金屬離子濃度增加而先增加、達(dá)到最大值后開始下降，與本研究結(jié)果一致。

另有學(xué)者研究了真姬菇、雙孢蘑菇、黑木耳、平菇、白靈菇5 種食用菌菌絲對(duì)環(huán)境中的鉛、鎘、汞、砷等重金屬的富集情況，結(jié)果顯示這5 種食用菌菌絲所含重金屬的量均隨著環(huán)境重金屬濃度的增加呈現(xiàn)先增加，而后增速減慢，最終達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的趨勢(shì)[18]。本試驗(yàn)中隨著外界Pb2+濃度的增加，雞腿菇菌絲體內(nèi)富集的金屬鉛含量也逐漸增加，但并未達(dá)到最大值，出現(xiàn)這種差異的可能原因是本試驗(yàn)所設(shè)Pb2+濃度最大只到25 mg/L，可能尚未達(dá)到菌絲所能承受的最大限度，未來(lái)可做進(jìn)一步研究。

隨著生活品位的不斷提升，人們對(duì)食用菌的品質(zhì)要求越來(lái)越高。目前關(guān)于包括雞腿菇在內(nèi)的食用菌栽培技術(shù)、開發(fā)應(yīng)用等的研究已有很多，但有關(guān)食用菌對(duì)重金屬的吸附機(jī)制方面的研究還較少。本研究對(duì)不同濃度鉛離子處理的雞腿菇菌絲體丙二醇含量、抗氧化酶系統(tǒng)和鉛富集量等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，可為雞腿菇重金屬脅迫研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)栽培環(huán)境中Pb2+濃度達(dá)到25 mg/L 時(shí)，雞腿菇菌絲體的含鉛量超出了國(guó)家限定標(biāo)準(zhǔn)，不符合食品安全要求。這一結(jié)果可為控制環(huán)境中重金屬含量，保障食品安全提供重要參考。但本試驗(yàn)只選取了一個(gè)雞腿菇品種為對(duì)象，而未對(duì)其他雞腿菇品種開展相關(guān)試驗(yàn)，并且未涉及對(duì)子實(shí)體的影響相關(guān)研究，具有一定的局限性，尚需進(jìn)一步深入研究。