小膠質細胞介導的突觸修剪在慢性腦缺血中的作用及其機制

湯詩怡 賴梅菁 邱美茜 詹麗璇

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經內科，廣州醫(yī)科大學神經科學研究所（廣州 510260）

慢性腦缺血又稱慢性腦低灌注，是一組因持續(xù)的腦血流灌注減少所致的慢性腦功能障礙綜合征，是導致血管性認知功能障礙的主要原因之一[1]。近年來，研究表明，慢性腦缺血導致的認知功能障礙與突觸異常丟失有關[2]。突觸是神經元之間信息傳遞的關鍵組件，是組成神經回路、產生認知記憶的基礎[3]。研究證實，在正常大腦發(fā)育過程中，小膠質細胞會選擇性地吞噬部分多余的神經聯系，使保留下來的功能性突觸相互連接，形成精確的神經環(huán)路，這種小膠質細胞選擇性消除突觸的現象被稱為突觸修剪[4]。當小膠質細胞的吞噬功能受損或異常激活時，突觸修剪異常，導致突觸的異常堆積或過度丟失，從而誘發(fā)或加重神經系統(tǒng)的退行性病變[5]。已有報道證實，在慢性腦缺血中，認知功能的下降除了與神經元受損引起的突觸丟失有關以外，小膠質細胞通過多種分子機制介導的異常突觸修剪也發(fā)揮重要作用[5-7]。本文將就小膠質細胞介導的突觸修剪在慢性腦缺血中的作用及其分子機制進行綜述。

1 慢性腦缺血后小膠質細胞介導的異常突觸修剪

突觸是神經元之間進行信息傳遞的重要結構。大腦在發(fā)育過程中，會產生受損或多余的突觸，這些突觸的選擇性清除或修剪，有利于成年大腦塑造成熟的神經環(huán)路[4]。其中，小膠質細胞在突觸修剪中發(fā)揮關鍵的作用。小膠質細胞是腦內固有的免疫細胞，也是抵御中樞神經系統(tǒng)損傷的重要防線。小膠質細胞不僅可分泌炎癥因子，介導炎癥反應，也能通過吞噬作用參與腦缺血后的神經損傷與修復[9]。一方面，小膠質細胞可通過選擇性地吞噬受損的或不成熟的突觸，維持突觸及神經環(huán)路的穩(wěn)定性，從而促進神經回路的發(fā)展[4]，該過程也被稱為突觸修剪，另一方面，小膠質細胞也可吞噬應激狀態(tài)下存活的神經元和突觸，導致缺血性腦損傷和神經功能缺損[9]，該過程屬于異常的突觸修剪。此外，當小膠質細胞吞噬突觸減少，突觸修剪異常，會造成突觸異常堆積，從而使神經回路細化持續(xù)的缺陷。

目前，關于小膠質細胞異常吞噬突觸的現象已經在多種神經系統(tǒng)疾病研究中得到證實，例如阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）、精神分裂癥（schizophrenia，SCZ）和癲癇等。在AD早期，β-淀粉樣（amyloid beta，Aβ）斑塊尚未沉積于突觸時，補體組分蛋白1q（complement component 1q，C1q）可定位于突觸上，刺激小膠質細胞過度吞噬正常的突觸，使AD早期即出現突觸丟失[10]。在疾病后期，大量Aβ斑塊沉積于突觸上，激活補體級聯信號通路，使小膠質細胞對突觸過度吞噬和清除，最終導致認知功能障礙[11]。SELLGREN 等[12]發(fā)現，在SCZ患者皮層中，小膠質細胞過度吞噬興奮性突觸，導致興奮性突觸和抑制性突觸比例失衡，從而引起認知功能障礙和思維障礙。類似地，在癲癇患者中，小膠質細胞過度吞噬抑制性突觸，造成興奮性突觸和抑制性突觸比例失衡，從而誘發(fā)癲癇[13]。然而，目前尚無直接證據表明慢性腦缺血后突觸的損傷或丟失與小膠質細胞的異常修剪相關。有研究者使用經典的雙側頸總動脈永久性兩血管閉塞（2-vessel occlusion，2-VO）制備大鼠慢性腦缺血模型，發(fā)現在雙側頸總動脈結扎后2周，海馬CA1區(qū)和前額葉皮層活化的小膠質細胞向突觸聚集，突觸素（synaptophysin，SYN）和突觸后致密蛋白-95（postsynaptic density protein 95，PSD-95）的表達降低，樹突棘的密度明顯減少[14-15]。SHI等[9]也發(fā)現，在小鼠一側大腦中動脈閉塞后第14天，在皮層缺血中心區(qū)周圍形成的膠質瘢痕中的星形膠質細胞和小膠質細胞，均可檢測到SYN和PSD-95等突觸成分，該現象在小膠質細胞中尤顯著。當抑制吞噬相關受體后，小膠質細胞的吞噬功能受抑制，小鼠的腦損傷減輕，神經功能缺損改善。

突觸異常丟失在許多神經系統(tǒng)疾病的早期階段即可出現，且隨著臨床癥狀的進展而增加。但目前尚不清楚突觸丟失是否會觸發(fā)其他病理過程的發(fā)生發(fā)展，抑或只是對神經元損傷的潛在反應。盡管如此，突觸異常丟失是許多神經損傷中的常見事件，與AD和其他疾病的認知功能障礙有關。因此提示腦缺血后海馬區(qū)和前額葉突觸的丟失可能與小膠質細胞對突觸的異常吞噬有關，即過度活化的小膠質細胞可吞噬突觸，導致突觸異常丟失，引起認知功能下降。目前，關于小膠質細胞介導的突觸修剪在慢性腦缺血中的作用及分子機制的相關研究較少。與AD、PD、SCZ和癲癇等神經系統(tǒng)疾病相比，突觸修剪在慢性腦缺血中除了發(fā)生的腦區(qū)不同以外，相關的分子機制也可能不同。

2 慢性腦缺血后小膠質細胞介導的異常突觸修剪的分子機制

小膠質細胞吞噬突觸由多種分子機制介導，其過程大致可分為3步。首先，受損的突觸釋放C1q、補體3（complement 3，C3）和趨化因子 C-X3-C-基序配體 1（C-X3-C motif chemokine ligand 1，CX3CL1）等“找到我”信號，分別作用于小膠質細胞上的補體受體3（complement receptor 3，CR3）和C-X3-C-基序受體1（C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1）等[16-19]，使小膠質細胞被募集到突觸周圍。繼而，小膠質細胞受體和突觸上的配體之間形成吞噬小體，該過程主要由“吃我”信號介導，例如磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）/髓系細胞2表達觸發(fā)受體（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）和多重表皮生長因子樣結構域蛋白10（multiple EGF like domains 10，MEGF10）、Mer酪氨酸激酶受體（tyrosine-protein kinase Mer，MERTK）等。相反地，突觸還可釋放“不要吃我”信號，如CD47和CD200，分別作用于小膠質細胞的CD47受體SIRPα和CD200R，對抗“吃我”信號，從而抑制小膠質細胞對突觸的吞噬。最后，突觸被小膠質細胞吞噬后消化分解。此外，星形膠質細胞也可以通過分泌相關的細胞因子，如白細胞介素（Interleukin-33，IL）-33和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β等協同調節(jié)小膠質細胞吞噬突觸[20]。

2.1 “找到我”信號

2.1.1 C1q/C3-C3R補體途徑作為先天免疫系統(tǒng)的一部分，是目前在小膠質細胞對突觸修剪的分子調節(jié)機制中研究較多的途徑。C1q和C3是補體途徑中重要的組成成分，C3通過補體經典途徑和替代途徑裂解成C3a聚集在突觸表面，向吞噬細胞提供定位信號以供吞噬降解[16，19，21]。在大鼠視網膜發(fā)育模型中，C1q也可作為“找到我”信號，定位并標記在需要修剪的突觸，供小膠質細胞上的C3R識別，進而介導小膠質細胞對突觸的吞噬和修剪，完善視覺通路[22]。有研究表明，腦低灌注可誘導大鼠前額葉和海馬齒狀回的補體途徑激活，這兩個腦區(qū)C1q的表達顯著增加，且小膠質細胞被激活、吞噬功能增強，進而加重了慢性腦缺血后的炎癥和神經變性[14]。在大鼠2-VO后2～4周，紋狀體中粘附和吞噬髓磷脂的反應性小膠質細胞數量增加，且伴隨著補體C3及其受體C3aR的表達上調。給予C3aR拮抗劑SB290157后，慢性腦缺血大鼠紋狀體中黏附于髓磷脂的小膠質細胞數量顯著減少，白質損傷減輕，認知功能障礙改善[23]。上述研究表明，慢性腦缺血可能通過激活C1q/C3-C3R途徑，促進小膠質細胞對突觸的過度吞噬，加重腦白質損傷。

2.1.2 CX3CL1/CX3CR1CX3CL1又稱Fractalkine，屬于趨化因子CX3CL1家族成員之一，在海馬神經元中高表達[24]，其受體CX3CR1則主要在小膠質細胞中表達。CX3CL1作為可溶性的“找到我”信號，定位于突觸，趨化小膠質細胞向突觸周圍聚集，進而被小膠質細胞膜受體CX3CR1識別，誘導小膠質細胞吞噬突觸，參與突觸修剪過程[24，26]。當敲除cx3cr1基因后，慢性腦缺血小鼠海馬CA1區(qū)和齒狀回激活的小膠質細胞向突觸趨化和聚集減少，海馬CA1區(qū)的SYN和PSD-95表達較野生型大鼠增多，腦白質損傷和認知障礙減輕[25-27]，表明敲除cx3cr1基因可以抑制小膠質細胞對突觸的過度吞噬，阻止突觸的丟失。

雖然在動物或離體研究中，通過抑制上述“找到我”信號，可減少小膠質細胞對突觸的異常吞噬，但目前在慢性腦缺血患者中，小膠質細胞吞噬突觸的直接證據尚未得到證實，且仍未發(fā)現有明確的藥物可通過抑制“找到我”信號，阻止小膠質細胞向突觸靠近，減少異常的突觸吞噬。有研究者在體外實驗中使用米諾環(huán)素抑制小膠質細胞活化和增殖，能減少小膠質細胞對突觸的吞噬[45]。米諾環(huán)素作為一種半合成的腦滲透性四環(huán)素抗生素，能否改善慢性腦缺血后的認知功能障礙，值得進一步的研究。

2.2 “吃我”信號：PS/TREM2“吃我”即吞噬信號的識別，是小膠質細胞受體與凋亡細胞膜配體之間形成吞噬小體。當小膠質細胞檢測到突觸表面暴露的“吃我”信號時，即迅速識別并吞噬這些突觸。在這一過程中，PS/TREM2是大多數研究的關注點。

在細胞凋亡發(fā)生的早期，PS作為細胞凋亡早期的標記物，可從受損突觸的局部質膜內側轉至細胞膜的表面，作為“吃我”信號被小膠質細胞的吞噬受體識別[28-29]，促使小膠質細胞靶向吞噬突觸。表達于小膠質細胞中的吞噬受體眾多，其中最受關注的是TREM2。TREM2是免疫球蛋白超家族的一種I型跨膜受體，作為“損傷感受器”，被暴露的PS直接識別，介導小膠質細胞吞噬突觸[30]。SCOTT-HEWITT 等[29]發(fā)現，在海馬神經元和小膠質細胞共培養(yǎng)中，無論是降低小膠質細胞的TREM2表達，還是使用膜聯蛋白V阻斷暴露的PS，均可抑制小膠質細胞對海馬突觸的吞噬，防止突觸的過度丟失。此外，在AD模型小鼠中，病理性的Aβ聚集在突觸上，誘發(fā)TREM2識別突觸上暴露的PS，導致小膠質細胞對突觸的過度吞噬[29]。慢性腦缺血后相關腦區(qū)神經元凋亡增多，受損神經元的突觸可能也出現PS暴露，然而，降低TREM2的表達或阻斷暴露的PS是否能保護突觸免受小膠質細胞的吞噬，目前尚未發(fā)現相關文獻報道。值得思考的是，當阻斷所有暴露的PS時，是否會影響凋亡細胞的正常清除，從而減弱小膠質細胞對內環(huán)境的監(jiān)視作用，加重慢性腦缺血的白質損傷。

2.3 “不要吃我”信號：CD47-SIRPα和CD200/CD200R為了完成吞噬，小膠質細胞不僅要識別突觸上的“吃我”信號，可能還需抑制突觸表面的“不要吃我”信號，如CD47和CD200等[31]。神經細胞膜上的CD47信號通過其表達在小膠質細胞上的受體SIRPα，抑制小膠質細胞對突觸的吞噬，而缺乏這兩種蛋白的小鼠則表現出過度的小膠質細胞吞噬，導致背外側膝狀體突觸的丟失[32]。除CD47-SIRPα外，CD200/CD200R途徑是目前研究小膠質細胞介導突觸修剪的另一種“不要吃我”信號。CD200表達于神經元表面，CD200R則由小膠質細胞表達[33]。在與存在Aβ斑塊的野生型小鼠相比，cd200基因敲除小鼠吞噬Aβ蛋白的能力增加[34]。通過表達這些“不要吃我”的信號，神經元可阻止小膠質細胞對學習和記憶有貢獻的突觸的吞噬。然而，目前關于“不要吃我”信號在慢性腦缺血中的研究仍然缺乏，所以CD47-SIRPα和CD200/CD200R信號是否參與調控慢性腦缺血后小膠質細胞對突觸的修剪，值得進一步的研究。

2.4 星形膠質細胞協同作用星形膠質細胞為神經元的生長提供營養(yǎng)支持，并在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中參與突觸修剪。它不僅可以作為吞噬細胞，通過兩種表達于其表面的吞噬受體MEGF10和MERTK介導神經突觸的修剪，還可通過釋放IL-33和TGF-β等細胞因子，參與小膠質細胞的突觸修剪，在腦的正常發(fā)育和病理過程中都起著重要作用。

研究表明，星形膠質細胞上的MEGF10和MERTK吞噬受體通過識別靶標碎片發(fā)出的PS等“吃我信號”來啟動吞噬過程。當敲除megf10或mertk基因使星形膠質細胞MEGF10或MERTK表達降低時，小鼠因突觸修剪缺陷，而表現視覺通路發(fā)育障礙。有研究還顯示，在急性腦卒中后的亞急性期，梗死區(qū)周圍的膠質瘢痕處，MEGF10和MERTK蛋白表達升高，星形膠質細胞過度吞噬突觸，阻礙了突觸再生和神經修復[9]。

IL-33是IL-1家族細胞因子之一，主要由星形膠質細胞產生和分泌，進而與表達于小膠質細胞的受體白介素1受體樣蛋白1（interleukin 1 receptor like 1，IL1RL1）結合，促進小膠質細胞對突觸的吞噬，參與中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育過程。IL-33也表達于成年海馬的神經細胞中，并以一種神經元活動依賴的方式調節(jié)海馬突觸修剪。當沉默IL-33或IL1RL1后，神經連接會因突觸吞噬降低而發(fā)生整合障礙[35]。同樣地，在AD小鼠模型中，當降低IL-33的表達或敲除il1rl1基因時，小膠質細胞對突觸的吞噬受抑制，最終導致過量的突觸堆積[36]。

TGF-β對維持小膠質細胞的靜息狀態(tài)至關重要。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型。不同亞型的TGF-β在突觸修剪中發(fā)揮不同的作用。研究表明，在Aβ寡聚體誘導的AD小鼠模型中，星形膠質細胞分泌的TGF-β1能夠抑制小膠質細胞過度吞噬導致的海馬CA1區(qū)突觸丟失。體外實驗證實，當增加培養(yǎng)基中的TGF-β2和TGF-β3，會導致海馬神經元PSD95的表達減少[37]。其中，TGF-β3還可誘導海馬神經元C1q的表達上調，后者通過與小膠質細胞上的CR3來介導突觸修剪。上述研究表明，星形膠質細胞在調控小膠質細胞修剪突觸的過程中，可通過分泌不同亞型的TGF-β，發(fā)揮不同的作用。其中，TGF-β1具有保護突觸的作用，而TGF-β2和TGF-β3則可促進小膠質細胞對突觸的修剪。

總之，星形膠質細胞分泌的IL-33和TGF-β能作為細胞因子參與小膠質細胞介導的突觸修剪，但在慢性腦缺血中鮮有報道。抑制星形膠質細胞分泌的這些細胞因子，可能為減輕慢性腦缺血后小膠質細胞的異常吞噬提供可能性。小膠質細胞和星形膠質細胞之間的通訊在多大程度上調節(jié)不同病理情況下的突觸修剪，也將是未來研究的一個重要領域。

3 總結與展望

吞噬信號在多種神經系統(tǒng)疾病中可調節(jié)小膠質細胞對突觸的吞噬作用，阻斷這些信號傳導可能阻止小膠質細胞對突觸的過度吞噬而產生有益結果?，F有證據表明，補體C3/C1q/C3R和趨化因子CX3CL1/CX3CR1信號通路等可能參與慢性腦缺血后小膠質細胞介導的突觸修剪，但這些信號通路介導的小膠質細胞對突觸的修剪在慢性腦缺血進展過程的各階段發(fā)揮的作用以及其對疾病的發(fā)展產生的長期作用等問題仍懸而未決。STOKHOLM等通過正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（Positron Emission Computed Tomography，PET）檢測發(fā)現，在早期的帕金森病患者，黑質中小膠質細胞大量激活，紋狀體多巴胺能神經投射功能降低[38]。鑒于慢性腦缺血與AD和多發(fā)性硬化等疾病的部分病理改變相似，能否通過PET檢測小膠質細胞吞噬突觸作為慢性腦缺血患者早期診斷的手段之一，值得進一步的研究。此外，米諾環(huán)素或補體抑制劑等針對小膠質細胞吞噬作用的研究與臨床實驗，可能為慢性腦缺血患者突觸損傷引起的認知功能障礙的早期治療提供新理論。