高通量基因測序技術(shù)將如何在食品微生物鑒定和溯源領(lǐng)域持續(xù)發(fā)力？看看專家怎么說

□ 文 張聰

微生物種類繁多，并在自然界中廣泛存在，其既可以起到有益作用，也可能給人類帶來危害。微生物引起的食品危害主要是食品的腐敗變質(zhì)，使食品的營養(yǎng)價(jià)值降低或完全喪失。其中，隨著食品生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大和食品貿(mào)易的國際化，食源性致病微生物的控制面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)—食源性致病微生物導(dǎo)致的全球食品安全問題不斷發(fā)生。例如，單增李斯特菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌和阪崎克羅諾桿菌等廣泛存在，且與疾病暴發(fā)密切相關(guān)。

為有效管控食品中的致病微生物，我國制定了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》（GB 14881-2013）。其中提到，食品加工過程中的微生物監(jiān)控是確保食品安全的重要手段，是驗(yàn)證或評(píng)估目標(biāo)微生物控制程序有效性，以及確保整個(gè)食品質(zhì)量和安全體系持續(xù)改進(jìn)的工具。

由此看來，食品微生物檢驗(yàn)是衡量食品安全質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生情況的重要手段。然而，普通檢測手段往往僅能檢測食品中微生物的種類和數(shù)量，并不能進(jìn)行追根溯源。因此，高效準(zhǔn)確、信息容量大的高通量基因測序技術(shù)在近幾年被逐漸應(yīng)用到食品微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域，其可在信息缺乏或多種微生物存在的情況下對食源性致病微生物進(jìn)行溯源和分析，以此為食源性微生物疾病預(yù)防和控制提供重要的依據(jù)。為了解高通量基因測序技術(shù)這一高精尖技術(shù)的發(fā)展，詳細(xì)分析該技術(shù)在食品微生物領(lǐng)域的應(yīng)用，《食品安全導(dǎo)刊》雜志特設(shè)“高通量基因測序技術(shù)用于食品微生物鑒定和溯源”專題，邀請專家進(jìn)行深入探討，來看看他們都說了些什么吧。

問：高通量基因測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)得到長足發(fā)展，但其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用是怎樣的？能否談?wù)劯咄炕驕y序技術(shù)的前世今生？

曾靜：高通量基因測序技術(shù)又稱下一代測序技術(shù)（NGS）。相對于一代測序技術(shù)，高通量測序技術(shù)具有準(zhǔn)確、靈活、高通量及單堿基成本低等優(yōu)勢。在微生物高通量測序中，全基因組測序技術(shù)應(yīng)用較為廣泛，它能檢測樣品中各遺傳物質(zhì)的相關(guān)性，從而追溯致病菌暴發(fā)源頭，因此很快在食品領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，為各類食源性致病菌的遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、致病機(jī)理的理解和微生物溯源提供支持。

談及高通量基因測序技術(shù)的發(fā)展歷程，從1990年正式啟動(dòng)“人類基因組計(jì)劃”直到2020年，這這30年的時(shí)間里，測序技術(shù)擁有17個(gè)里程碑式的成果，如2008年癌癥相關(guān)的基因測序揭示了基因突變與癌癥的相關(guān)性等；這30年也是測序技術(shù)飛速發(fā)展的時(shí)期，特別是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其已經(jīng)用于癌癥的預(yù)測與治療，并給無數(shù)患者帶來生的希望。

測序技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也帶動(dòng)了其在微生物領(lǐng)域的發(fā)展應(yīng)用。2008年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）啟動(dòng)了國家微生物全基因組計(jì)劃；2012年，F(xiàn)DA和美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）宣布啟動(dòng)“10萬基因組計(jì)劃”，即對約10萬種重要的食品來源的致病菌（包括沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌等重要致病菌）進(jìn)行測序，并將測序信息儲(chǔ)存在國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的公共數(shù)據(jù)庫；2014年，美國CDC啟動(dòng)了基于全基因組測序技術(shù)的高級(jí)生物學(xué)檢測項(xiàng)目，并宣布在2018年將全基因組測序技術(shù)用于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的分子分型，以便快速準(zhǔn)確地鎖定病因食品；2015年，歐盟食品安全局（EFSA）將全基因組測序技術(shù)用于食品中重要食源性致病菌的鑒定、分子分型、耐藥、血清分型等。

在我國，中科院微生物所于2018年?duì)款^組織發(fā)起了全球模式微生物基因組測序計(jì)劃—從全球微生物資源保藏中心選擇目前未進(jìn)行測序的模式微生物菌株（包括細(xì)菌、古細(xì)菌和可培養(yǎng)真菌），5年內(nèi)完成超過10 000種的細(xì)菌、真菌、古菌模式菌株基因組測序，建立全球微生物模式菌株基因組測序合作網(wǎng)絡(luò)；2013年，國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（CFSA）首次在國內(nèi)采用全基因組測序技術(shù)處理新西蘭恒天然嬰兒配方食品污染可疑肉毒梭菌的食品安全應(yīng)急事件；2015年，國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心啟動(dòng)了《國家食源性致病微生物全基因組測序數(shù)據(jù)庫》的構(gòu)建工作，致力于病因食品的快速準(zhǔn)確識(shí)別。

問：據(jù)了解，高通量測序技術(shù)在我國食品微生物領(lǐng)域的應(yīng)用還停留在科學(xué)研究和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建階段，尚未在食品微生物檢測實(shí)驗(yàn)室得到普及。那么，國家出臺(tái)了哪些政策與法規(guī)來助推和規(guī)范該技術(shù)的發(fā)展？

姜毓君：目前，我國關(guān)于高通量基因測序技術(shù)在微生物檢測領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)發(fā)布了系列標(biāo)準(zhǔn)，如《環(huán)境微生物宏基因組檢測 高通量測序法》（GB/T 40226-2021）、《高通量基因測序技術(shù)規(guī)程》（GB/T 30989-2014）及《用于病原微生物高通量檢測的核酸提取技術(shù)規(guī)范》（GB/T 40458-2021）。此外，我國也設(shè)定了全球首個(gè)針對基因測序儀的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—《高通量測序儀標(biāo)準(zhǔn)》（YY/T 1723-2020）。以上種種，均體現(xiàn)了我國在高通量基因測序領(lǐng)域的前瞻性和先進(jìn)性。

杜欣軍：《高通量基因測序技術(shù)規(guī)程》（GB/T 30989-2014）適用于對動(dòng)物組織、血液、糞便、口腔黏膜、毛發(fā)、植物組織、土壤、微生物等生物樣品進(jìn)行檢測。該標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了高通量基因測序相關(guān)的指標(biāo)要求及條件，如測序通量、堿基識(shí)別正確率、堿基識(shí)別質(zhì)量、主要儀器設(shè)備要求、測序設(shè)備推薦使用條件、實(shí)驗(yàn)室條件、試劑及溶液配制要求、測序過程等內(nèi)容。

目前，在流行病調(diào)查、病原溯源方面，國家市場監(jiān)督管理總局、疾控中心、衛(wèi)生健康委員會(huì)等職能部門已經(jīng)使用高通量測序技術(shù)對微生物進(jìn)行監(jiān)控。國家“十三五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃設(shè)立的一些項(xiàng)目就包括針對微生物高通量測序、數(shù)據(jù)庫建立、溯源平臺(tái)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行的研究，并已取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。相信，在這些項(xiàng)目的支撐下，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用將來會(huì)越來越成熟、越來越規(guī)范，也將在流行病控制、食品安全保障方面發(fā)揮更大的作用。此外，《2035年遠(yuǎn)景目標(biāo)綱要》提出，圍繞基因與生物技術(shù)，加快基因組學(xué)研究應(yīng)用，加快體外診斷研發(fā)；《“十四五”生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展規(guī)劃》也在推動(dòng)基因檢測、生物遺傳等先進(jìn)技術(shù)與疾病預(yù)防的深度融合。

問：為什么要對食品中的微生物進(jìn)行鑒定和溯源？在什么情況下需要進(jìn)行這一操作？

白莉：食源性疾病是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題，頻發(fā)的食源性疾病事件不僅危害人類健康，也會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在食品產(chǎn)業(yè)高度工業(yè)化的國家，一家公司生產(chǎn)的食品可快速銷往全國或全球，致使食源性疾病暴發(fā)呈現(xiàn)跨國界、跨區(qū)域、進(jìn)展快、難預(yù)測等特點(diǎn)，如2011年德國產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌O104:H4污染芽苗菜和2017年南非單核細(xì)胞增生李斯特菌污染肉制品引起的暴發(fā)事件等。如何從散發(fā)病例的復(fù)雜食物暴露中快速識(shí)別病因食品的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而確定暴發(fā)事件并迅速采取有效的處置措施是各國食源性監(jiān)測體系面臨的挑戰(zhàn)。

美國是最早建立食源性疾病暴發(fā)主動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)的國家，美國CDC逐步建立基于實(shí)驗(yàn)室的食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(luò)（PulseNet），其在食源性疾病的暴發(fā)識(shí)別、調(diào)查、溯源、預(yù)警及疾病負(fù)擔(dān)研究中得到成功應(yīng)用。歐盟也設(shè)有與美國相類似的監(jiān)測系統(tǒng)，其也在食源性暴發(fā)事件中發(fā)揮著快速識(shí)別及預(yù)警作用。近期全球多國報(bào)告單相鼠傷寒沙門菌污染巧克力產(chǎn)品事件就是最好的實(shí)例。2022年3月27日，英國衛(wèi)生安全局（UK Health Security Agency，UKHSA）向世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）通報(bào)了一組由來源不明的序列 型（Sequence Typing，ST）34型單相鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium4,[5],12:i:-）引發(fā)的聚集性病例，隨后歐洲多個(gè)國家陸續(xù)報(bào)告了相關(guān)病例。通過流行病暴發(fā)溯源調(diào)查，應(yīng)用全基因組測序技術(shù)確定了A公司在比利時(shí)工廠B生產(chǎn)的巧克力產(chǎn)品為病因食品。對涉事企業(yè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，是兩株單相鼠傷寒沙門菌導(dǎo)致此次暴發(fā)事件。

董慶利：由于食品風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜多變，故僅檢測某廠家或某批次食品中是否有特定微生物的效果微乎其微，只有通過溯源技術(shù)對所分離的微生物進(jìn)行特征分析，揭示其可能來源，識(shí)別可能的傳播途徑，進(jìn)而制定相應(yīng)的防控措施，才能有效管控污染來源。典型應(yīng)用場景如下。

第一，食品及環(huán)境中微生物多樣性及溯源研究。對生產(chǎn)過程中車間人員手部和設(shè)備表面進(jìn)行微生物污染調(diào)查。從樣本中分離菌株，得到各類微生物的相對豐度，即多樣性；若通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)同種微生物高度相關(guān)，則推測人員手部與設(shè)備表面存在交叉污染；若物料容器中多次分離出某菌，則提示容器是污染源之一。

第二，常見食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)分析。研究泡菜發(fā)酵操作與其中致病菌檢出間的關(guān)聯(lián)性，分析泡菜中致病菌存在的風(fēng)險(xiǎn)。如家庭泡菜易出現(xiàn)腸桿菌屬和假單胞菌屬，工業(yè)泡菜中李斯特菌屬出現(xiàn)機(jī)率較大，發(fā)酵時(shí)間與葡萄球菌屬和李斯特菌屬出現(xiàn)概率呈正相關(guān)。

問：目前，國內(nèi)外進(jìn)行食源性致病微生物鑒定與溯源的水平如何？

白莉：隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，基于全基因組測序的分子分型技術(shù)在食源性疾病聚集性病例識(shí)別和暴發(fā)溯源調(diào)查中已顯示出極大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿?，并逐漸成為國際研究熱點(diǎn)，歐美相關(guān)國家已相繼開展研究和布局。

在歐美等國，因全基因組測序技術(shù)具有更高的分辨率，已逐步取代傳統(tǒng)的分型方法，如PFGE、MLVA和MLST，并用于一系列高優(yōu)先級(jí)的食源性致病菌。比如，美國CDC于2013年開始使用該技術(shù)監(jiān)測單核細(xì)胞增生李斯特菌，到2019年全面取代PFGE成為識(shí)別和監(jiān)測的金標(biāo)準(zhǔn)，并用于非傷寒沙門菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、彎曲菌和產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC)的監(jiān)測。

目前，我國食源性疾病監(jiān)測報(bào)告系統(tǒng)中每年報(bào)告近萬起暴發(fā)事件，識(shí)別的事件多暴發(fā)在同一就餐地點(diǎn)（家庭、賓館）或集中供餐場所（學(xué)校），跨區(qū)域的暴發(fā)較少。雖然我國已建立基于流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室確證（PFGE/WGS）食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測體系，但在快速識(shí)別方面仍存在一定的不足。如何快速識(shí)別未知病因食品的關(guān)聯(lián)散發(fā)病例，并在短時(shí)間內(nèi)確認(rèn)為暴發(fā)事件，及時(shí)發(fā)布風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警來降低食源性疾病風(fēng)險(xiǎn)，是下一步工作中需要直面的挑戰(zhàn)性課題。美國食源性暴發(fā)識(shí)別系統(tǒng)從消費(fèi)者暴露病因食品、發(fā)病后就醫(yī)（第1～5天），到臨床樣本分離株在公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室完成全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）和其他檢測上傳至PulseNet（第16～22天），再到美國CDC基于數(shù)據(jù)庫中病例信息的比對識(shí)別確定關(guān)聯(lián)病例并確定是否為暴發(fā)事件（第23天），只需3～4周的時(shí)間。確定為暴發(fā)事件后，公共衛(wèi)生和監(jiān)管機(jī)構(gòu)將聯(lián)合啟動(dòng)暴發(fā)調(diào)查，收集流行病學(xué)和衛(wèi)生學(xué)調(diào)查、臨床和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)資料；當(dāng)明確食源性疾病暴發(fā)的病因食品后，政府會(huì)立刻向公眾發(fā)出警示并召回食品。借鑒美國CDC和ECDC應(yīng)對此類暴發(fā)的成熟體系和措施，基于我國現(xiàn)有食源性疾病暴發(fā)監(jiān)測體系，完善處置過程不同環(huán)節(jié)（疾控、監(jiān)督、哨點(diǎn)醫(yī)院）的職責(zé)和銜接，加強(qiáng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)和菌株信息共享，提高監(jiān)測數(shù)據(jù)分析及預(yù)警能力，從技術(shù)層面上提升此類事件應(yīng)急管控措施的時(shí)效性，有助于為政府食品安全管理部門的快速?zèng)Q策提供科學(xué)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)食品安全防控從被動(dòng)應(yīng)付向主動(dòng)防控的戰(zhàn)略轉(zhuǎn)變，進(jìn)而提高公共安全防控水平。

董慶利：進(jìn)入“十三五”以來，國內(nèi)對微生物全基因組測序技術(shù)已經(jīng)取得共識(shí)，但需要迅速將該技術(shù)普及并用于食源性致病菌鑒定、分型及溯源。傳統(tǒng)的食源性疾病暴發(fā)中，病原菌的確認(rèn)通常需要幾周或更長時(shí)間，全基因組測序技術(shù)可在幾天內(nèi)確定致病菌—及時(shí)控制并召回病因食品，并為有效診治患者提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。另外，宏基因組測序及宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)目前在國內(nèi)和國際社會(huì)呈快速發(fā)展勢頭。隨著微生物組學(xué)的發(fā)展和配套生物信息方法學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)，下一代測序也將成為食源性致病菌基因組數(shù)據(jù)平臺(tái)中不可或缺的一部分。希望在不久的將來，下一代測序技術(shù)能與更多新興方法相結(jié)合，使其不僅應(yīng)用于食源性致病菌的檢測識(shí)別及溯源，還能為推動(dòng)食品安全事業(yè)發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

問：您所在的單位是否會(huì)用到高通量測序技術(shù)？其主要用于哪方面的研究？在此過程中，該技術(shù)幫助貴單位取得了怎樣的成果？

白莉：國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心以國家食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(luò)（TraNet）為基礎(chǔ)，首次建成了基于全基因組測序分型技術(shù)的新型食源性疾病分子溯源網(wǎng)絡(luò)，這也是我國首個(gè)實(shí)現(xiàn)國家、省、市三級(jí)實(shí)際應(yīng)用的分子溯源網(wǎng)絡(luò)。該技術(shù)的推廣和使用不僅需要解決龐大基因組數(shù)據(jù)的傳輸、儲(chǔ)存、快速計(jì)算和精準(zhǔn)比對，還需要成熟易用的生物信息學(xué)分析流程和標(biāo)準(zhǔn)化解釋系統(tǒng)。針對上述問題，一方面研究團(tuán)隊(duì)搭建了我國首個(gè)全基因組數(shù)據(jù)計(jì)算云引擎，即將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)分析流程轉(zhuǎn)移到云端，此舉在很大程度上降低了數(shù)據(jù)分析、運(yùn)算及使用門檻。另一方面，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了基于阿里云OSS的全基因組測序三級(jí)架構(gòu)原始測序數(shù)據(jù)交付中心，實(shí)現(xiàn)了原始數(shù)據(jù)的實(shí)時(shí)快速上報(bào)及安全傳輸。在此基礎(chǔ)上，還建立了基于原始及拼接后數(shù)據(jù)的全基因組特征基因圖譜識(shí)別算法。通過以上兩種分析方式的相互校正，顯著提高了全基因組特征基因分析的準(zhǔn)確性，同時(shí)建立了分辨力高、重復(fù)性好的全基因組多位點(diǎn)序列分型（wgMLST）與核心基因組多位點(diǎn)序列分型（cgMLST）標(biāo)準(zhǔn)化方法，以及結(jié)合流行病學(xué)信息構(gòu)建了溯源分析知識(shí)庫，實(shí)現(xiàn)了不同實(shí)驗(yàn)室間測序數(shù)據(jù)的快速分析、比對與共享。

此外，研究團(tuán)隊(duì)還進(jìn)一步研究并整合了美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）、抗性基因數(shù)據(jù)庫（CARD）、耐藥基因數(shù)據(jù)庫（ResFinder）、致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫（VFDB）等公共數(shù)據(jù)庫中的特征基因數(shù)據(jù)，開發(fā)了常見食源性致病菌毒力因子、耐藥基因、血清分子分型等自動(dòng)化分析功能模塊，有助于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展食源性微生物遺傳與變異特征、致病和耐藥機(jī)制及菌株進(jìn)化等方面的基礎(chǔ)研究。目前，分子溯源網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)在泰國腸炎沙門氏菌暴發(fā)病例的跨省溯源、冷凍飲品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的跨省追蹤等事件調(diào)查中得到成功應(yīng)用。該網(wǎng)絡(luò)的建成和運(yùn)行，也將為我國食源性疾病暴發(fā)的快速調(diào)查和精準(zhǔn)溯源提供技術(shù)支撐。

杜欣軍：目前，我所參與的科研項(xiàng)目有很多會(huì)涉及高通量基因測序技術(shù)，主要是基因組和轉(zhuǎn)錄組測序方面。在此過程中，會(huì)運(yùn)用比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對各類食源性致病微生物的侵染、抗逆等相關(guān)功能基因進(jìn)行通量化分析。例如，最近承擔(dān)的國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“致病微生物功能基因深入分析與溯源技術(shù)研究”，就基于大量的致病微生物基因組測序結(jié)果，以傳統(tǒng)分型方法為參考，通過設(shè)置合理的閾值獲得不同致病菌的多態(tài)性標(biāo)識(shí)物，建立基于核心功能基因以及全基因組的微生物精準(zhǔn)溯源技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)食源性致病微生物的精準(zhǔn)溯源追蹤。該成果將為我國生物性食品安全危害因子的檢測與控制提供系統(tǒng)的理論指導(dǎo)與技術(shù)支持，進(jìn)而幫助提升食源性微生物管控水平、提高我國食品安全保障能力。

李慧：中糧營養(yǎng)健康研究院作為中糧集團(tuán)核心研發(fā)機(jī)構(gòu)，是國內(nèi)首家以企業(yè)為主體的、針對中國人的營養(yǎng)需求和代謝機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性研究以實(shí)現(xiàn)國人健康訴求的研發(fā)中心。針對食品微生物安全開展的研發(fā)技術(shù)支持和技術(shù)服務(wù)工作，中糧營養(yǎng)健康研究院食品安全研究團(tuán)隊(duì)會(huì)結(jié)合不同食品行業(yè)的特點(diǎn)，依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范》（GB 14881-2013）食品加工過程的微生物監(jiān)控程序指南，建議食品加工過程環(huán)境微生物監(jiān)控程序，開展環(huán)境微生物監(jiān)控工作。同時(shí)，也會(huì)根據(jù)不同食品加工企業(yè)的實(shí)際情況開展可培養(yǎng)微生物分離技術(shù)及鑒定工作，并結(jié)合高通量基因測序技術(shù)的測序深度大和準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢，采用高通量基因測序技術(shù)對生產(chǎn)環(huán)境中的微生物進(jìn)行溯源和分析，以便及時(shí)確認(rèn)污染微生物來源，達(dá)到徹底消除微生物污染源的目的。

曾靜：在海關(guān)檢測工作中，一些高端水產(chǎn)，如皇帝蟹、龍蝦、三文魚等，往往來自不同國家、不同海域。因此，進(jìn)境時(shí)的必檢項(xiàng)目有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等。但因弧菌屬的微生物在遺傳特性和生理生化表型上比較相近，甚至于在顯色平板上不具有明顯的特征，所以采用傳統(tǒng)方法完全準(zhǔn)確鑒定弧菌到種水平往往較為困難，這時(shí)全基因組測序就顯出它的優(yōu)勢。

我實(shí)驗(yàn)室分離了4株非典型弧菌，它們在硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）和科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顏色與溶藻弧菌相同，而VITEK和微生物質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）均鑒定為副溶血性弧菌。采用全基因組測序技術(shù)將4株菌進(jìn)行全基因組測序，利用平均核苷酸一致性分析方法確定弧菌的種，測序結(jié)果與魔鬼弧菌的平均核苷酸一致性值約為98%，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌的平均核苷酸一致性值分別為92%和84%，因此判定為魔鬼弧菌。如上，測序技術(shù)具有其他方法和技術(shù)不可比擬的分辨率和準(zhǔn)確性，傳統(tǒng)方法雖然是菌株鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是細(xì)菌的染色體較小，適應(yīng)環(huán)境過程中易產(chǎn)生變異，造成生化反應(yīng)不典型，難以鑒定到種水平。被傳統(tǒng)方法鑒定為副溶血性弧菌，通過基因測序，依據(jù)平均核苷酸一致性原則判定為魔鬼弧菌，而魔鬼弧菌并不屬于食源性致病微生物。同時(shí)，還得到了大量遺傳、耐藥性、致病基因信息。

問：以華大智造為代表的國產(chǎn)高通量基因測序儀器品牌經(jīng)歷多年的發(fā)展，已經(jīng)獲得了長足的進(jìn)步，您認(rèn)為其應(yīng)朝著什么方向繼續(xù)努力？

曾靜：華大智造作為我國高通量基因測序方面的龍頭企業(yè)，在測序技術(shù)上得到快速發(fā)展的事實(shí)是有目共睹的—研發(fā)出用戶體驗(yàn)良好的測序平臺(tái)，并參與國家的“人類基因組計(jì)劃”等，這些年華大智造展現(xiàn)的成績非常突出，也是我國許多科技企業(yè)學(xué)習(xí)的楷模。至于測序行業(yè)的未來努力方向，目前難以做到的是“標(biāo)準(zhǔn)化”，只有做到全方位的標(biāo)準(zhǔn)化，測序結(jié)果的準(zhǔn)確性才會(huì)更高。

對于儀器設(shè)備的需求，在入境口岸，針對入境人員攜帶病原檢測，這時(shí)需要傻瓜型的微量測序儀—易攜帶、界面友好、操作簡單、速度快，以及結(jié)果報(bào)告準(zhǔn)確；在海關(guān)檢測實(shí)驗(yàn)室，則需要具備強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫、對操作人員無需特殊培訓(xùn)、自動(dòng)建立基因文庫、自動(dòng)拼接、自動(dòng)結(jié)果分析，并給出準(zhǔn)確結(jié)果的測序儀。

姜毓君：高通量測序技術(shù)的特點(diǎn)之一是操作步驟多、程序復(fù)雜，既包括實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)本預(yù)處理、核酸提取及其片段化、建庫、擴(kuò)增、靶序列富集、混樣、測序前準(zhǔn)備及測序，也包括測序后的數(shù)據(jù)質(zhì)量分析、比對、變異分析、注釋和結(jié)果報(bào)告與解釋等生物信息學(xué)分析流程。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，都會(huì)影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致研究失去可靠價(jià)值。隨著研究人員對高通量基因測序技術(shù)的需求日漸提高，考慮到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與及時(shí)性，在未來發(fā)展中，通過檢測技術(shù)及儀器的提高，來減少測序步驟，提高應(yīng)用性，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化是關(guān)鍵要求。

未來，高通量測序技術(shù)將進(jìn)一步在以下方面為食品微生物研究提供重要支持。

第一，利用基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)與模擬，能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行系統(tǒng)水平的研究，并為微生物的調(diào)控提供重要線索。

第二，利用基因組技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組、代謝組等其他組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，能夠更加全面地研究食品微生物群落的代謝物、代謝能力、生態(tài)組成和動(dòng)態(tài)變化等信息。

第三，利用生物信息學(xué)工具和大數(shù)據(jù)的方法，建立預(yù)測模型，對食品微生物及其群落的特征及其變化進(jìn)行研究，也將成為一個(gè)重要的方向。

綜合幾位專家的觀點(diǎn)來看，高通量測序在食品微生物鑒定和溯源領(lǐng)域的確是一個(gè)極具前景的科學(xué)，其數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步分析包括基因預(yù)測和注釋、比較基因組學(xué)和進(jìn)化分析，為微生物特征提供更清晰的圖像，并做出更精確的結(jié)論，進(jìn)而為食品安全管理提供新的思路和方法。

未來，伴隨高通量基因測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其測序質(zhì)量更高、成本更低、速度更快，并將在食品領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，從而進(jìn)一步推進(jìn)食品領(lǐng)域各類相關(guān)研究、以及技術(shù)產(chǎn)品的發(fā)展和革新，為高品質(zhì)食品的研發(fā)、食品安全的保障做出更大的貢獻(xiàn)。