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      姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞TFPI-2基因去甲基化作用研究*

      2022-12-18 02:39:36梁瑩吳西雅肖祖克
      河南中醫(yī) 2022年12期
      關(guān)鍵詞:基轉(zhuǎn)移酶姜黃甲基化

      梁瑩,吳西雅,肖祖克

      江西省人民醫(yī)院,江西 南昌 330000

      肺癌系呼吸道惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率均處于第1位,現(xiàn)已成為全球主要健康問(wèn)題[1]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道顯示,肺癌每年新發(fā)病例超210萬(wàn),且死亡人數(shù)超180萬(wàn)[2],而1/3新發(fā)病例和2/5死亡病例均來(lái)自中國(guó),且近幾年來(lái)發(fā)病率有上升趨勢(shì)[3]。目前,肺癌治療以放化療手段為主,雖可較好改善患者生存質(zhì)量,但5年生存期仍較低。隨著基因組時(shí)代及分子生物學(xué)的發(fā)展,表觀遺傳學(xué)已成為癌癥研究的新熱點(diǎn),其調(diào)控機(jī)制包括DNA甲基化、非編碼RNA表達(dá)及組蛋白修飾等,其中DNA甲基化與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)[4]。經(jīng)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選肺癌基因發(fā)現(xiàn),組織因子途徑抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可導(dǎo)致TFPI-2表達(dá)下降,促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[5-6]。而啟動(dòng)子異常甲基化于腫瘤早期或癌前便已出現(xiàn),可較好預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生,具有較高特異性,基于此機(jī)制研發(fā)的靶向藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine,5-Aza-CdR)經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)上市且推薦用于骨髓異常增生類疾病治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),5-Aza-CdR在結(jié)腸癌[7]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]、胰腺癌[9]及肺癌[10]等實(shí)體瘤治療中亦可發(fā)揮作用,但同樣也發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR具有不良反應(yīng),可引起嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)及骨髓抑制等。研究表明,從莪術(shù)、姜黃等中草藥中提取出來(lái)的姜黃素可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移及抗炎等多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,且可調(diào)控DNA甲基化,但相關(guān)機(jī)制尚未闡明[11-13]?;诖?,本文以TFPI-2及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)、DNMT3a、DNMT3b等為切入點(diǎn)探討姜黃素對(duì)TFPI-2基因甲基化的作用。

      1 材料

      1.1 細(xì)胞人肺腺癌A549細(xì)胞株,由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供,貨號(hào):ZQ0003。

      1.2 藥物與試劑姜黃素(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):C1386-10G);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo fisher scientific公司,貨號(hào):11966025);MagicPure?Cell-Free DNA Kit II(含Magnetic Stand) DNA提取試劑盒、MagicPure?Simple Viral DNA/RNA Kit(含Magnetic Stand)RNA提取試劑盒、PerfectStart?Taq DNA Polymerase(含2.5 mM dNTPs)擴(kuò)增試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):EC211、EC311、AP401);引物合成委托美國(guó)Invitrogen公司完成。

      1.3 儀器Applied Biosystems Veriti型PCR儀(美國(guó)Thermo fisher scientific公司);Ts2型倒置相差顯微鏡(日本NIKON公司);MDF-382E(N)型-86 ℃超低溫冰箱(日本SANYO公司);3-18KS型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司,離心半徑:16 cm);Gel Dox XR型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司);SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

      2 方法

      2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)將含細(xì)胞的凍存管投入37 ℃水溫箱中迅速解凍,自主晃動(dòng)待其完全融化后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,混勻后1 000 r·min-1離心5 min,棄上清后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待80%~90%細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí),棄除舊培養(yǎng)液,采用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,并用0.25%胰酶消化后進(jìn)行觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)濃縮、圓潤(rùn)時(shí)添加 2 mL 培養(yǎng)基。將貼壁細(xì)胞作離心處理后,將1個(gè)培養(yǎng)瓶中的白色沉淀細(xì)胞均勻接種至3個(gè)新的培養(yǎng)瓶中并放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),取長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞分別設(shè)置為姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組及空白對(duì)照組??瞻讓?duì)照組細(xì)胞采用30 mL完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),姜黃素各劑量組分別采用30 mL含20 μmol·L-1、40 μmol·L-1及80 μmol·L-1的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),24 h后棄除培養(yǎng)液,用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞,收集處理后的A549細(xì)胞以待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

      2.2 MTT法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖情況將2.1項(xiàng)下處理后的A549細(xì)胞依次加入96孔板內(nèi),細(xì)胞密度為4×104mL,每孔接種200 μL,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,加入10 μL MTT試劑,培養(yǎng)4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)培養(yǎng)15 min,使用振蕩器震蕩10 min使其充分混勻,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處光密度(optical density,OD)值,計(jì)算細(xì)胞抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次,取平均值。

      細(xì)胞抑制率=(OD空白對(duì)照組-OD處理組)/OD空白對(duì)照組×100%

      2.3 RT-PCR檢測(cè)TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表達(dá)水平使用RNA提取試劑盒將2.1項(xiàng)下處理后的A549細(xì)胞總RNA提取出來(lái),以1 μg RNA為模板,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采取相應(yīng)引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)循環(huán)條件:95 ℃預(yù)變性5 min后,每周期:95 ℃變性30 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共計(jì)循環(huán)40周期。對(duì)特異性曲線進(jìn)行分析,以目的基因與內(nèi)參基因的OD值分析TFPI-2、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對(duì)表達(dá)情況,以2-△△Ct表示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次,取均值。引物序列見(jiàn)表1。

      表1 RT-PCR引物序列

      2.4 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法檢測(cè)TFPI-2基因甲基化狀態(tài)使用DNA提取試劑盒提取2.1項(xiàng)下處理后的A549細(xì)胞中的DNA,以2 μg DNA為模板,使用重亞硫酸鹽處理,按說(shuō)明書(shū)規(guī)范操作進(jìn)行DNA純化,而后進(jìn)行甲基化特異性擴(kuò)增。反應(yīng)體系:PCR buffer 2.0 μL,上、下游引物各0.2 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)1.6 μL,Taq酶0.1 μL,DNA模板2 μL,三蒸水 13.9 μL,共20 μL。反應(yīng)循環(huán)條件:95 ℃ 預(yù)變性 5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 45 s,共計(jì)35個(gè)循環(huán)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,采用溴化乙錠染色,并用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。以人類胎盤(pán)組織DNA經(jīng)甲基化酶SssI轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物作為甲基化的陽(yáng)性對(duì)照,健康人淋巴細(xì)胞DNA作為陰性對(duì)照,雙蒸水作為空白對(duì)照。引物序列見(jiàn)表2。

      表2 MSP引物序列

      3 結(jié)果

      3.1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖情況的影響隨姜黃素濃度升高、干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng),A549細(xì)胞OD值呈下降趨勢(shì),于濃度40 μmol·L-1且處理細(xì)胞48 h時(shí)OD值為最低,與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞抑制率結(jié)果顯示:各劑量姜黃素處理細(xì)胞12 h、24 h及48 h后均可抑制細(xì)胞增殖。見(jiàn)表3、圖1。

      表3 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖情況的影響

      圖1 各組A549細(xì)胞抑制率變化

      3.2 姜黃素對(duì)TFPI-2mRNA、DNMT1mRNA、DNMT3amRNA、DNMT3bmRNA相對(duì)表達(dá)情況的影響與空白對(duì)照組比較,姜黃素各劑量組TFPI-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平升高,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

      表4 姜黃素對(duì)TFPI-2 mRNA、DNMT1 mRNA、DNMT3a mRNA、DNMT3b mRNA相對(duì)表達(dá)情況的影響

      3.3 姜黃素對(duì)TFPI-2甲基化的影響空白對(duì)照組未顯示甲基化及去甲基化產(chǎn)物,陰性對(duì)照組僅顯示去甲基化產(chǎn)物,陽(yáng)性對(duì)照組僅顯示甲基化產(chǎn)物,姜黃素各劑量組除顯示甲基化產(chǎn)物外,亦可見(jiàn)去甲基化產(chǎn)物,尤以姜黃素中劑量組去甲基化產(chǎn)物條帶最為明顯。見(jiàn)圖2。

      注:m:甲基化產(chǎn)物;u:去甲基化產(chǎn)物;0:空白對(duì)照組;1:陰性對(duì)照組;2:陽(yáng)性對(duì)照組;3:姜黃素低劑量組;4:姜黃素中劑量組;5:姜黃素高劑量組

      4 討論

      TFPI-2已被證實(shí)為一類抑癌基因,可通過(guò)以下機(jī)制抑制腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[14]:①TFPI-2通過(guò)抑制MMPs在內(nèi)的蛋白酶活性阻斷ECM重塑,進(jìn)而維持ECM結(jié)構(gòu)完整性;②上調(diào)Fas-α、TNF-α表達(dá)使Caspase-3、Caspase-9凋亡通路活性增強(qiáng),進(jìn)而誘使細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效果;③拮抗組織因子阻斷血管生成。當(dāng)肺癌發(fā)生后,TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島(鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū))甲基化使TFPI-2基因表達(dá)下降或者缺失,進(jìn)而引起腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。姜黃素是從中藥姜黃、莪術(shù)等中藥中提取出來(lái)的一類酸性多酚類物質(zhì),具有廣泛藥理作用,譬如抗凝、降脂、抗炎、抗腫瘤等,且有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過(guò)抑制DNMT1甲基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致多種基因低甲基化[15]。He等[16]研究證實(shí),姜黃素可抑制非小細(xì)胞肺癌中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。此外,研究表明,5-Aza-CdR可通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共價(jià)結(jié)合使其活性受到抑制,進(jìn)而使TFPI-2基因異常甲基化得以逆轉(zhuǎn)[17]。基于此,本研究探討姜黃素是否可通過(guò)抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)抑制TFPI-2基因甲基化,進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度姜黃素處理后,A549細(xì)胞OD值均有所下降,可見(jiàn)姜黃素可對(duì)A549細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用,且與濃度、時(shí)間有一定依賴性,其中濃度40 μmol·L-1的姜黃素處理細(xì)胞48 h時(shí)抑制率最高,可見(jiàn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用與濃度不呈線性依賴,這與陳馨等[18]認(rèn)為姜黃素濃度在40~60 μmol·L-1時(shí)可發(fā)揮良好去甲基化效應(yīng)有一定類似。

      DNA甲基化主要由DNMT催化,目前已知的DNMT包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b,其中DNMT1可參與新合成單鏈DNA甲基化,并將甲基化信息傳遞給子代細(xì)胞,DNMT3a、DNMT3b則負(fù)責(zé)胚胎時(shí)期的DNA甲基化。已有研究證實(shí),DNMT在細(xì)胞周期G0/G1期表達(dá)異常,可沉默抑癌基因,使阻斷信號(hào)消除,促進(jìn)腫瘤發(fā)生、進(jìn)展。因此,尋找一種可抑制DNMT活性的藥物逆轉(zhuǎn)抑癌基因沉默,可能為治療肺癌的新興靶點(diǎn)。而姜黃素已被證實(shí)可激活NRF2、WIF-1、PTEN等抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)DNA去甲基化過(guò)程[19]?,F(xiàn)深入探討姜黃素對(duì)影響肺癌TFPI-2基因甲基化的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的作用,結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,不同劑量姜黃素組TFPI-2mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高,而DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA相對(duì)表達(dá)水平則下降,提示不同濃度姜黃素處理均可通過(guò)抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性(主要為DNMT1)促進(jìn)肺癌細(xì)胞TFPI-2基因表達(dá),逆轉(zhuǎn)TFPI-2基因的DNA甲基化,且從TFPI-2基因甲基化狀態(tài)亦可準(zhǔn)確反映姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞去甲基化作用。肖海勵(lì)等[20]研究認(rèn)為,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等具備活性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可參與DNA甲基化并維持過(guò)程,且在正常細(xì)胞中呈現(xiàn)共同表達(dá)的形式,進(jìn)一步佐證本研究的正確性。研究發(fā)現(xiàn),DNMT可升高癌細(xì)胞ROS水平引發(fā)線粒體和核DNA損傷發(fā)揮抗癌作用,且可通過(guò)P53-P21/GADD45A-cyclin/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)-Rb/E2F-DNMT1軸介導(dǎo)去甲基化作用。而姜黃素與DNMT巰基共價(jià)結(jié)合使得轉(zhuǎn)移位點(diǎn)減少,從而對(duì)甲基化轉(zhuǎn)移及修飾產(chǎn)生阻礙,進(jìn)而取得去甲基化作用[21-25]。Cao等[26]研究表明,賴氨酸特異性去甲基化酶2(histone lysine specific demethylase 2,LSD2)可通過(guò)調(diào)節(jié)TFPI-2表達(dá)促進(jìn)小細(xì)胞肺癌增殖。

      綜上所述,姜黃素可通過(guò)抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等甲基轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)抑制TFPI-2基因甲基化,進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖,且濃度為 40 μmol·L-1時(shí)抑制效果最佳。該研究為后續(xù)肺癌臨床治療方案制定提供參考,但尚有以下不足,即體外腫瘤狀態(tài)與體內(nèi)有所差異,因而姜黃素去甲基化作用還有待更多研究支持。且姜黃素生物利用度低,穩(wěn)定性差,機(jī)體代謝迅速等缺點(diǎn)可影響臨床應(yīng)用,應(yīng)著眼研究穩(wěn)定性更高的姜黃素系列衍生物的去甲基化作用,以使姜黃素成為肺癌治療的可靠靶向藥物。

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