綠藻柵藻對微囊藻的抑制效應及評價

宋嬋媛 白 芳 李天麗 宋立榮

(1.大連海洋大學, 大連 116023; 2.中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072)

水體富營養(yǎng)化導致的藍藻水華已成為全球性的問題。藍藻水華的發(fā)生嚴重惡化水體生態(tài)。微囊藻(Microcystis)是淡水生態(tài)系統(tǒng)中最常見的水華藍藻之一, 因其產生的微囊藻毒素而備受關注[1]。微囊藻藻毒素不僅對魚蝦貝類產生毒性效應, 而且通過食物鏈富集于體內, 進而威脅人類飲食健康[2]。因此, 控制水體中的藍藻水華具有重要意義。

生物控藻技術的機理是利用生態(tài)學原理, 與水華藻類競爭或通過生長抑制物質來抑制或殺滅藻類, 從而達到控藻的目的[3]。目前生物控藻方法主要包括利用水生動物的攝食作用、利用水生植物對營養(yǎng)鹽的競爭或化感作用和利用微生物中溶藻活性物質進行控藻[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn), 利用有益藻類與有害藻類的藻間關系, 來提高共生藻的優(yōu)勢和藻類多樣性, 從而改變水體藻類群落結構, 可以達到治理藍藻水華的目的[5]。在實踐應用中, 綠藻等有益藻類既可以作為水產動物的餌料, 也可以在養(yǎng)殖水體中發(fā)揮調節(jié)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的功能[6]。目前市場上硅藻(Diatoms)、小球藻(Chlorella)、卵囊藻(Oocystis)等藻種已被量產作為調水劑, 用于養(yǎng)殖池塘的水質改善和藍藻水華控制。

利用藻類之間的種間競爭進行生物控藻的研究主要是圍繞藻類之間的化感作用展開。Qiu等[7]發(fā)現(xiàn)四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)濾液中的物質對水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)具有抑制作用; Bittencourt等[8]研究表明單針藻(Monoraphidium convolutum)、尖胞柵藻(Scenedesmus acuminatus)的濾液中的提取物會抑制微囊藻生長; Briand等[9]研究了阿氏浮絲藻(Planktothrix agardhii)與銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)之間的化感作用, 表明浮絲藻對微囊藻在生長、形態(tài)和代謝上都有影響。此外已有研究發(fā)現(xiàn), 添加合適數(shù)量的波吉卵囊藻(Oocystis borgei)可能通過釋放某種化學物質有效抑制對蝦池塘中微囊藻的生長, 驅動對蝦池浮游植物群落的演替[10]。另外, 影響藻類種間競爭結果的因素除了化感作用, 還有溫度、營養(yǎng)鹽形態(tài)及濃度等, 浮游藻類生長速率、產毒特性等也會影響種間競爭的結果[7,11,12]。在養(yǎng)殖水體或其他污染嚴重的水體中, 氨氮通常含量較高[13], 因此氨氮耐受性是野外環(huán)境中利用藻類控制有害水華藍藻的重要特性。人工水體例如養(yǎng)殖池塘對溶氧的需求度較高[14], 在控制水華的同時需要考慮水體溶氧。分析已有的研究和應用現(xiàn)狀, 可以看出, 要篩選出對微囊藻等水華種類具有顯著抑制效果的藻種, 應擴大藻種的篩選數(shù)量, 多方面評估潛在優(yōu)勢藻種的生長生理特性和環(huán)境耐受性, 才有可能為實際應用奠定堅實的基礎。

因此, 本研究將藻類之間的化感作用作為切入點, 選擇7個不同屬(柵藻Scenedesmus、小球藻Chlorella、角星鼓藻Staurastrum、盤星藻Pediastrum、絲藻Ulothrix、單針藻Monoraphidium和雙星藻Zygnema)的綠藻和不同產毒特性的微囊藻作為研究對象。利用綠藻濾液培養(yǎng)篩選出對微囊藻有抑制作用的綠藻, 對其進行生長指標和部分生理指標的測定, 考察其抑制微囊藻的能力。并將其與微囊藻進行共培養(yǎng), 考察其在競爭中是否具有優(yōu)勢, 為利用藻類種間競爭防控藍藻水華提供理論與技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及藻種培養(yǎng)

本研究所用綠藻(表1)和微囊藻均來自國家水生生物種質資源庫—淡水藻種庫[15](湖北武漢)。其中, 兩株微囊藻FACHB-3550和FACHB-905的毒素含量分別為1876.66和4711.69 μg/g DW。所有藻株均使用BG11培養(yǎng)基, 在溫度(25±1)℃、光強35 μmol/(m2·s), 光暗比12h﹕12h條件下進行培養(yǎng)。

1.2 對微囊藻具抑制效應的綠藻篩選

為篩選出對微囊藻生長產生抑制效應的綠藻,對34株綠藻進行30d的培養(yǎng)(表1), 設置濾液處理組與對照組進行實驗。其中, 濾液為藻液經孔徑1.2 μm的GF/C濾膜(Whatman, 英國)抽濾后所得, 并進行營養(yǎng)鹽的補加, 以確保與對照組營養(yǎng)鹽水平一致,對照組為普通BG11培養(yǎng)基。實驗在24孔板(Corning, 美國)中進行, 體積為2 mL, 每個組設置4個平行。所有實驗組均分別接入處于對數(shù)期的微囊藻,初始接種密度為1×106cells/mL。所有組別設置4個平行, 培養(yǎng)條件同上。接種后每隔24h使用酶標儀(Molecular Devices, 美國)對微囊藻的OD680進行測定。比生長速率(μ)計算公式為μ=(lnW2–lnW1)/(t2–t1),W1表示t1時的OD680,W2表示t2時的OD680,t1和t2分別為0和96h。細胞的生長抑制率(Inhibition Rate,IR)通過如下公式計算:IR=(N0–Ns)/N0×100%。式中,N0和Ns分別為對照組和處理組的比生長速率。

表1 用于篩選對微囊藻生長具抑制效應的34株綠藻信息Tab.1 Information of 34 strains of green algae used to screen for inhibitory effects on the growth of M.aeruginosa

1.3 所篩選藻株抑藻物質的探究

為探究具抑制效應藻株FACHB-1229濾液中的作用物質, 將培養(yǎng)30d的藻株胞外濾液(約500 mL)進行富集, 使用HLB小柱(Waters, 美國)進行固相萃取, 使用前小柱用4 mL甲醇活化再用4 mL純水清洗。用25 mL二氯甲烷洗脫兩次后, 旋轉蒸發(fā)儀蒸干, 加入1 mL色譜級二氯甲烷復溶并離心獲取上清液, 然后通過氣相色譜質譜聯(lián)用儀(GC-MS)(Thermo scientific, 美國)進行分析。色譜條件: 使用TG-5SILMS型毛細管色譜柱(0.25 mm×30 m, 0.25 μm); 程序升溫方法為初始溫度50℃, 保持5min, 再以8℃/min升至290℃, 保持3min; 載氣氦氣(99.999%), 體積流量1 mL/min; 進樣量1 μL; 進樣溫度及檢測器溫度均為250℃; 不分流進樣。質譜條件: EI離子源70 eV;離子源溫度300℃; 傳輸線1、2、3溫度均為250℃;溶劑延遲時間3min; 全掃描采集模式, 質量范圍m/z50—650。以濾液不抑制微囊藻生長的藻株盤星藻FACHB-492作為對照, 分析兩株藻株中的差異物質, 對比文獻進行分析, 獲取可能具抑制作用的成分。

1.4 對所篩選藻株的評價

所篩選藻株的生長及部分生理特性的測定為探究所篩選藻株的生長特性, 對其生長速率進行測定。將對數(shù)期藻細胞轉移至24孔板(2 mL體系)中,接種初始密度OD680為0.2, 設置3個平行, 每3天使用酶標儀測定OD680。

為探究所篩選藻株野外應用潛力, 考慮到養(yǎng)殖水體中氨氮含量較高、對溶氧的需求較高, 本研究對藻株氨氮耐受性和光合放氧速率進行測定。首先, 依據(jù)BG11培養(yǎng)基NaNO3的N水平, 使用NH4Cl進行N源替代并設置不同濃度, 分別為0、94.43、188.86、472.15、944.30 和1888.60 mg/L。另通過補加NaCl以保持不同處理培養(yǎng)基的滲透壓相同。所有組別設置4平行, 計算96hμ值。對光合放氧速率的測定通過Clark氧電極(Hansatech, 英國)進行,方法參照文獻[16], 光合放氧速率[μmol O2/(mg Chl.a·h)]=實驗測得放氧速率/葉綠素含量。葉綠素含量使用80%丙酮進行抽提[17]。

所篩選藻株與微囊藻的共培養(yǎng)為進一步確定所篩選藻株的生物學特性是否可促進其在與微囊藻的競爭中占優(yōu), 本研究將前期篩選出的柵藻FACHB-1229分別與2株不同產毒特性的微囊藻進行24孔板共培養(yǎng)實驗。初始接種密度各為1×106cells/mL, 柵藻與微囊藻細胞數(shù)比例為1﹕1。以微囊藻和綠藻的單種培養(yǎng)作為對照, 初始接種密度均為2×106cells/mL。所有組別均設置4個平行, 依據(jù)藻細胞大小和自發(fā)熒光的差異, 利用流式細胞儀(Beckman, 美國)進行分群并計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標準誤。在比較處理組和對照組差異時, 采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為顯著性差異。使用GraphPad Prism 8(GraphPad Softwar, 美國)進行數(shù)據(jù)的分析和圖形的繪制。使用CytExpert(Beckman, 美國)對流式細胞儀數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果

2.1 對微囊藻具抑制效應的綠藻篩選

結果如圖1所示, 34株綠藻的濾液對微囊藻的生長效應不盡相同, 且整體無規(guī)律性。柵藻FACHB-1229、FACHB-1235、FACHB-1974和角星鼓藻FACHB-523、FACHB-1084、FACHB-1126的濾液可對兩株微囊藻的生長產生不同程度的抑制。其中, 柵藻FACHB-1229濾液對微囊藻FACHB-3550、FACHB-905的抑制作用最強, 抑制率分別為53.95%和48.39%。因此, 后續(xù)研究將主要圍繞柵藻FACHB-1229藻株進行。

圖1 34株綠藻濾液對微囊藻FACHB-3550 (a)和FACHB-905(b)的生長效應熱圖Fig.1 Heat map of the growth effect of 34 strains of green algae spent medium on M.aeruginosa FACHB-3550 (a)and FACHB-905 (b)

2.2 柵藻FACHB-1229濾液抑藻物質鑒定

通過GC-MS物質分析結果可得, 有抑制作用與無抑制作用的藻液濾液中差異物質共17種, 主要為酯類、烴類、胺類和醛類等物質(表2)。根據(jù)文獻[19]報道的對微囊藻具有抑制作用的物質推測, 鄰苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-methoxyethyl)ester)可能為柵藻FACHB-1229濾液中抑制微囊藻生長的物質。

表2 具抑制效應藻株FACHB-1229和無效應藻株FACHB-492濾液GC-MS分析結果差異物質及占比Tab.2 Relative content of compounds (%)analyzed using GC-MS in FACHB-1229 and FACHB-492

2.3 對柵藻FACHB-1229的評價

柵藻FACHB-1229生長及部分生理特性生長速率的結果表明, 柵藻FACHB-1229的μ值(0.38±0.06/d)大于微囊藻FACHB-3550和FACHB-905的μ值[均為(0.13±0.03)/d, 圖2]。

圖2 FACHB-1229和微囊藻FACHB-3550、FACHB-905的生長速率Fig.2 Growth rates of FACHB-1229, M.aeruginosa FACHB-3550 and FACHB-905 in 24-well microplates

對氨氮耐受性測定結果表明, 隨著氨氮濃度的逐漸上升, 三株柵藻的生長速率仍然較高, 而作為對照的微囊藻生長逐漸受抑制。在氨氮濃度為1888.60 mg/L(相當于BG11中N含量的兩倍)時, 三株柵藻的生長速率高于微囊藻, 此時柵藻FACHB-1229的生長速率最高, 可達(0.30±0.08)/d, 表明其對高濃度氨氮耐受能力較強。在光合放氧方面, 柵藻FACHB-1229的光合放氧速率也最高, 為(229.91±10.49)μmol O2/(mg Chl.a·h)(圖3), 大于同時測定的其他2株柵藻(FACHB-1606和FACHB-1602)和3株小球藻(FACHB-1552、FACHB-1554和FACHB-1580)。

圖3 6株綠藻光合放氧速率Fig.3 Photosynthetic oxygen evolution rate of 6 strains of green algae

孔板體系的柵藻FACHB-1229與微囊藻共培養(yǎng)共培養(yǎng)結果顯示, 當與低毒微囊藻FACHB-3550共培養(yǎng)第6天時, FACHB-1229所占比例從初始的33.52%上升至51.03%(圖4); 而當與高毒微囊藻FACHB-905共培養(yǎng)時, 柵藻所占比例浮動較小, 僅從共培養(yǎng)第0天的36.90%變化至第6天的31.80%(圖5)。

圖4 4株柵藻和2株微囊藻在不同氨氮濃度下的生長速率Fig.4 Growth rates of 4 strains of Scenedesmus sp.and 2 strains of M.aeruginosa in media with different ammonia nitrogen concentrations

圖5 柵藻FACHB-1229分別與低毒微囊藻FACHB-3550(a)和高毒微囊藻FACHB-905(b)共培養(yǎng)條件下細胞所占比例變化Fig.5 Percentage of cells in co-culture conditions of Scenedesmus sp.FACHB-1229 with M.aeruginosa FACHB-3550 (a)and M.aeruginosa FACHB-905 (b), respectively

3 討論

本研究以種間競爭的生態(tài)學原理為出發(fā)點, 利用綠藻濾液培養(yǎng)微囊藻, 篩選出對微囊藻具有抑制作用的柵藻FACHB-1229, 對其濾液中的抑藻物質進行測定。同時, 對該藻株的生長和氨氮耐受能力、光合放氧能力等生理指標進行評價, 進一步通過與微囊藻的共培養(yǎng)競爭實驗探究其與微囊藻的競爭能力。

3.1 具微囊藻抑制效應綠藻的篩選及抑藻物質探究

藍藻和綠藻的相互作用是極為復雜的。已有大量的文獻發(fā)現(xiàn), 微囊藻的濾液可顯著抑制其他綠藻(如四尾柵藻、蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa)的生長[20,21]。其中, 微囊藻毒素、其他多肽物質(如cyanopeptolins、cyanobactins)等被認為是微囊藻抑制其他藻類生長的主要化學物質[8,21]。同樣地, 也有研究報道, 一些綠藻的濾液可抑制微囊藻的生長,如Bittencourt-Oliveira等[8]報道了尖胞柵藻和單針藻的濾液可抑制微囊藻的生長, Qiu等[7]和Harel等[22]發(fā)現(xiàn)柵藻濾液可對微囊藻的生長產生抑制效應。本研究中也得到了類似的結果, 在所測試的34株綠藻中, 共計3株柵藻(FACHB-1229、FACHB-1235和FACHB-1974)和3株角星鼓藻(FACHB-523、FACHB-1084和FACHB-1126)的濾液可對微囊藻的生長產生不同程度的抑制(圖1)。文獻中提到, 對藻類具有抑制作用的化感物質包括酚類、含氮化合物、萜類物質及衍生物、有機酸、酯類等, 這些化感物質可通過影響藻類的光合作用[23]、產生氧化損傷[24]、誘導藻細胞的程序性死亡[25]、破壞微囊藻細胞結構[26]或影響其他生理生化作用從而對藻類產生抑制效應。前人對可對微囊藻產生抑制效應的綠藻濾液的化學成分分析發(fā)現(xiàn), 鄰苯二甲酸二丁酯、β-谷甾醇[19]和對叔丁基鄰苯二酚[7]等是產生抑藻效應的主要化學物質。本研究分析物質成分的結果中,酯類物質中鄰苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯與并聯(lián)藻(Quadrigula chodatii)中報道的鄰苯二甲酸二丁酯同屬于鄰苯二甲酸酯, 推測其可能為濾液中抑制微囊藻生長的物質, 該物質對微囊藻的抑制機理還需后續(xù)實驗進行探究。

3.2 所篩選藻株的競爭優(yōu)勢

在探究柵藻FACHB-1229的生長特性結果發(fā)現(xiàn), 該柵藻在孔板中的生長速率(0.38±0.06)/d高于微囊藻。在后續(xù)孔板體系的共培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn), 其可抑制微囊藻所占比例的升高, 微囊藻FACHB-3550比例從66.48%下降至48.97%, FACHB-905從36.90%變化為31.80%。類似的結果在前人研究中也有體現(xiàn), Ma等[21]研究發(fā)現(xiàn)生長速率較高的小球藻與無毒微囊藻共培養(yǎng)時小球藻能夠占據(jù)優(yōu)勢;Mariana等[27]指出擬柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)對共培養(yǎng)中的微囊藻生長產生抑制是由于化感物質的作用; 高生長速率的斜生柵藻在與微囊藻共培養(yǎng)時, 在化感作用影響下微囊藻受抑制而斜生柵藻生長占據(jù)優(yōu)勢[28]。結合前期對柵藻FACHB-1229化感物質的探究可以推測, 柵藻FACHB-1229的化感作用及較高生長速率的特性可促使其在競爭中占優(yōu)。對于影響共培養(yǎng)中藻株占據(jù)優(yōu)勢的條件, Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)條件中下, 并聯(lián)藻對微囊藻的化感作用影響了微囊藻對氮的利用進而影響了微囊藻的生長; 生長速率較高的擬柱孢藻可在與微囊藻的競爭中占據(jù)優(yōu)勢地位, 其主要依賴于對有機磷的特殊利用策略[11], 據(jù)此推測本研究所篩選藻株高生長速率的特性表明其對營養(yǎng)的運用不同, 這會促使其在競爭中占據(jù)優(yōu)勢地位。

3.3 所篩選藻株的生理特性

本研究對所篩選藻株和微囊藻競爭的不同營養(yǎng)形式及濃度的探究圍繞氨氮展開, Dai等[29]認為氨可能是決定淡水系統(tǒng)中常見藻類物種和藍藻水華分布的關鍵因素。已有研究報道, 與微囊藻相比,斜生柵藻對氨氮的耐受性更強, 并可促使其在氨氮濃度較高的自然水體中占據(jù)優(yōu)勢地位[30,31]。本實驗對氨氮耐受株的測定結果也發(fā)現(xiàn), 柵藻FACHB-1229對高濃度氨氮的耐受性最強, 而此時微囊藻生長完全被抑制。Cheng等[32]研究發(fā)現(xiàn), 蛋白核小球藻在氨氮含量較高(578.27 mg/L)的廢水中培養(yǎng)8d后對氨氮的去除率可達82.2%, 故對于本研究所篩選的柵藻FACHB-1229來說, 對微囊藻的化感作用及對高氨氮耐受的特性, 使其可以在抑藻的同時,還能降低養(yǎng)殖水體中氨氮含量。此外, 蘆尚德等[33]研究表明, 綠藻可通過固定化技術培養(yǎng)并應用于養(yǎng)殖水體中, 可作為生物供養(yǎng)劑解決生態(tài)養(yǎng)殖的缺氧問題。通過測定藻株的光合放氧速率計算可知, 在無損耗狀態(tài)下, 投加10 mg生物量(葉綠素a)的FACHB-1229藻液1h后可釋放73.57 g的氧氣。綜合此藻株濾液對微囊藻的抑制效應和較高的光合放氧能力, 未來可通過對培養(yǎng)投放技術的進一步優(yōu)化,促使柵藻FACHB-1229在野外應用中作為養(yǎng)殖池塘控藻增氧的潛在綠藻之選。

3.4 所篩選藻株的應用潛力

值得注意的是, 自然水體的微囊藻水華經人工控制(如化學法)后, 柵藻類綠藻常常是最先出現(xiàn)的藻類(結果未發(fā)表), 表明這些柵藻具有與微囊藻共存甚至競爭的潛力。因此, 除可以利用FACHB-1229對微囊藻的化感作用進行控藻之外, 還可以在使用物理或化學方法降低微囊藻生物量后, 利用FACHB-1229的高生長速率及耐氨氮特性在水體中快速生長, 使其在水體中占據(jù)優(yōu)勢, 壓制微囊藻的再次生長, 進而起到增加水體溶解氧、調整水體浮游植物結構和調節(jié)水質等作用。

4 結論

對藍藻和綠藻種間競爭的研究已有諸多報道,涵蓋營養(yǎng)鹽、溫度、他感物質等多個方面, 但多聚焦探討有害藍藻如何在競爭中獲優(yōu), 鮮少有將種間競爭應用于有害藍藻的控制的相關研究。如何利用藻間化感作用和綠藻的生理優(yōu)勢, 建立以有益綠藻為優(yōu)勢種的浮游植物群落, 最終形成生態(tài)平衡的水體, 我們認為需要從以下幾個方面進行: (1)探究可促使綠藻產生化感物質的最適營養(yǎng)條件和溫度;(2)對可抑制有害藍藻生長的綠藻濾液中的效應物質進行分離并鑒定, 以期實現(xiàn)工業(yè)化生產, 輔助加入以協(xié)助綠藻占據(jù)優(yōu)勢; (3)建立不同藻類的生長參數(shù)指標與種間競爭能力的關系指數(shù), 以便更科學地預測加入綠藻后浮游植物群落的結構變化。而本研究選取不同類型綠藻進行優(yōu)良藻株的篩選并進行初步的評價, 正是此工作的第一步, 實驗表明柵藻FACHB-1229可作為優(yōu)良藻株的備選。未來將對備選藻株產生的化感物質進行進一步的研究, 深入探討作用途徑和機理, 同時開展野外水體樣品的應用驗證以檢驗其應用潛力, 為利用種間競爭的生態(tài)學原理進行有害藍藻的控制技術提供理論基礎。