張曉雪，王 斌，劉麗麗，薛曉陽，劉永相，閆兆陽，石玉祥?

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院 056038；2.華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司 057150）

飼料中低劑量的抗生素添加可有效提高家禽的飼料轉(zhuǎn)化率、降低死淘率、促進家禽的生長，進而提高生產(chǎn)效率。然而，抗生素的濫用和過度使用也帶來嚴重的負面影響，如產(chǎn)生多重耐藥菌，對公共健康造成潛在的威脅。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告規(guī)定，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[1]。為了保證家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，尋找優(yōu)良的替抗產(chǎn)品已成為目前亟需解決的一項問題。

芽孢桿菌是一類呈桿狀、遍布于自然環(huán)境和動植物體內(nèi)的革蘭陽性菌。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌不僅在外界壓力下可以形成芽孢，而且也可以分泌多種功能性代謝產(chǎn)物[2,3]。芽孢桿菌通過核糖體途徑或非核糖體途徑合成的抗菌活性物質(zhì)抑菌效果好，不易產(chǎn)生耐藥性等特點，多種芽孢桿菌已被收錄于《飼料添加劑目錄》[4]。然而，目前市售的芽孢桿菌質(zhì)量參差不齊，部分芽孢桿菌分泌的毒素可導致腹瀉、嘔吐等癥狀，還有的芽孢桿菌自身攜帶耐藥基因，可能造成一定的傳播風險[5]。另外，芽孢桿菌一般來源于植物或者土壤，其在宿主體內(nèi)的定植特性和益生特性還有待于評估。

太行雞（河北柴雞）是河北省首個通過國家畜禽遺傳資源委員會鑒定的地方雞品種，其具有抗病力強、耐粗飼和蛋肉品質(zhì)鮮美等特點，越來越受市場青睞。在調(diào)研過程中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)戶散養(yǎng)的太行雞通過自由覓食和簡單飼喂等保持了良好的體型和壽命，雞只產(chǎn)蛋和蛋質(zhì)均良好，未發(fā)生疫病和意外死亡情況。研究表明，動物源性益生菌的分離和使用更易在動物體內(nèi)完成定植和發(fā)揮作用[6,7]。因此，本文旨在以太行雞為研究對象，篩選出優(yōu)良的雞源益生芽孢桿菌，為商品雞的健康養(yǎng)殖提供更為安全有效的飼用益生菌制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與實驗動物

21株芽孢桿菌分離于邯鄲地區(qū)農(nóng)戶散養(yǎng)太行雞的新鮮糞便（每只雞飼養(yǎng)均超過3年）。指示菌大腸桿菌ATCC 25922（Escherichia coli ATCC 25922）、腸炎沙門菌ATCC 13076（Salmonella enteritidis ATCC 13076）及金黃色葡萄球菌ATCC 29213（Staphylococcus aureus ATCC 29213）購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。60只1日齡海蘭灰公雛雞由華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司，2×含染料Taq預混PCR反應體系購自于北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司，膽鹽、芽孢染色液購自于北京索萊寶科技有限公司，蠟樣芽孢桿菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)及添加劑購自于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司，TSB、TSA、MHA培養(yǎng)基購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司。基礎(chǔ)日糧購自于河北聯(lián)心飼料有限公司。

1.2 芽孢桿菌的分離

稱取新鮮的太行雞糞便2g，置于含10mL PBS的試管中，充分震蕩混勻后80oC水浴20min。取糞便懸液100μL用涂布棒均勻涂布于蠟樣芽胞桿菌選擇培養(yǎng)基上，37oC培養(yǎng)48h。在選擇培養(yǎng)基平板上挑取不同大小和形狀的單菌落，經(jīng)純化得到單克隆，并將得到的單克隆依次編號。

1.3 芽孢桿菌染色

將分離的菌株接種于TSA平板上，37oC培養(yǎng)24h。在平板上刮取適量的菌落溶于500μL PBS溶液中，隨后按照芽孢染液試劑盒進行芽孢染色。即制成適當厚度的細菌涂片，經(jīng)火焰固定、染色后，使用光學顯微鏡觀察。

1.4 抑菌活性測定

采用雙層瓊脂平板法對已分離的芽孢桿菌進行抑菌活性測定。即取5μL過夜培養(yǎng)的芽孢桿菌培養(yǎng)液于TSA平板中，使之形成一個直徑約為0.5cm的接種點，37oC培養(yǎng)48h。將指示菌的菌懸液濃度調(diào)整至0.5個麥氏比濁度，按照100倍稀釋添加至高壓冷卻至50oC左右MHA瓊脂中，充分搖勻后緩慢地覆蓋到待測芽孢桿菌的TSA平板上，晾干后置于37oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察雙層瓊脂平板上抑菌圈的大小。

1.5 耐受性檢測

取適量的HCl配制pH為3.0和5.0的酸性TSB培養(yǎng)基，以檢測芽孢桿菌的耐酸性；取適量的豬膽鹽配制成濃度為0.3%和0.5%的TSB培養(yǎng)基，以檢測芽孢桿菌的膽汁耐藥性。將有抑菌活性的芽孢桿菌培養(yǎng)液按照1/100稀釋于上述培養(yǎng)基中，37oC恒溫孵育2h。分別取100μL孵育0h和2h的菌液進行10倍梯度稀釋，并均勻涂布于TSA平板上，37oC培養(yǎng)24h后進行計數(shù)。每組進行3個重復，通過統(tǒng)計處理前后芽孢桿菌的活菌數(shù)計算在不同pH和膽鹽濃度下的存活率。

1.6 16S rRNA基因測序

將上述分離的芽孢桿菌的單克隆接種于TSB培養(yǎng)基中，置于37oC恒溫搖床中過夜培養(yǎng)（200rpm），6000rpm離心2min收集菌體。參考天根生化科技（北京）有限公司的試劑盒說明書提取芽孢桿菌的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增，擴增引物為16S rRNA基因通用引物，引物序列為27F（5’-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTT GTTACGACTT-3’）。20μL的PCR反應體系為2×Taq PCR StarMix (Dye) 10μL，上游引物和下游引物（10μM）各0.4μL，DNA模板1μL，雙蒸水補足至20μL。PCR的反應條件設(shè)置為：95℃，5min（預變性）；95℃，30s（變性），55℃，30s（退火），72℃，90s（延伸），30個循環(huán)；72℃，7min（終延伸）。PCR產(chǎn)物委托北京博邁德基因技術(shù)有限公司進行測序，測序的結(jié)果拼接后在NCBI的BLAST上進行序列相似性比對，最后使用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.7 動物安全性評價

將1日齡健康的海蘭灰品系公雛雞分為對照組和芽孢桿菌實驗組，每組20只。飼養(yǎng)條件參考《海蘭飼養(yǎng)管理手冊》。將培養(yǎng)的芽孢桿菌菌液收集菌體后使用生理鹽水重懸2次，按照108CFU/g飼料分別給實驗組的雛雞進行飼喂。每天觀察實驗組和對照組雛雞的糞便情況和生長情況，雛雞飼喂至8日齡，稱重。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及可視化

采用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中兩組數(shù)據(jù)的顯著性差異進行Student’t-檢驗。利用GraphPad Prism 9.0對數(shù)據(jù)進行可視化處理，利用iTOL工具 (https://itol.embl.de/)進行發(fā)育樹可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

從14份邯鄲市農(nóng)戶散養(yǎng)的太行雞新鮮糞便中共分離到21株芽孢桿菌，分別編號為HUE2021101-HUE2021121。部分芽孢染色結(jié)果如圖1所示。染色后芽孢著綠色，細菌著紅色。

圖1 雞源芽孢桿菌染色

2.2 體外抑菌試驗

采用雙層瓊脂法對21株太行雞源芽孢桿菌的體外抑菌效果進行初步篩選，其中HUE2021105、HUE2021108、HUE2021119和HUE2021120四株芽孢桿菌對大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 29213和腸炎沙門菌ATCC 13076均存在不同程度的抑菌效果，其余芽孢桿菌幾乎無抑菌活性，部分芽孢桿菌的抗菌效果如圖2所示。

圖2 雙層瓊脂平板法驗證芽孢桿菌的抗菌活性

2.3 耐酸及耐膽鹽特性

上述四株芽孢桿菌在不同pH和膽鹽濃度條件下的生長情況如圖3所示，四株芽孢桿菌在不同pH和膽鹽存在的條件下存活率均高于40%，其中HUE2021105和HUE2021120在pH為3和0.5%膽鹽的條件下存活率超過60%，表明其具備較好的耐酸和耐膽鹽特性。

圖3 4株雞源芽孢桿菌在不同pH和不同膽鹽濃度下的存活情況

2.4 雞源芽孢桿菌的鑒定

將上述耐酸和膽鹽較好的雞源芽孢桿菌HUE2021105和HUE2021120進行基因組DNA提取、PCR擴增和測序后，得到的16S rRNA序列提交至NCBI進行BLAST比對，鑒定得到兩株枯草芽孢桿菌屬細菌，與已上傳的枯草芽孢桿菌16S rRNA基因相似度超過99%。從GenBank中選取其它芽孢桿菌的16S rRNA基因序列構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖4所示，HUE2021105和HUE2021120與Bacillus subtilis親緣關(guān)系最近，故將其分別命名為Bacillus subtilis HUE2021105和Bacillus subtilis HUE2021120。

圖4 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建雞源芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 雛雞使用安全性及生長狀況

自1日齡起，按照參考《海蘭飼養(yǎng)管理手冊》進行雛雞的正常飼喂，其中實驗組的雛雞日糧中分別添加108CFU/g的HUE2021105和HUE2021120。通過對比觀察實驗組和對照組雛雞的糞便形狀和生長狀況可知，HUE2021105和HUE2021120均未導致雛雞發(fā)生腹瀉和生長不良，其消化器官未發(fā)生損傷。如圖5所示，通過8日齡雛雞的體重增長情況發(fā)現(xiàn)HUE2021120飼喂的雛雞增長相比于對照組差異顯著（p =0.0019），同時組內(nèi)雛雞生長的均勻度更好，表明其具備一定的促生長能力。

圖5 雞源芽孢桿菌HUE2021120對雛雞生長的影響 (＊＊ p < 0.01)

3 討論

動物的腸道表面定植著豐富多樣的微生物群體，它們之間彼此聯(lián)系，又相互制約，共同維持了宿主的腸道穩(wěn)態(tài)[8,9]。組成穩(wěn)定的腸道菌群有益于宿主的發(fā)育、代謝、免疫調(diào)節(jié)及營養(yǎng)吸收[10-14]。然而，當腸道菌群發(fā)生異常變化時可能導致宿主出現(xiàn)疾病，比如動物早期的抗生素干預會嚴重影響宿主的健康，并可對其造成長期的不良影響[14-16]。

在家禽養(yǎng)殖過程中，抗生素的使用可以有效控制和預防家禽細菌感染性疾病，如沙門菌感染[17]。然而，無效或過量的抗生素使用可能產(chǎn)生嚴重的殘留、毒性，也導致了細菌耐藥基因的傳播[18]。益生菌作為一種動物活制劑的使用可為減少抗菌藥物的使用提供很好的思路。研究發(fā)現(xiàn)，宿主和腸道菌群之間有著緊密的相互選擇關(guān)系，而益生菌的同源性可顯著增強其益生功效[19]。基于此，本文通過篩選出優(yōu)良的雞源益生菌，以期獲得在規(guī)?；B(yǎng)殖過程中達到替抗保健的目的。芽孢桿菌具有良好的抗逆特性，通過分泌多種活性物質(zhì)來提高飼料利用率，發(fā)揮定植抗性，也可以調(diào)控宿主的腸道菌群，近年來受到青睞[3]。例如郝慶紅從雞的盲腸內(nèi)容物中篩選出枯草芽孢桿菌JM-11，能夠抑制致病性大腸桿菌導致的腹瀉和促進乳酸菌的生長[19]。肖瑀軒等從我國地方品種散養(yǎng)雞的盲腸中分離出暹羅芽孢桿菌CML548，通過體外試驗表明其具有抑制病原菌的特性[20]。本文通過采集散養(yǎng)太行雞的新鮮糞便，共分離出4株具有較好抑菌活性的芽孢桿菌，可顯著抑制大腸桿菌、腸炎沙門菌和金黃色葡萄球菌的生長。

動物胃腸道環(huán)境是影響益生菌生長和發(fā)揮作用的重要因素之一，口服益生菌需經(jīng)過胃到達腸道后才能發(fā)揮益生作用。雞胃的pH在3左右，雞小腸內(nèi)膽鹽的濃度在0.03%～0.3%范圍內(nèi)，本研究篩選的4株雞源芽孢桿菌均可在體外模擬的胃酸環(huán)境和膽鹽濃度存活。其中HUE2021105和HUE2021120的存活率較高。經(jīng)過體內(nèi)試驗后的實驗結(jié)果同樣證實了HUE2021120可以進入體內(nèi)發(fā)揮出較好的益生效果。

4 結(jié)論

本研究從邯鄲地區(qū)農(nóng)戶散養(yǎng)的太行雞糞便中分離獲得21株芽孢桿菌，經(jīng)過體外抑菌能力、耐酸耐膽鹽生物學特性及16S rRNA基因鑒定和動物使用安全性評價，獲得一株抑菌能力較好且具有促生長能力的枯草芽孢桿菌HUE2021120，該菌株具有優(yōu)良的益生特性，有望成為飼用益生菌制劑的候選菌株。