miR-21促進(jìn)肺癌進(jìn)展相關(guān)機(jī)制及潛在治療靶點

肖洪秋，亓偉峰，郝 鵬，李 曈，高 存，司立博，孫振國，田 輝

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院齊魯醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)南 250012）

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，目前其發(fā)病率和死亡率已經(jīng)躍居所有癌癥之首[1]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，近年來肺癌的診斷與治療手段不斷完善，但其生長迅速、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及快速耐藥的特點使得患者的總體預(yù)后仍較差，5 年生存率只有15%[2]。MiRNAs (microRNA) 是一類內(nèi)源性的長約19 ～24 個核苷酸的短鏈非編碼RNA，可通過多種方式參與基因表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等過程，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。肺癌組織中的MiRNA 具有穩(wěn)定的表達(dá)譜，其檢測方法也較mRNA 更加簡便，因此其作為新一代腫瘤分子生物標(biāo)志物和靶向治療位點已成為近年來廣泛研究的熱點之一[4]。miR-21 是由位于17p23. 2 染色體區(qū)域的MIR21 轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性非編碼RNA[5]。成熟的miR-21 約由22 個核苷酸分子組成，其可通過與各種靶基因mRNA 的3′非翻譯區(qū)形成不完全堿基配對參與RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的形成，導(dǎo)致特定的mRNA的翻譯減少，下調(diào)靶基因的表達(dá)[3,5]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21作為一種致癌的miRNA（oncomiR），在多種實體瘤中的表達(dá)顯著增加，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等[6-8]。miR-21 在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中可以通過改變各種靶分子（如3- 磷酸激酶、程序性蛋白死亡受體等）的表達(dá)來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移、凋亡，降低遺傳穩(wěn)定性[9]。作為在肺癌中表達(dá)量最高的miRNAs 之一，盡管其潛在調(diào)節(jié)機(jī)制在很大程度上尚不清楚，但大量研究已經(jīng)證實其表達(dá)水平在預(yù)測NSCLC 的診斷和預(yù)后方面具有重要的意義。本文現(xiàn)就miR-21 在NSCLC 發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miR-21 促進(jìn)肺癌的作用及機(jī)制

miR-21 可通過影響細(xì)胞周期蛋白質(zhì)D1 和E1 的合成和活化來調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程[10]，此外它還可以作用于PTEN，降低癌癥抑制因子PTEN的蛋白表達(dá)水平，通過PTEN/Caspase 3 抑制肺癌細(xì)胞的凋亡[11]。有研究指出，與普通PC-9 細(xì)胞相比，吉非替尼耐藥的PC-9 細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)明顯上調(diào)，而PTEN 明顯下調(diào)。臨床試驗證實，高miR-21、低PTEN表達(dá)水平往往預(yù)示著NSCLC 患者對于酪氨酸激酶抑制劑的臨床反應(yīng)較差，總體生存率較低[12]。在對細(xì)胞侵襲的作用方面，miR-21 可以抑制RECK 的表達(dá)，從而提高M(jìn)MP-2/MMP-9 的水平，促進(jìn)細(xì)胞侵襲[13]；還可以通過PTEN/Akt/GSK3β 級聯(lián)信號通路來調(diào)節(jié)E-cadherin、 vimentin、 snail、slug 、β-catenin 等侵襲標(biāo)記物的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。

有研究指出，miR-21 可直接作用于Tropomyosin 1(TPM1) 基因，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，miR-21 的過度表達(dá)會降低TPM1 的蛋白水平，介導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲[15]。在程序性細(xì)胞死亡4（PDCD4）基因的3'-UTR 中也存在潛在的miR-21 靶基因結(jié)合位點，miR-21 可降低人和小鼠細(xì)胞中Pdcd4 蛋白的水平。研究表明，通過上調(diào)PDCD4 的表達(dá)抑制miR-21 的表達(dá)可減少A549 NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。miR-21 還會參與EGFR 介導(dǎo)的信號通路，激活EGFR 信號通路可上調(diào)miR-21 的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞耐藥[17]。

2 miR-21 在NSCLC 診斷中的應(yīng)用

Yanaihara 等[18]率先利用基因芯片發(fā)現(xiàn)miR-21在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。后續(xù)的研究中，Tian等[19]通過qPCR 測定了204 對福爾馬林固定石蠟包埋NSCLC 組織樣本及其相應(yīng)的鄰近正常組織中miRNA-21 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與鄰近正常組織相比，NSCLC 組織中miR-21 的表達(dá)顯著增加。后來的多項研究均證實，相對于癌旁正常肺部組織，NSCLC 組織中miR-21 的表達(dá)異常增高，其表達(dá)水平與患者TNM分期以及轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況相關(guān)[20-21]。

由于采血操作侵入性小，血液樣本的獲取較為容易，血清中不同miRNA 的表達(dá)水平與各種腫瘤預(yù)后之間的關(guān)系已成為許多研究的焦點。最近的研究表明，它們是預(yù)測各類癌癥發(fā)生和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。有研究表明，肺癌患者血清中的miR-21 顯著高于健康人的水平，檢測血清中的miR-21 可作為肺癌早期非侵入性篩查的新策略[19,22]。Geng 等[23]發(fā)現(xiàn)，NSCLC 患者五種miRNA（miR-20a、miR-223、miR-21、miR-221和miR-145）的表達(dá)水平相對于健康志愿者明顯失調(diào)，隨后他們在126 例早期肺癌患者、42 例非腫瘤性肺部疾病患者和60 名健康志愿者的血漿樣本中檢測了這5 種miRNA 的表達(dá)情況，并分析了這種組合在NSCLC 早期診斷中的應(yīng)用價值。結(jié)果顯示，單獨使用這5 種miRNA 診 斷 早 期NSCLC 的AUC 分 別 為0.89、0.94、0.77、0.92 和0.77。進(jìn)一步的分析表明，血漿miR-20a、miR-223、miR-21 和miR-145 在吸煙者中比在非吸煙者中顯示出更好的診斷價值，而miR-155 可能更適合于非吸煙者人群。此外，它們在晚期患者和鱗癌亞組中的準(zhǔn)確性會更高，能夠?qū)SCLC 與非腫瘤性疾病以及健康人區(qū)分開來。Zhao 等[24]從60名健康人中收集血清作為對照，使用實時熒光定量PCR 檢測80 例NSCLC 患者血清中miR-21 的相對表達(dá)水平，繪制受試者操作曲線分析血清中miR-21 最合適的臨界值和診斷值。結(jié)果證實，NSCLC 患者血清miR-21 的水平明顯高于健康人（P＜0.05）。在臨界值設(shè)為1.22 的情況下，ROC 曲線下的面積為0.812（95% 可信區(qū)間：0.736，0.888），敏感度為73.8%，特異度為71.7%。根據(jù)該臨界值區(qū)分NSCLC 患者為高表達(dá)組還是低表達(dá)組，進(jìn)行Kaplan-Meier 分析表明，高miR-21 表達(dá)組的生存時間為23.1 個月，低miR-21 表達(dá)組的生存時間為34.3 個月，高miR-21表達(dá)組的生存時間顯著短于低miR-21 表達(dá)組。有研究表明，聯(lián)合檢測miR-21 和其他相關(guān)分子可以提高NSCLC 早期診斷的準(zhǔn)確性和特異性。Tang 等[25]從62 名NSCLC 患者和60 名健康的吸煙者的血清中分離并鑒定出了3 種異常表達(dá)的miRNA（miR-21、miR-145和miR-155），隨后在34 名惡性腫瘤患者、30 名良性肺結(jié)節(jié)患者和32 名健康吸煙者中測試并驗證這3種miRNA 的表達(dá)水平及聯(lián)合診斷效率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測miR-21、miR-145 和miR-155 的表達(dá)水平不僅可以區(qū)分肺癌患者和健康吸煙者（AUC：0.872，敏感度：76.5%，特異度：81.3%），對于肺癌患者與良性肺結(jié)節(jié)患者也有較好的分辨能力（AUC ：0.841，敏感度：76.5%，特異度：80.0%）。總之，這些研究表明，miR-21和其他分子的不同組合在NSCLC 中存在潛在診斷價值，血漿miR-21 的水平可能是NSCLC 患者早期診斷的重要補(bǔ)充。

痰液和肺泡灌洗液中miR-21 的表達(dá)水平也是NSCLC 的重要診斷依據(jù)。Kim 等[26]通過聯(lián)合檢測痰液中的5 種miRNA（miR-21、miR-143、miR-155、miR-210 和miR-372）發(fā)現(xiàn)，診斷早期NSCLC的敏感度和特異度分別高達(dá)67.8% 和90%。同時，這種miRNA 組合在肺泡灌洗液組的敏感度和特異度分別 高 達(dá)86.7% 和100%。Razzak 等[27]從21 例 早 期NSCLC 患者（Ⅰ期和Ⅱ期）、22 例晚期NSCLC 患者（Ⅲ期及以上）和10 例健康對照者中收集痰樣本，進(jìn)一 步 分 析miR-21、miR-210 和miR-372 在NSCLC早期診斷中的潛在應(yīng)用價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用這3 種miRNA 診斷早期NSCLC 的敏感度和特異度分別高達(dá)67% 和90%，對晚期NSCLC 的敏感度和特異度分別高達(dá)64% 和100%。因此，優(yōu)化痰樣本中特異性miRNA 的組合，以實現(xiàn)早期診斷NSCLC 將是未來研究的一個重點。

3 miR-21 的表達(dá)水平可以預(yù)測NSCLC 的預(yù)后情況

除了協(xié)助肺癌的診斷以外，miR-21 的表達(dá)情況還可以提示NSCLC 的預(yù)后情況。上文提到的Tian等[19]的研究不僅發(fā)現(xiàn)NSCLC 組織中miR-21 的表達(dá)顯著增加，還進(jìn)一步分析了miR-21 在晚期NSCLC（Ⅱb ～Ⅲa 期）組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于早期NSCLC（Ⅰa ～Ⅱa 期）組織中的表達(dá)。有研究指出，miR-21高表達(dá)的患者也有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，但是miR-21表達(dá)水平與腫瘤大小之間沒有相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析進(jìn)一步證實，與miR-21 低表達(dá)的NSCLC患者相比，miR-21 高表達(dá)的NSCLC 患者的總生存時間（OS）和無進(jìn)展生存時間（PFS）顯著減少。因此，miR-21 表達(dá)增高或許是NSCLC 患者OS 降低的一個新的獨立預(yù)后因素，癌組織內(nèi)miRNA-21 的表達(dá)水平可以預(yù)測NSCLC 的預(yù)后。此外，miR-21 的表達(dá)也可能是伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者的潛在預(yù)后標(biāo)志物。Stenvold 等[28]在NSCLC Ⅰ期至Ⅲa 期患者中收集了335 個腫瘤組織，并使用原位雜交法測定了腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中的miR-21 水平。出乎意料的是，研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞中miR-21 表達(dá)量的增高是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的積極預(yù)后指標(biāo)，而基底細(xì)胞中miR-21 的高表達(dá)是他們的不良預(yù)后指標(biāo)。這項研究的結(jié)果與其他研究的結(jié)果不一致，因此，需要進(jìn)一步的研究來闡明這種差異的原因。

鑒于在NSCLC 患者的預(yù)后中，血清miR-21 水平與癌組織中miR-21 水平的影響一致[29]，結(jié)合血清miR-21 的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)評估極有可能成為預(yù)測NSCLC 預(yù)后的一個重要方向。Wang 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-21 高表達(dá)的NSCLC 患者的3 年生存率明顯低于血清miR-21 低表達(dá)的NSCLC 患者，且NSCLC 患者血清miR-21 水平的升高與TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。基于NSCLC 患者OS 的多元邏輯回歸分析顯示，血清miR-21 水平是該疾病的獨立預(yù)后因素（HR ：2.01）。

近年來，越來越多的證據(jù)表明，癌細(xì)胞分泌的外泌體在各種腫瘤的診斷和預(yù)后判斷中具有潛在應(yīng)用價值[30]。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡，直徑為30 ～100nm，廣泛存在于體液中，其內(nèi)部可攜帶多種生物分子，包括蛋白質(zhì)、RNA、DNA 和脂質(zhì)等，對細(xì)胞通訊及細(xì)胞活動的調(diào)控起著重要作用[31]。Munagala等[32]最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miR-21 水平也可能是肺癌復(fù)發(fā)的標(biāo)志。他們建立了原發(fā)性和復(fù)發(fā)性肺癌的裸鼠模型，并分別檢測了腫瘤中和血清外泌體中miRNA 的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性腫瘤相比，復(fù)發(fā)性腫瘤中miR-21 和miR-155 兩種miRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，這些miRNA 在復(fù)發(fā)性腫瘤動物的血清外泌體中的表達(dá)也明顯增加。該研究表明，外泌體中的miRNA 信號可能提示肺癌的預(yù)后與復(fù)發(fā)，在作為肺癌的生物標(biāo)志物方面有著巨大潛力。

4 miR-21 在臨床治療中的應(yīng)用前景

基于miRNA 在基因表達(dá)調(diào)節(jié)以及與患者臨床預(yù)后相關(guān)性的證據(jù)越來越確鑿，上調(diào)或下調(diào)特定miRNA 的表達(dá)水平可能是治療癌癥的一個有希望的方法。一般情況下，靶向miRNA 的療法有兩種方法，一種是miRNA 替代療法，對于在腫瘤中表達(dá)下調(diào)的miRNA，可以使用與miRNA 結(jié)構(gòu)相似的mimics，模擬miRNA 的功能，恢復(fù)腫瘤抑制基因的功能；另一種是miRNA 拮抗劑，對于在腫瘤中表達(dá)上調(diào)的miRNA，利用反義技術(shù)合成的靶向性的反義寡核苷酸可以與它們結(jié)合形成互補(bǔ)的RNA，從而被RNA酶分解，可阻斷其功能，增加該種miRNA 靶向的mRNA的翻譯[33]。然而，到目前為止，這兩種方法在臨床上的應(yīng)用都非常有限，大多數(shù)相關(guān)研究都是在體外進(jìn)行的。由于miR-21 在肺癌中的表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用miR-21反義寡核苷酸治療肺癌已成為該病治療的新希望[34-35]。

5 總結(jié)

miRNA 在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，miR-21 已經(jīng)被證實可通過多種方式參與肺癌和其他惡性腫瘤的發(fā)生。miR-21 相關(guān)的診斷與預(yù)后信息對于臨床決策有著重要的作用，靶向miR-21 的治療可能會成為肺癌治療的新方向。筆者認(rèn)為，隨著未來對miRNA 研究的深入，miRNA 將會越來越多地應(yīng)用于相關(guān)疾病的診治中。