羅單

惡性黑色素瘤 (malignant melanoma,MM) 是一種起源于黑色素細胞或黑色素細胞源性細胞的皮膚腫瘤［1］。盡管惡性黑色素瘤僅占所有皮膚腫瘤的小部分,但由于其不良的預后和較高的死亡率(占所有皮膚癌死亡人數(shù)的65%),目前已經(jīng)成為全世界最具侵害性和最易致命的皮膚癌之一,同時也是全球人類健康不容忽視的危害。達拉非尼是一種已經(jīng)被批準使用于治療Ⅲ/Ⅳ期和轉移性惡性黑色素瘤的小分子靶向藥物,但是根據(jù)多項報道認為,惡性黑色素瘤患者在服藥以后會較快出現(xiàn)耐藥性,因此對于臨床效果來說是有一定限制的［2］。實際上,目前很多專家認為耐藥性已經(jīng)成為了治療惡性黑色素瘤的主要挑戰(zhàn)之一,因此要找到耐藥機制。當然,癌癥的耐藥機制是復雜多元化的,很多研究認為主要原因就是機體氧化應激反應、細胞自噬與凋亡,以及遺傳的不穩(wěn)定性所導致的［3,4］。本研究從自噬角度出發(fā),對黑色素瘤來源的外泌體miR-23a 在黑色素瘤達拉非尼耐藥中的機制進行分析和研究。

1 材料與方法

1.1 材料 購買的細胞為美國American Type Culture Collection 的惡性黑色素瘤細胞系A375；所用主要實驗試劑包含如下：美國Sigma-Aldrich 公司的達拉非尼,美國Cell Signaling Technology 生產(chǎn)的抗裂解PARP、抗LC3Ⅰ/Ⅱ和物種特異性二抗,美國LI-COR Biosciences公司生產(chǎn)的DMEM 培養(yǎng)基,美國Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)的胎牛血清和雙抗；所用主要儀器設備包含如下：美國Nikon 公司生產(chǎn)的PCM 2000 共聚焦顯微鏡,上海力申公司生產(chǎn)的臺式高速離心機,美國BioTek 公司生產(chǎn)的酶標儀,美國伯樂公司生產(chǎn)的蛋白電泳儀、SDS-PAGE 凝膠電泳儀,上海培清科技有限公司生產(chǎn)的化學發(fā)光儀。

1.2 方法

1.2.1 達拉非尼處理 選擇惡性黑色素瘤細胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達拉非尼對其進行24 h 處理。

1.2.2 模擬物轉染 將miR-23a 模擬物轉染到達拉非尼耐藥性最強的A375 細胞株上,使其呈現(xiàn)miR-23a過表達。將A375 細胞株在6 孔培養(yǎng)板中接種,每個孔中為對數(shù)生長期的細胞20 萬個,細胞生長融合到60%左右就進行轉染操作,取其中A 管加入miR-23a mimics(miR-23a 組),然后按照細胞培養(yǎng)條件進行培養(yǎng),取B 管加入15 μl 脂質體Lipofectamine2000,按照細胞培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。兩組均培養(yǎng)48 h 以后對細胞的上清液加以收集。

1.2.3 利用Western Blot 和qPCR 檢測處理前后A375 細胞中的LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達水平 qPCR 檢測miR-23a 表達,首先提取外周血單核血細胞中的總RNA,把組織樣本放在室溫環(huán)境下靜置5 min,然后放入A 組各管里面進行震蕩混勻,在室溫下孵育20 min。在培養(yǎng)板的細胞中,分別均勻滴入上述轉染混合液,并慢慢搖勻,在37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。然后根據(jù)TaKaRa 公司的反轉錄試劑盒操作說明書進行具體操作。

Western Blot 檢測LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達蛋白水平,嚴格按照操作說明書進行操作,并將印記膜接觸膠片,根據(jù)熒光強弱進行不同的曝光,12 h 后洗片,然后用圖像分析軟件進行灰度值的分析,以及參用內參灰度值對蛋白相對含量進行比較。

1.3 觀察指標 ①檢測和比較惡性黑色素瘤細胞內被用不同濃度的達拉非尼處理前后LC3Ⅰ/Ⅱ表達的水平。②檢測和比較耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達的水平。③分析miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t檢驗；相關性檢驗采用Pearson 線性相關分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 達拉非尼處理前后A375 細胞系中LC3Ⅰ/Ⅱ的表達 將A375 細胞系用不同濃度的達拉非尼(0、30、100、300 nM) 處理,收集細胞。經(jīng)Western Blot檢測LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達水平,并行qPCR 分析,發(fā)現(xiàn)LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達拉非尼濃度的升高而增加,說明達拉非尼以劑量依賴性方式顯著激活了自噬信號。見圖1。

圖1 LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達水平WB 圖

2.2 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平 轉染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的 表達水平均高于轉染前,差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。見表1。

表1 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平比較()

表1 耐藥惡性黑色素瘤細胞內被轉染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達水平比較()

注：與轉染前比較,aP＜0.05

2.3 miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性分析 Pearson 線性相關分析結果顯示,miR-23a 表達水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(P＜0.05),與ROS 無相關性(P＞0.05)。見表2。

表2 miR-23a 與耐藥相關通路上各個因子的相關性分析

3 討論

黑色素瘤是一種具有高侵襲性及死亡率的惡性腫瘤,早期診斷并通過手術切除可以達到較好的臨床預后,而發(fā)生轉移的黑色素瘤由于缺乏有效的治療手段,生存率極低。我國較多患者都受到疾病意識、經(jīng)濟和醫(yī)療因素的影響導致診斷的時候已經(jīng)有不同程度的轉移,所以對黑色素瘤的早期識別,以及對有效的晚期治療途徑的尋找就顯得比較重要［5］。目前達拉非尼已經(jīng)被認為是治療轉移性黑色素瘤的一線化療藥物,50%～60%接受達拉非尼治療的患者可以顯著延長無進展生存期和總生存期。盡管,達拉非尼擁有如此良好的療效,但對于藥物的耐受限制了患者的長期有效治療。外泌體是由多種類型細胞分泌的一種細胞外囊泡,通過其載體作用將內容物從分泌細胞轉移到受體細胞以實現(xiàn)細胞間的通信交流?；谄洫毺氐纳锾匦院凸δ?外泌體已被應用于黑色素瘤的診斷、治療和預后評價等方面［6］。達拉非尼是一種新型的治療黑色素瘤的有效藥物,可以通過阻止BRAF 基因突變縮小黑色素瘤。這類靶向藥物可以明顯延長BRAF 基因突變的黑色素瘤患者的生存時間,然而大部分患者會產(chǎn)生一定的達拉非尼耐藥,而導致腫瘤繼續(xù)生長。因此對外泌體調控黑色素瘤的發(fā)病機制與達拉非尼耐藥的研究更突顯其意義。miRNA-23a 是存在脊椎動物的基因組中的一種抑癌因子,可參與基因轉錄后表達調控,從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲,其表達量在乳腺癌、小細胞性肺癌、肝細胞癌、膠質瘤等多種惡性腫瘤的診斷及預后評估中具有重要的參考價值。已報道m(xù)iRNA-23a 在黑色素瘤中的轉移和復發(fā)中存在異常,而且已被證實可以通過外泌體分泌至腫瘤環(huán)境中,但其調節(jié)黑色素瘤進展的具體機制相關研究很少。

黑色素瘤耐藥研究中,細胞凋亡和自噬研究歷來是焦點和重點,其中細胞自噬可以降解細胞漿內的許多物質,比如細胞質、蛋白和一些大分子物質,將其傳遞到溶酶體,然后進行降解。

整個清除過程主要是為了細胞穩(wěn)態(tài)得到保持,并使得細胞的氧化應激損傷得到保護,提高細胞的自噬活性關系到多種癌癥細胞的存活情況［7］。迄今為止,已經(jīng)能夠支持靶向療法耐藥中,自噬占據(jù)重要地位的證據(jù)有很多［8］。凋亡作為程序性細胞死亡形式之一可以有序、有效的清除受損細胞,而癌癥的發(fā)生大部分與細胞凋亡機制失去平衡有著明顯的關系,凋亡不僅僅是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的標志性事件,而且還與腫瘤對藥物的抵抗有著很大的關系［9］。LC3 合成前體LC3(pro-LC3),然后其末端被水解切割后失去多肽使得甘氨酸發(fā)生暴露,成為了LC3-Ⅰ。在細胞自噬的過程中,LC3-Ⅰ扮演著重要角色,其在ATG7、ATG12-ATG5-ATG16L 作用下結合磷脂酰乙醇胺組成了LC3-Ⅱ,其因為被修飾因此電荷發(fā)生變化而形成更快的遷移率。本研究選擇惡性黑色素瘤細胞系A375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達拉非尼對其進行24 h 處理,結果發(fā)現(xiàn)LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達拉非尼濃度的升高而增加；然后再用miR-23a 模擬物轉染對300 nM 的A375 細胞進行轉染,利用Western Blot 和qPCR 檢測轉染前后A375 細胞中的miR-23、LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達水平。發(fā)現(xiàn)轉染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的表達水平均高于轉染前,差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。Pearson 線性相關分析結果顯示,miR-23a 表達水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(P＜0.05),與ROS 無相關性(P＞0.05)。在細胞凋亡通路中,細胞內的Ca2+濃度升高后,氧化損傷會引起羥自由基等ROS、毒素、一氧化氮(NO)、生長因素和激素刺激等［3］發(fā)生異常改變,并會對caspase-8發(fā)生激活后引起caspase 級聯(lián)反應,從而細胞凋亡開始,因此本研究結果提示了miR-23a 表達水平與caspase通路相關,從而繼發(fā)了細胞凋亡通路,也可能是通過這一路徑,因為導致了黑色素瘤達拉非尼的耐藥發(fā)生。

綜上所述,達拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細胞A375,相比于處理前,其LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達顯著上調；達拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細胞中的miR-23a 表達水平上調后,能夠促使耐藥細胞發(fā)生自噬而導致凋亡加速,這可能就是miR-23a 在黑色素瘤達拉非尼耐藥中發(fā)生影響的可能機制。