劉璐 匡榮 虞佳濤 李墨池 張勁松

糖尿病是全球性的慢性疾病,患者由于缺乏胰島素分泌減少或者產(chǎn)生耐受,導致血糖代謝紊亂,形成高血糖癥。目前,治療糖尿病主要方式是口服降糖藥和注射胰島素,而對于胰島素起效作用而言,分為長效、中效、短效和速效胰島素,市場上主要的胰島素產(chǎn)品有德谷胰島素、門冬胰島素,門冬胰島素是用生物技術將人胰島素氨基酸鏈B28 位的脯氨酸由天門冬氨酸替代而成的,具有降血糖作用,注射后15 min 起效,作用可持續(xù) 3～5 h。門冬胰島素的降血糖作用是通過其分子與肌肉和脂肪細胞上的胰島素受體結(jié)合后,促進細胞對葡萄糖吸收利用,同時抑制肝臟葡萄糖的輸出來實現(xiàn)的。臨床數(shù)據(jù)表明,通過安全性藥理學、重復給藥毒性、遺傳毒性和生殖毒性的常規(guī)試驗發(fā)現(xiàn),門冬胰島素對人體沒有特殊危險。在體外試驗中,包括與胰島素和胰島素樣生長因子-1 受體的結(jié)合,以及對細胞生長的影響,門冬胰島素的表現(xiàn)與人胰島素非常相似［1-6］。因此,門冬胰島素的有效性研究成為產(chǎn)品質(zhì)量控制的關鍵,主要體現(xiàn)在其生物活性/效價的控制,也有通過液相、超高液相方法測定門冬胰島素的含量方法,兩者結(jié)合精確度更高,本研究根據(jù)中國藥典對門冬胰島素測定方法進行規(guī)范的驗證,用門冬胰島素標準品,以小鼠為載體,建立門冬胰島素生物活性測定方法［7-10］,確保測定方法的可行性,為產(chǎn)品優(yōu)化提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物 120 只雌性ICR 小鼠,無特定病原體(SPF)級,體重20～26 g,購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司,動物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2017-0012,動物實驗室：浙江省食品藥品檢驗研究院,動物使用許可證：SYXK(浙)2021-0016,所有動物的使用均經(jīng)過實驗動物使用和管理委員會(IACUC)批準,IACUC 編號為2021-010。飼料為Co60 輻照實驗鼠維持飼料,購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司,生產(chǎn)許可證號：蘇飼證(2019)01008。動物飼養(yǎng)期間,自由攝食和飲水。

1.2 藥物與試劑 門冬胰島素標準品(中國食品藥品檢定研究院,批號：410011-201902,效價：27.4 U/mg)。氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司,批號：20200915),苯酚(國藥集團化學試劑有限公司,批號：20200508),三氯乙酸(南京化學試劑股份有限公司,批號：181017238C),鹽酸(杭州天動力化學品有限公司,批號：20201104),葡萄糖測定試劑盒 (德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司,批號：29204)。

1.3 主要儀器 日立7180 型自動生化分析儀(日本日立公司),ME2002E 型電子天平(METLER TOLEDO),XPR305 型天平(METLER TOLEDO),TD1200 型電子天平(寧波金諾天平儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 供試液的制備 實驗當天取一定量的門冬胰島素標準品,用pH=2.5(含苯酚)的生理鹽水配成20 U/ml的母液,取母液用pH=2.5 的生理鹽水分別配制成0.08 U/ml、0.04 U/ml,0.1 U/ml、0.05 U/ml,0.125 U/ml、0.0625 U/ml 門冬胰島素溶液,相當于80%,100%,125%效價水平高低濃度的待測溶液,標準品溶液濃度高低劑量濃度為0.1 U/ml、0.05 U/ml。

2.2 動物分組及給藥 120 只小鼠,隨機分成A1 組、B1 組、C1 組、D1 組、A2 組、B2 組、C2 組、D2 組、A3 組、B3 組、C3 組、D3 組,每組10 只。四組為一批,分別用門冬胰島素標準品進行80%、100%、125%效價水平測定。組間平均體重差＜3 g,逐只編號,按ds1、ds2、dT1、dT2 順序分別自皮下注入標準品或供試品稀釋液,0.2 ml/鼠,每只間隔1 min,注射后40 min 按給藥順序分別自眼靜脈叢采血,采血后取0.06 ml 加至含0.36 ml 三氯乙酸的EP 管中,以2500 r/min 速率離心15 min,取上清液,用生化分析儀測定血糖值。按雙交叉設計,第2 次給樣按dT2、dT1、ds2、ds1 順序進行,并測定給樣后40 min 的血糖值。2 次間隔給藥時間4 h,照生物檢定統(tǒng)計法(通則1431)中量反應平行線測定雙交叉設計法計算效價及實驗誤差。按上述方法重復實驗2 次,給藥方案見表1。依據(jù)中國藥典2020 版通則9401 生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則,對實驗相對準確度、中間精密度、線性和范圍進行評估。

表1 門冬胰島素給樣方案

2.3 樣品測定 根據(jù)建立的實驗方法,分別測定3 批門冬胰島素標準品及3 批門冬胰島素供試品稀釋液生物效價。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)錄入BS2000生物檢定軟件中統(tǒng)計,依據(jù)中國藥典2020 版(通則1431)中量反應平行線測定雙交叉設計法,BS2000 中分別計算80%、100%、125%效價水平試驗所測得的待測溶液生物活性和試驗誤差。80%、125%效價水平試驗可靠性測驗結(jié)果判定要求為：回歸F檢驗顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗不顯著(P＞0.05)；100%效價水平試驗可靠性測驗結(jié)果判定要求為：回歸F檢驗顯著(P＜0.05)；偏離平行、試品間F檢驗不顯著(P＞0.05)?？尚畔蘼?FL)≤25%。相對準確度：相對偏差：(RB)=(效價測定值/效價理論值-1)×100%。中間精密度：幾何標準偏差(GSD)=antilog (SD),式中,SD 為每個效價水平效價測定值的對數(shù)標準偏差。GCV=(GSD-1)×100%。線性：以效價理論值的對數(shù)(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(shù)(縱坐標)作圖,采用最小二乘法進行線性回歸。并列出直線回歸方程、及相關系數(shù)。范圍：相對準確度、中間精密度和線性均符合要求的效價水平范圍滿足生物活性檢定質(zhì)量標準的要求。

3 實驗結(jié)果

3.1 不同效價水平測試結(jié)果 80%、125% 效價水平試驗可靠性測驗回歸F檢驗顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗不顯著(P＞0.05)；100%效價水平試驗可靠性測驗回歸F檢驗顯著(P＜0.05)；偏離平行、試品間F檢驗不顯著(P＞0.05)?？尚畔蘼剩?5%。見表2。

表2 不同效價水平測試結(jié)果(%)

3.2 相對準確度驗證結(jié)果 不同效價水平測定值的相對偏差均在±20%范圍內(nèi)。見表3。

表3 不同效價水平相對準確度測試結(jié)果

3.3 中間精密度驗證結(jié)果 80%、100%、125%效價水平測定值的GCV 均＜20%。見表4。

表4 不同效價水平中間精密度驗證結(jié)果

3.4 線性驗證結(jié)果 以效價理論值的對數(shù)(橫坐標)對其相應的效價測定值的對數(shù)(縱坐標)做圖如下。采用最小二乘法進行線性回歸,擬合的直線回歸方程為Y=1.012X+0.0169,相關系數(shù)為0.9940。見圖1。

圖1 線性曲線

3.5 范圍 實驗中相對準確度、中間精密度和線性均符合要求,效價水平范圍為理論值的80%～125%,即21.92～34.20 U/mg,滿足生物活性檢定質(zhì)量標準的要求。

3.6 6 批樣品生物效價測定結(jié)果 取6 批樣品(批號：20210524、202006009、202006010、202104001、202104002、202104003)分別同法測定,各批樣品的測定結(jié)果見表5。實驗結(jié)果表明6 批樣品的可靠性測驗回歸F檢驗顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗不顯著(P＞0.05),試品間F檢驗不顯著(P＞0.05),可信限率均＜25%,均符合要求。見表5。

表5 6 批樣品生物效價測定結(jié)果

4 討論

選用ICR 小鼠進行實驗,用門冬胰島素標準品配制成80%、100%、125%的效價水平測定活性,研究發(fā)現(xiàn),動物狀態(tài)對實驗結(jié)果較大,組內(nèi)選擇動物體重控制在2 g 范圍內(nèi)實驗成功率高,本研究選用全自動生化分析儀進行血糖測定,相對于血糖儀比較,測定過程較為復雜,實驗結(jié)果不確定性高,但準確度高,本試驗室統(tǒng)計本實驗成功率約為60%,關注實驗過程中給樣是否存在漏液,嚴格控制給樣時間和取血時間,保障實驗成功率。

本實驗采用小鼠血糖法測定門冬胰島素生物活性,對其相對準確度、中間精密度、線性和范圍進行考察,結(jié)果表明建立的方法符合指導原則和生物活性檢定質(zhì)量標準的要求,可作為門冬胰島素活性測定方法,表明建立的方法是可靠的。