全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定大米中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素

◎ 張樹權(quán)，周瑞錚，易華娟，林秋鳳，鄭耀林

（東莞市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 東莞 523808）

香精所具有的濃郁香氣可以起增香、定香的作用，其中香蘭素及其衍生物的應(yīng)用十分廣泛，是使用最多的食品增香劑之一。乙基香蘭素等香精通過人工合成的方式得到，而香蘭素則存在于眾多自然植物中，被提取出來后通過人工合成的方式進(jìn)行大量生產(chǎn)，并廣泛用于食品加工中。然而有關(guān)研究表明，過量食用香蘭素等有出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐、呼吸困難以及損傷肝腎等風(fēng)險(xiǎn)[1]，而香豆素更被列入第三類致癌物清單中[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[3]中明確規(guī)定大米中不得使用天然香精或合成香精，但為了提高大米的銷售利潤(rùn)，常有不法商家在大米中添加香蘭素等增香劑冒充優(yōu)質(zhì)大米。大米除了作為主食，還是重要的食品加工原料，大米的質(zhì)量控制對(duì)人們的生命健康安全的重要性不言而喻。然而目前尚未頒布檢測(cè)大米中香蘭素等香精的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測(cè)定》（BJS 201705）[4]操作過于簡(jiǎn)單，不能有效除去大米中的雜質(zhì)，尤其是可溶性脂類容易污染離子源，不利于儀器的維護(hù)使用。目前，針對(duì)香蘭素等香精的研究主要考察的是奶粉[5-10]、飲料[11-15]、乳制品[16-17]和植物油[18-19]等基質(zhì)，本文采用全自動(dòng)固相萃取儀結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)大米中香蘭素等常見4 種香料進(jìn)行檢測(cè)，能夠提高大批量檢驗(yàn)的工作效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試樣來源：所用15 批試樣均為東莞市各大米廠家送檢的大米。

標(biāo)準(zhǔn)品：香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素，純度均不小于99%，批號(hào)分別為D0016913、D0019465、D0016050、F0031598，北京BePure 公司。

甲醇：色譜純，德國默克公司；甲酸：分析純，德國默克公司；固相萃取小柱：Oais HLB，60 mg/3 mL，美國沃特世公司；微孔濾膜：PTFE，孔徑0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRIPLE QUAD 5500+超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX 公司；FotectorPlus 全自動(dòng)固相萃取儀，中國睿科集團(tuán)股份有限公司；CPA225D、BSA223S電子分析天平，德國賽多利斯公司；3K 15 離心機(jī)（9 500 r·min-1），德國Sigma 公司；Milli-QReference超純水機(jī)，德國默克公司；BC-1000 渦旋振蕩儀，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；CPX880H-C 超聲波清洗機(jī)，美國Branson 公司；Evatros 自動(dòng)氮吹儀，韓國Goojung 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別置于10 mL 容量瓶中，用0.1%甲酸甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別準(zhǔn)確吸取適量上述單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用70%甲醇水溶液稀釋至濃度均為10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

用70%甲醇水溶液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，臨用時(shí)配制。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Atlantis T3（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇；進(jìn)樣體積：1.0 μL；流速：0.3 mL·min-1；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫梯度：0～0.5 min，25%B；0.5～2.0 min，25%～50%B；2～4 min，50%B；4.0～4.1 min，50%～90%B；4.1～6.5 min，90%B；6.5～6.6 min，90%～25%B；6.6～10 min，25%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（H-ESI+，正離子模式）；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；霧化氣：50 psi（氮?dú)猓惠o助氣：50 psi（氮?dú)猓?；氣簾氣?0 psi（氮?dú)猓?；噴霧電壓：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；碰撞氣：8 psi（氮?dú)猓ｋx子對(duì)優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 離子對(duì)優(yōu)化結(jié)果表

1.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至0.01 g）試樣，加入10 mL甲醇，渦旋振蕩5 min，超聲提取10 min 后，8 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移全部上清液至玻璃試管，加入一級(jí)水將上清液稀釋至40 mL，待凈化。用全自動(dòng)固相萃取儀將全部稀釋液經(jīng)過活化的HLB 固相萃取柱，再用3 mL 35%甲醇水溶液淋洗，抽干小柱，用3 mL 甲醇洗脫，用刻度試管收集洗脫液并于40 ℃氮吹濃縮至接近0.1 mL，準(zhǔn)確加入70%甲醇水溶液至1 mL 刻度，渦旋振蕩30 s，過0.22 μm PTFE 微孔濾膜后，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

常見的流動(dòng)相體系有甲醇-水和乙腈-水體系，在此基礎(chǔ)上正離子模式中常加入甲酸、乙酸銨等對(duì)峰形和保留時(shí)間進(jìn)行改善。本實(shí)驗(yàn)對(duì)以上幾種流動(dòng)相體系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在同一梯度洗脫條件下，甲醇-水體系對(duì)甲基香蘭素和乙基香蘭素的分離效果優(yōu)于乙腈-水體系；而加入甲酸或乙酸銨等緩沖鹽的流動(dòng)相對(duì)保留時(shí)間無明顯影響，添加甲酸后各個(gè)組分的響應(yīng)均有明顯增強(qiáng)，但加入乙酸銨對(duì)各個(gè)組分的響應(yīng)有明顯的抑制作用。此外，本文比對(duì)了添加0.05%～0.20%甲酸對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加酸濃度對(duì)分析物保留時(shí)間無明顯影響，與相關(guān)文獻(xiàn)[19-21]報(bào)道情況相符，綜合色譜柱保養(yǎng)以及分離效果的考慮下，選用0.1%甲酸。因此，本文最終選用甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，該條件下色譜峰圖譜見圖1。

圖1 色譜圖

2.1.2 色譜柱的選擇

由于香蘭素等4 個(gè)組分均有一定的極性，且甲基香蘭素和乙基香蘭素互為同分異構(gòu)體，對(duì)分離要求較高，因此本文選擇對(duì)極性分子分離效果較好的3 根反相色譜柱進(jìn)行比較。經(jīng)過比較，在甲醇-0.1%甲酸水溶液體系下Atlantis T3 的峰形與分離效果較好，因此選用Atlantis T3 柱為色譜柱。

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

香蘭素、甲基香蘭素等4 個(gè)組分在醇類、酯類等極性有機(jī)溶劑中有較好的溶解性，且組分多呈弱酸性，因此本實(shí)驗(yàn)選取比較了1%氨水、甲醇、乙腈和乙酸乙酯等4 種提取溶劑，考察其對(duì)大米中香精的提取效率。在樣品中加入濃度為10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，即添加濃度為1 mg·kg-1，將樣品混合均勻并靜置30 min，用10 mL 上述4 種溶劑分別進(jìn)行提取。由圖2可知，1%氨水對(duì)香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的提取效率在85%以上，但對(duì)香豆素的提取效率不佳，只有30%左右；而乙酸乙酯對(duì)4 種組分的提取效率均在85%以上，甲醇和乙腈的提取效率均能達(dá)到90%以上，且甲醇略優(yōu)于乙腈，因此3 種溶劑的提取效率為甲醇>乙腈>乙酸乙酯。在提取過程中，甲醇和乙腈的提取液較為澄清，樣品離散效果好，而1%氨水和乙酸乙酯的提取液較為混濁。這是由于大米中的水溶性雜質(zhì)和淀粉容易溶解在1%氨水中，油脂類雜質(zhì)更易溶于乙酸乙酯中。此外，與乙腈相比，甲醇的毒性相對(duì)較小，價(jià)格低廉，適合大批量檢驗(yàn)提取，且選取甲醇作為提取溶劑時(shí)，儀器基線平穩(wěn)，無明顯雜峰干擾。因此，本文選用甲醇作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑提取效率對(duì)比圖

2.2.2 提取方式及時(shí)間的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以甲醇為試劑進(jìn)行提取，分別比較了渦旋振蕩、超聲提取以及兩種方式混合提取的提取效果。在樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制備成含量為1 mg·kg-1的加標(biāo)樣品，將加標(biāo)樣品充分混勻并靜置30 min 后進(jìn)行提取，分別于渦旋振蕩、超聲提取和復(fù)合提取的條件下測(cè)定其提取效率。結(jié)果表明，渦旋振蕩和超聲提取的時(shí)間分別在達(dá)到10 min 和20 min 后提取效率基本不再增加；渦旋振蕩的整體提取效率只能達(dá)到90%左右，與超聲提取（95%）相比略低，但超聲提取所需時(shí)間較長(zhǎng)；采用復(fù)合方式進(jìn)行提取，在渦旋振蕩5 min 并超聲提取10 min 的提取條件下，不僅能獲得同樣的提取效果，還能縮減提取時(shí)間，因此最佳提取方式為渦旋振蕩5 min 及超聲提取10 min 的復(fù)合方式。

2.2.3 全自動(dòng)固相萃取儀凈化及氮吹濃縮處理

采用固相萃取柱處理樣品，不僅能對(duì)樣品溶液進(jìn)行凈化，降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)，還能濃縮樣品溶液，富集檢測(cè)目標(biāo)物進(jìn)而降低檢驗(yàn)方法的檢出限，但是固相萃取柱凈化過程往往較為煩瑣、且耗時(shí)較長(zhǎng)。近年來，有研究表明[22-23]，全自動(dòng)化的前處理輔助設(shè)備的需求和用途越來越大，全自動(dòng)固相萃取儀可有效節(jié)省檢驗(yàn)人員的時(shí)間，能自動(dòng)同時(shí)處理多個(gè)樣品，提高工作效率，而且儀器采用的全封閉式操作能大大降低污染和失誤操作的風(fēng)險(xiǎn)，減小人為誤差，能獲得更好的回收率和精密度。本實(shí)驗(yàn)選取了HLB、MAX 和C183 款固相萃取小柱，并對(duì)凈化效果進(jìn)行比較。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，C18對(duì)于各個(gè)組分的保留能力較弱，未能較好地吸附檢測(cè)組分，這是由于香蘭素、乙基香蘭素等組分呈弱酸性且具一定的極性，因此具備陰離子吸附作用的MAX 固相小柱和親水親脂平衡型的HLB 的保留效果均較好，且HLB 固相小柱在35%甲醇-水溶液的淋洗條件仍對(duì)4 個(gè)檢測(cè)組分具有極好保留能力，而MAX 在25%甲醇-水溶液條件下進(jìn)行淋洗時(shí)檢測(cè)組分隨著甲醇比例的增加逐步開始流失，HLB 固相小柱的保留能力和凈化除雜能力優(yōu)于MAX 固相小柱，因此本實(shí)驗(yàn)選用HLB 固相小柱作為凈化柱。在氮吹濃縮的過程中，發(fā)現(xiàn)濃縮液一旦完全吹干，將會(huì)使各個(gè)組分的回收率降低，而氮吹濃縮至0.1 mL時(shí)補(bǔ)液至1 mL，可有效避免檢測(cè)組分的損失。

2.2.4 防止污染帶入

香蘭素用途廣泛，除了在食品中應(yīng)用外，還被用于橡膠、塑料等工業(yè)用品中，因此實(shí)驗(yàn)過程中的器具耗材可能會(huì)帶入香蘭素的污染，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)操作中使用過的器具耗材（塑料離心管、移液器槍頭、一次性注射器、微孔濾膜、固相萃取柱、進(jìn)樣瓶蓋及墊片等）使用玻璃器皿盛裝，用適量甲醇浸泡并超聲20 min，濃縮至1 mL 進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)聚丙烯、聚四氟乙烯等高分子材料的器皿耗材不會(huì)帶入香蘭素，而常用的尼龍微孔濾膜有香蘭素溶出，浸出液濃度約為10 ng·mL-1，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，容易造成假陽性的現(xiàn)象。因此本實(shí)驗(yàn)所用器皿耗材均為聚丙烯、聚四氟乙烯或玻璃材質(zhì)。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)采用外標(biāo)法，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2所示，各組分在1～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.999。以定量離子的3 倍信噪比（S/N=3）為檢出限，測(cè)定各組分的檢出限，發(fā)現(xiàn)各組分的檢出限為1.5～4.7 μg·kg-1。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限表

2.3.2 加標(biāo)回收率及精密度

選取低（10 μg·kg-1）、中（50 μg·kg-1）、高（100 μg·kg-1）3 個(gè)添加水平，每個(gè)添加水平平行稱取6 份樣品，按1.3.3 的步驟對(duì)樣品進(jìn)行處理，測(cè)定方法的回收率及其精密度。如表3所示，各組分回收率在80.1%～89.3%，RSD 為1.7%～3.9%，滿足日常檢驗(yàn)的要求。

表3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.4 樣品實(shí)測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對(duì)東莞市多家糧食生產(chǎn)企業(yè)以及其他省份糧食生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的15 批市售大米中香蘭素等4 種香精的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，所檢樣品中均檢出香蘭素，樣品中香蘭素含量為52.3～242.8 μg·kg-1，甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素均未檢出。采用市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測(cè)定》（BJS 201705）重新測(cè)定香蘭素含量，測(cè)得樣品中香蘭素含量為55.1～258.3 μg·kg-1，同一樣品測(cè)定結(jié)果的相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～9.4%，說明本實(shí)驗(yàn)方法具有實(shí)際可行性。

3 結(jié)論

本研究建立了全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定大米中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素4 種香精的分析方法，以甲醇為溶劑進(jìn)行提取，經(jīng)渦旋和超聲提取，用水稀釋后通過全自動(dòng)固相萃取儀，使用Oasis HLB 固相小柱凈化，氮吹至近干后復(fù)溶上機(jī)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 種香精在質(zhì)量濃度為1～500 ng·mL-1時(shí)線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率在80.1%～89.3%，RSD 為1.7%～3.9%。該方法增加固相萃取步驟進(jìn)一步凈化樣品，同時(shí)利用全自動(dòng)固相萃取儀實(shí)現(xiàn)樣品凈化全自動(dòng)化操作，相比現(xiàn)有的大米檢測(cè)方法極大節(jié)省了時(shí)間和人力，簡(jiǎn)便有效，能為相關(guān)食品安全的檢驗(yàn)工作提供一定的技術(shù)參考。