微生物法測(cè)定乳粉中維生素B12的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證及結(jié)果分析

◎ 蘇妙儀，嚴(yán)家俊，綦 艷

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 順德 528300）

維生素B12又名鈷胺素（Cobalamin），是一類含鈷的咕啉類化合物，也是唯一含金屬元素的水溶性維生素，是人體所必需的維生素之一，對(duì)人體生理代謝與健康起著至關(guān)重要的作用[1-2]。缺乏維生素B12不僅會(huì)導(dǎo)致巨幼紅細(xì)胞貧血，還會(huì)引起心臟病、神經(jīng)紊亂、老年癡呆和帕金森綜合征等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。人體內(nèi)不能合成維生素B12，需要從動(dòng)物性食品中獲取。

嬰幼兒配方乳粉屬于特殊膳食用品，通過(guò)在基礎(chǔ)食物中添加多種營(yíng)養(yǎng)素而得，它主要針對(duì)嬰幼兒群體，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用[4-5]，也可增加?jì)胗變壕S生素營(yíng)養(yǎng)需求的均衡性[6]。為了更好地補(bǔ)充生長(zhǎng)發(fā)育所需各類營(yíng)養(yǎng)素，通常6 個(gè)月以上的嬰幼兒需要開始添加配方乳粉輔食，因此在嬰幼兒健康發(fā)育過(guò)程中合理添加配方乳粉至關(guān)重要[7-8]。研究表明，中國(guó)母乳喂養(yǎng)比例逐年下降，嬰幼兒奶粉已成為更多人的選擇，由此可見，嬰幼兒配方乳粉具有廣闊市場(chǎng)發(fā)展前景，其各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)要求也更加精確[9-10]。

維生素B12大多是借助于微生物發(fā)酵獲得[11]，其基質(zhì)復(fù)雜，儀器法難以滿足準(zhǔn)確測(cè)定的要求。目前，傳統(tǒng)微生物法是我國(guó)現(xiàn)行有效的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也是美國(guó)官方分析化學(xué)家協(xié)會(huì)和美國(guó)藥典推薦的方法。但是，我國(guó)現(xiàn)行檢測(cè)方法《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中維生素 B12的測(cè)定》（GB 5413.14—2010）[12]即將被《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B12的測(cè)定》（GB 5009.285—2022）[13]代替，其第三法微生物法適用于嬰幼兒食品、乳及乳制品中維生素B12的測(cè)定。本研究在GB 5009.285—2022 新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化測(cè)試菌液的制備和保存方法[14-15]，從標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、準(zhǔn)確性、回收率和精密度等結(jié)果分析該方法在本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件下的可行性與可靠性，為實(shí)驗(yàn)室開展此項(xiàng)檢測(cè)工作提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

萊氏曼士乳酸桿菌（ATCC 7830）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

嬰幼兒配方乳粉：貨號(hào)QC-IP-703，特性值4.111 μg/100 g，特性值區(qū)間3.471～4.752 μg/100 g：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；5 組不同品牌的乳粉：隨機(jī)購(gòu)買。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R 高速冷凍離心機(jī)（廣東省中科進(jìn)出口有限公司）；PHS-3G pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；XGI.D 型真空滅菌器（深圳市宇德立生物科技有限公司）；ZQZY-CS8V 振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（德國(guó)拜發(fā)公司）；UV-1900紫外可見分光光度計(jì)[島津（中國(guó)）有限公司]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的優(yōu)化制備

參考GB 5009.285—2022 并稍作修改[14]。將萊士曼氏乳酸桿菌的凍干菌株活化后，接種到乳酸菌肉湯培養(yǎng)基上，于(36±1)℃培養(yǎng)24 h。再轉(zhuǎn)種2～3 代增強(qiáng)活力。將活化后的菌液以8 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻。重復(fù)洗脫3 次，確保無(wú)殘留培養(yǎng)基干擾。加入50 mL 含有25%甘油的維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基，混勻制成菌株儲(chǔ)備液，分裝到菌株保存管中，每管1 mL，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)前從-70 ℃冰箱中取出適量的菌株儲(chǔ)備液，充分混勻。使用9 g·L-1生理鹽水將其稀釋成一定濃度的測(cè)試菌液，以9 g·L-1生理鹽水做空白，用紫外可見分光光度計(jì)于550 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)測(cè)試菌液的透光率，使測(cè)試菌液透光率在60%～80%，待用。經(jīng)驗(yàn)證，每10 mL 生理鹽水（9 g·L-1）中加入該批次菌株儲(chǔ)備液600 μL 所得測(cè)試菌液透光率在60%～80%，培養(yǎng)生長(zhǎng)良好[14-15]。

1.3.2 線性檢驗(yàn)

（1）工作曲線的配制。按照GB 5009.285—2022中的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。①試管法檢測(cè)按表1分別加入蒸餾水、維生素B12標(biāo)準(zhǔn)使用工作液和維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基于試管中，一式3 份。②微孔法按試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備方式，將體積按比例縮減至1.0 mL 后，在無(wú)菌條件下過(guò)濾除菌至無(wú)菌離心管中，一式3 份。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線試管法配制表

（2）滅菌。在所有需培養(yǎng)的試管內(nèi)分別加入一粒玻璃珠，蓋上試管帽，按商品培養(yǎng)基標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌（121 ℃滅菌5 min）。而微孔法無(wú)需高壓滅菌，但是所需維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基需高壓滅菌，然后備用。

（3）接種和培養(yǎng)。①試管法。將滅菌后的試管迅速冷卻至30 ℃以下，除標(biāo)準(zhǔn)曲線管中空白S1 管外，分別向S2～S10 試管中加入預(yù)先準(zhǔn)備好的1.3.1 測(cè)試菌液1 滴（約50 μL），將試管于（36±1）℃培養(yǎng)19～20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)每支試管進(jìn)行目測(cè)檢查，未接種試管S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果S1 管出現(xiàn)渾濁，則測(cè)定無(wú)效，需重做實(shí)驗(yàn)。②微孔法。維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基高壓滅菌冷卻后，每10 mL 培養(yǎng)基中加入菌種測(cè)試菌液100 μL，混勻，吸取150 μL 加入微孔板中[16]。另吸取150 μL 1.3.2（1）項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)系列管加入微孔板中，每個(gè)濃度做2 個(gè)平行。覆膜，混勻，置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44～48 h[17]。

（4）測(cè)定。①試管法。將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管用漩渦振蕩器混勻，以未接種空白試管S1 作為空白，用1 cm 比色杯于550 nm 處將透光率調(diào)節(jié)為100%（或吸光度值為0），讀出接種空白試管（S2）的讀數(shù)。再以接種空白試管（S2）為空白，調(diào)節(jié)透光率為100%（或吸光度值為0），依次讀出其他試管的透光率(或吸光度)。②微孔法。再次壓緊粘合箔，將微孔板翻置在桌面上，振蕩使微生物溶解在培養(yǎng)基中。將微孔板翻回如前置于桌面上，從右上角開始以對(duì)角線方向180°角輕扯下粘合箔，與此同時(shí)務(wù)必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔與微孔板粘合過(guò)緊而在撕扯時(shí)帶起微孔板。破壞微孔中液體表面的所有泡沫(可以用移液管尖或針狀物)。用酶標(biāo)儀在630 nm[17]條件下讀取吸光度。如果未接種空白試管S1 出現(xiàn)渾濁，說(shuō)明可能有雜菌污染，需重做實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

采用中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心貨質(zhì)控樣（貨號(hào)QC-IP-703，證書編號(hào)003IP02033）作為樣品，按照GB 5009.285—2022 中的方法進(jìn)行維生素B12的提取，試驗(yàn)重復(fù)6 次。①試管法按表2分別加入蒸餾水、試樣提取液和維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基于試管中，一式3 份。同步配制工作曲線，見表1。②微孔法。在無(wú)菌條件下將試樣提取液用無(wú)菌水相濾膜（0.22 μm）過(guò)濾除菌，取4支1.5 mL無(wú)菌離心管，分別加入100 μL、200 μL、300 μL 和400 μL 試樣提取液，補(bǔ)無(wú)菌水至500 μL。一式3 份。同步配制工作曲線同1.3.2（1）中微孔法。滅菌、接種、培養(yǎng)和測(cè)定等具體操作步驟參考1.3.2。將測(cè)定的平均含量與其特性值進(jìn)行相對(duì)誤差比較。

表2 待測(cè)液的配制表

1.3.4 回收率試驗(yàn)

稱取約1.0 g 質(zhì)控樣（貨號(hào)QC-IP-703，證書編號(hào)003IP02033）12 份于錐形瓶中，精確到0.000 1 g，分為空白、低、中和高4 組，每組3 份。分別準(zhǔn)確加入1 ng·mL-1維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液0 mL、10 mL、50 mL和100 mL 各3 份，按照GB 5009.285—2022 中的方法進(jìn)行維生素B12的提取、參考1.3.3 準(zhǔn)確性試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算回收率。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

隨機(jī)選取5 組不同品牌的配方乳粉作為試驗(yàn)樣品，每組樣品做6 次重復(fù)性試驗(yàn)。用平行結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差衡量精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性檢驗(yàn)

以標(biāo)準(zhǔn)系列管維生素B12含量為橫坐標(biāo)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程，結(jié)果見圖1、圖2。試管法和微孔法線性方程的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.993 和0.990，均≥0.99，表明在0～0.1 ng 時(shí)，兩種方法的吸光度值與維生素B12含量之間的線性關(guān)系良好，滿足檢測(cè)要求。

圖1 試管法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

2.2.1 質(zhì)控樣測(cè)定

以中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心的質(zhì)控樣（貨號(hào)QC-IP-703 證書編號(hào)003IP02033）作為樣品，檢測(cè)結(jié)果見表3。試管法與微孔法測(cè)定質(zhì)控樣中維生素B12含量分別為（4.06±0.13）μg/100 g 和（4.13±0.12）μg/100 g，2 種方法所測(cè)結(jié)果都與其特性值相符，相對(duì)誤差為-4.4%～3.4%，2 種方法準(zhǔn)確度均符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）的要求。而且試管法與微孔法的RSD 分別為3.2%和3.0%，表明重復(fù)性良好。

表3 試管法與微孔法測(cè)定質(zhì)控樣中維生素B12 結(jié)果表

2.2.2 加標(biāo)回收檢驗(yàn)

在0 ng、10 ng、50 ng 和100 ng 4 個(gè)不同的加標(biāo)量下做3 個(gè)平行，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。試管法平均回收率為99.2%～100.0%，微孔法的平均回收率為100.8%～101.0%，RSD 均＜2%，符合GB/T 27404—2008中關(guān)于回收率的要求，方法準(zhǔn)確。

表4 試管法與微孔法加標(biāo)回收檢驗(yàn)結(jié)果表

2.3 精密度試驗(yàn)

5 種不同品牌的乳粉，每種進(jìn)行6 次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5、表6。試管法的RSD 值為2.0%～3.1%，微孔法的RSD 值為1.7%～3.2%，表明兩種方法的重復(fù)性均良好。在顯著性水平α=0.05 時(shí)，F(xiàn)＜Fcrit，兩種方法無(wú)顯著性差異，5 組乳粉兩種方法測(cè)定結(jié)果一致，符合要求。

表5 試管法重復(fù)性檢驗(yàn)表

表6 微孔法重復(fù)性檢驗(yàn)表

3 結(jié)論與討論

微生物法利用相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌種對(duì)特定維生素有很強(qiáng)的特異性，在一定條件下，其生長(zhǎng)和繁殖速度與溶液中維生素的含量成一定對(duì)應(yīng)關(guān)系，可測(cè)定具有生物活性的維生素，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、范圍廣、靈敏度高，能滿足含量低和基質(zhì)復(fù)雜的特殊食品檢測(cè)。維生素B12是萊士曼氏乳酸桿菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)素。GB 5009.285—2022 中采用微生物法測(cè)定維生素B12的原理主要是利用萊士曼氏乳酸桿菌對(duì)維生素B12有極高的特異性和靈敏性，在一定條件下，萊士曼氏乳酸桿菌的生長(zhǎng)與維生素B12的含量成對(duì)應(yīng)關(guān)系，根據(jù)維生素B12的含量與透光率（或吸光度值）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，能定量計(jì)算出待測(cè)樣品中維生素B12的含量。

GB 5009.285—2022 新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)微孔法進(jìn)行具體操作說(shuō)明，本研究建立的微孔法是參考即將實(shí)施的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》（GB 5009.211—2022）的標(biāo)準(zhǔn)方法[16]，并結(jié)合VitaFast?維生素B12檢測(cè)試劑盒[17]中維生素B12培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳粉中維生素B12含量進(jìn)行測(cè)定。從標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、準(zhǔn)確性、精密度可知，微孔法與試管法檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，效果相當(dāng)，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。且微孔法具有檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、省時(shí)、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，在制備樣液過(guò)程中無(wú)需高壓滅菌，操作簡(jiǎn)單，在培養(yǎng)過(guò)程中能大大降低培養(yǎng)箱空間，培養(yǎng)結(jié)束后直接運(yùn)用酶標(biāo)儀即可測(cè)量相關(guān)數(shù)據(jù)，極大地節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。而試管法需用到大量試管、器皿等，清洗要求較高且煩瑣，在滅菌和培養(yǎng)時(shí)占用空間大，使用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值時(shí)需要較長(zhǎng)時(shí)間。在工作中，可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法。

本研究在GB 5009.285—2022 新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了測(cè)試菌液的制備和保存方法，通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線線性，對(duì)QC-IP-703 質(zhì)控樣和5 組不同品牌的乳粉進(jìn)行檢測(cè)以及加標(biāo)回收試驗(yàn)。驗(yàn)證結(jié)果表明，試管法和微孔法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系R2≥0.99，準(zhǔn)確性以及精密度等滿足標(biāo)準(zhǔn)方法要求，可操作性強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)室具有開展GB 5009.285—2022 微生物法測(cè)定乳粉中維生素B12的檢測(cè)能力，可以開展此項(xiàng)檢測(cè)工作。