馬 凱 鄧 婕 左 嘉 劉 悅 王秋水 袁立艷 白文波 高麗娟*
(1.北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所(北京市理化分析測(cè)試中心), 北京 100089; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所,北京 100081)
產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens),又稱魏氏梭菌(Clostridium welchii), 是一種革蘭氏陽性桿狀厭氧菌(G+), 廣泛存在于空氣、污水、土壤、各種食品以及動(dòng)物和人類的胃腸道中[1],是典型的毒素致病菌[2],也是人類氣性壞疽的主要病原菌,會(huì)導(dǎo)致食源性疾病、食物中毒、非食源性腹瀉等疾病[3]。該細(xì)菌產(chǎn)芽孢,在極端條件下如高溫高壓、消毒劑、輻射等會(huì)產(chǎn)生抗逆性[4,5],在處理污水時(shí)不易殺死,導(dǎo)致飲用水易受微生物污染,所以檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌是評(píng)價(jià)水資源污染程度的重要指標(biāo)[6,7]。
目前國內(nèi)外對(duì)于飲用水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢測(cè)指標(biāo)還不夠明晰。GB/T 5749?2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CFU/100 mL)的限制為0[8],在GB/T 5750.12?2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》中并未規(guī)定其檢驗(yàn)方法[9]。GB 8537?2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》規(guī)定引用天然礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(CFU/50 mL)的限量為n=5、c=0、m=0[10]。歐盟理事會(huì)98/83/EEC中采用濾膜法加厭氧培養(yǎng)法檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌[11],ISO 6461?1:1986還原亞硫酸鹽的厭氧菌(梭菌屬)芽孢的檢測(cè)和計(jì)數(shù)中采用液體培養(yǎng)基增菌法,6461?2:1986采用膜濾法,兩部標(biāo)準(zhǔn)均是檢測(cè)梭菌屬(芽孢),不是針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法。英國國家標(biāo)準(zhǔn)EN 26461?1:1993和26461?2:1993是在前兩者基礎(chǔ)上的更新版本,非針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的檢驗(yàn)方法。AOAC 976.30食品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢測(cè)方法通過選擇性培養(yǎng)基TSC分離和富集出典型菌落,然后挑取一定比例典型菌落進(jìn)行確證試驗(yàn),按比例計(jì)算出樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的數(shù)量[12,13]。美國標(biāo)準(zhǔn)AOAC 993.10貝類產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的測(cè)定,通過MPN法與IMM法結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的定量[14],加拿大國家標(biāo)準(zhǔn)MFHPB?2、3[15]和日本《食品安全檢測(cè)指南·微生物篇修訂第2版2018》標(biāo)準(zhǔn)是通過選擇性培養(yǎng)分離出產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌再進(jìn)行計(jì)數(shù)。國內(nèi)關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法主要有平板計(jì)數(shù)法、濾膜法和環(huán)介導(dǎo)恒溫PCR的方法,PCR檢測(cè)方法主要應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中,此方法靈敏度高,特異性強(qiáng),在臨床上可以做出早期的快速診斷,為臨床早期治療提供依據(jù)。而傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法和濾膜法分別用于食品或者水中的檢測(cè),相對(duì)成本較低,檢測(cè)的準(zhǔn)確性相對(duì)較高,適用于采用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌作為指示菌來檢測(cè)水中病原微生物[16]。
對(duì)現(xiàn)行有效的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匯總對(duì)比以及常用檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的方法發(fā)現(xiàn),目前缺乏專門針對(duì)飲用水中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌明確的檢測(cè)方法和限量標(biāo)準(zhǔn),且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、所用培養(yǎng)基較多等缺點(diǎn)[17,18]。因此,本研究基于國家標(biāo)準(zhǔn)采用濾膜法,通過濾膜過濾一定體積水樣,將菌截留在濾膜上,將濾膜培養(yǎng)在選擇性培養(yǎng)基上,根據(jù)產(chǎn)生的典型菌落形態(tài)選取可疑菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn),并對(duì)該方法精密性、準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察,以證明此方法具有普遍性、科學(xué)性、先進(jìn)性和適用性。
SQP型電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司); BHC?1600 IIA/B3型生物安全柜(AIRTECH蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); AW200SG型厭氧培養(yǎng)工作站(英國依萊泰科公司); LRH?150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);pH計(jì);冰箱;恒溫水浴鍋;顯微鏡;微生物鑒定系統(tǒng);無菌濾器。
產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens,CICC 22949)、蛋白胨、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶瓊脂(SPS)、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基( FT )、硫酸亞鐵、新鮮全脂牛奶、卵黃瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、硝酸鹽還原試劑、生化鑒定試劑盒,試劑均為北京陸橋。
1.2.1 濾膜法
采用濾膜過濾器過濾水樣,使水樣通過孔徑為 0.45 μm的濾膜過濾,細(xì)菌被阻留在膜上,將濾膜的截留面朝下貼在SPS培養(yǎng)基或TSC培養(yǎng)基上,36℃±1℃厭氧培養(yǎng)18~24 h后,計(jì)算黑色菌落數(shù),挑選5個(gè)典型菌落進(jìn)行確證試驗(yàn),產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌是能夠分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣,產(chǎn)卵磷脂酶分解卵黃中的卵磷脂,液化明膠的革蘭氏陽性桿菌,結(jié)合確證試驗(yàn)結(jié)果與計(jì)數(shù)結(jié)果,計(jì)算得到100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)[21]。
1.2.2 培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度優(yōu)化
潛在的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落呈現(xiàn)黑色是判定可疑菌落的關(guān)鍵,是確證試驗(yàn)的基礎(chǔ)。為使目標(biāo)菌菌落呈現(xiàn)黑色,需將現(xiàn)行培養(yǎng)基中亞硫酸鹽濃度提高1倍,即每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽。本研究中使用的SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽成分作為補(bǔ)劑單獨(dú)保存,在使用時(shí)添加1支補(bǔ)劑。
1.2.3 濾膜放置的方式優(yōu)化
在現(xiàn)行相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中,水樣濾膜后濾膜的截留面朝上放置培養(yǎng)、或是濾膜的截留面朝上放置培養(yǎng)結(jié)合加注瓊脂等[19,20]。濾膜的截留面朝下倒置培養(yǎng),對(duì)比濾膜正置培養(yǎng)或加注瓊脂法,產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌在在瓊脂上呈現(xiàn)黑色效果更顯著,選擇性更強(qiáng),容易辨別。
1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證單位和試驗(yàn)用水的選擇
從全國范圍內(nèi)選擇5家檢測(cè)機(jī)構(gòu)作為試驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證單位進(jìn)行試驗(yàn)的精密度、準(zhǔn)確度驗(yàn)證。試驗(yàn)用實(shí)際水樣來自覆蓋全國范圍的珠江、長(zhǎng)江、黃河、淮河、遼河、海河、松花江等七大水系。
1.2.5 濾膜法的精密度實(shí)驗(yàn)
按照3種水樣(末梢水自來水、水源水水庫水和河水)分別接種低、中、高3個(gè)濃度的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌制備樣品,進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌濾膜法的檢測(cè),每種水樣低、中、高濃度平行測(cè)定 6 次,分別計(jì)算樣品的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差[19,20]。
1.2.6 濾膜法的準(zhǔn)確度驗(yàn)證
對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品(可接受范圍為1000 CFU~5000 CFU)進(jìn)行兩次重復(fù)測(cè)定。對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)定,一共采集了110份水源水(河水、水庫水)、末梢水(自來水)樣品,其中38份自來水樣品、36份水庫水樣品、36份河水樣品[21]。
1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析
(1) 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計(jì)數(shù)[22]:
對(duì)濾膜上確證為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(2) 產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的計(jì)算:
根據(jù)檢驗(yàn)用樣品量,按下式計(jì)算出每100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌落數(shù),結(jié)果以CFU/100 mL計(jì)。
每100 mL樣品中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌數(shù)(CFU/100 mL)=
式中:
A——可疑的黑色菌落數(shù),CFU;
B——確證為產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落數(shù),CFU;
C——用于確證試驗(yàn)的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落數(shù),CFU;
d——100 mL過濾水中實(shí)際包樣品的量,100 mL。
SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的作用是使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生黑色菌落,產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌可還原亞硫酸鹽為硫化物,硫化物與鐵反應(yīng)生成黑色硫化鐵,使菌落中心呈黑色。本研究使用的SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度為每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加50 mg亞硫酸鹽,通過標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn),濾膜截留面朝上放置培養(yǎng)后的黑色菌落不明顯,多數(shù)菌落呈現(xiàn)灰色或黃色(圖1)。同樣實(shí)驗(yàn)條件下,進(jìn)一步將亞硫酸鹽的濃度加倍,使得每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽,濾膜上菌落黑色程度改善不明顯。
圖1 濾膜截留面朝上培養(yǎng),亞硫酸鹽單倍濃度
在濾膜上方加注一層瓊脂可以使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌在瓊脂上的菌落呈現(xiàn)黑色。但是加注瓊脂會(huì)帶來諸多不便,如注時(shí)會(huì)出現(xiàn)將濾膜上截留的菌沖起來的情況,被沖起來的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的菌落同樣存在菌落黑色不明顯或不顯黑色;加注一層瓊脂后,會(huì)為后續(xù)接種針穿過瓊脂挑取可疑菌落增加難度,如雜菌較多時(shí),會(huì)出現(xiàn)挑取的菌落不純的情況。
將濾膜的截留面朝下倒置,貼合培養(yǎng)基培養(yǎng),可以緩解避免上述問題。并且與正置培養(yǎng)相比,菌落黑色程度增加,進(jìn)一步將SPS培養(yǎng)基中亞硫酸鹽的濃度加倍,使得每100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加100 mg亞硫酸鹽后,幾乎濾膜上所有菌落都會(huì)呈現(xiàn)明顯黑色,容易辨別。如圖2所示。
圖2 濾膜截留面朝下培養(yǎng),亞硫酸鹽加倍濃度
結(jié)果顯示,各實(shí)驗(yàn)室低、中、高濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.1%~19.1%,3.1%~19.0%,3.1%~22.4%。具體見表1、表2、表3所示。
表2 加標(biāo)的精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)
表3 加標(biāo)的精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)
測(cè)定質(zhì)控樣品結(jié)果顯示相對(duì)誤差范圍為?32.0%~110.0%;相對(duì)誤差最終值為22.8%±62.8%。110份實(shí)際樣
品檢測(cè)中檢出樣品21個(gè),結(jié)果范圍為0~180 CFU/100 mL。測(cè)定實(shí)際樣品結(jié)果具體見表4和表5。
表4 質(zhì)控樣品的測(cè)定表
表5 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果
通過改善SPS培養(yǎng)基成分構(gòu)成,將培養(yǎng)基亞硫酸鹽濃度提升為100 mg/每100 mL,結(jié)合將濾膜的截留面朝下倒置與培養(yǎng)基貼合培養(yǎng),可以使產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生明顯的黑色菌落,選擇性更強(qiáng),更便于菌落計(jì)數(shù)和進(jìn)一步的確證試驗(yàn)的進(jìn)行。
倒置濾膜法測(cè)定水質(zhì)中產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌方法的建立,通過6家實(shí)驗(yàn)室,分析全國不同水系水樣,得出該方法的精密度、準(zhǔn)確度良好, 滿足標(biāo)準(zhǔn)要求, 可用于實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)檢驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程不涉及特殊大型儀器設(shè)備,且檢測(cè)成本低,實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)難度不大,容易理解和掌握,適合全國各地不同發(fā)展技術(shù)水平實(shí)驗(yàn)室操作,具有科學(xué)合理性、適用性和普及性。