李 芳，隗 明，徐 帥，岳 苑，邱小彤，韓李超，陳勝林，劉雪萍，任明輝，李振軍,

諾卡菌是腐生需氧型革蘭陽性絲狀細(xì)菌，屬于放線菌綱、放線菌目、諾卡菌科、諾卡菌屬，廣泛存在于山川、湖泊及腐爛植被中[1-2]。該菌主要感染免疫功能低下或伴有合并癥患者，引起肺諾卡菌病、皮膚諾卡菌病、心內(nèi)膜炎、小腸諾卡菌病等，嚴(yán)重時可造成神經(jīng)系統(tǒng)感染，危及人和動物的生命[3-4]。其中，鼻疽諾卡菌、巴西諾卡菌為臨床常見致病菌[5-7]。

傳統(tǒng)諾卡菌的鑒定方法為生化試驗，準(zhǔn)確率較低，且耗時長[5]；諾卡菌病由于沒有特征性癥狀，常被臨床忽視，等待報告時間段多為經(jīng)驗性用藥，易延誤患者的病情[8]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，建立了以16SrRNA、hsp65、gyrB、rpoB、secA1、16S rRNA-23S rRNA基因間隔區(qū)(ITS)為靶基因的PCR方法檢測諾卡菌，然而這些基因位點存在于所有諾卡菌物種中且過于保守，需要通過進(jìn)一步測序才能達(dá)到對諾卡菌物種的準(zhǔn)確鑒別[9-11]。

為了更加高效、準(zhǔn)確地鑒定常見諾卡菌，本研究基于本課題組前期篩選的鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌特異性基因(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，設(shè)計特異性引物，旨在建立一種能同時鑒別兩種臨床常見諾卡菌的快速、經(jīng)濟、精確的SS-PCR檢測方法，將諾卡菌的檢測提高到種水平，對諾卡菌的臨床診斷具有重要應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 PCR儀(德國Senso公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)，電泳儀(中國百晶生物技術(shù)有限公司)，凝膠成像分析儀(日本GE公司)，核酸濃度檢測儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.1.2 試劑 腦心浸液培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)，金牌Mix(中國全式金生物技術(shù)有限公司)，DNA marker(日本TaKaRa公司)，GoldView (中國艾德萊生物科技有限公司)，Wizard基因組DNA純化試劑盒(美國Promega生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 菌株來源 本實驗所用菌株共計150株，其中13株鼻疽諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和3株巴西諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株來源于德國菌種保藏中心；82株鼻疽諾卡菌臨床分離株(北京市17株、江蘇省7株、陜西省9株、甘肅省27株、四川省4株、廣東省8株、寧夏省4株、未知來源6株)和10株巴西諾卡菌臨床分離株(浙江省2株、四川省1株、湖南省1株、北京市2株、山東省1株、未知來源3株)； 7株蓋爾森基興諾卡菌、2株星形諾卡菌、3株豚鼠諾卡菌、2株膿腫諾卡菌、3株新星諾卡菌、2株亞洲諾卡菌、2株老兵諾卡菌、2株肉色諾卡菌、4株鏈霉菌、1株紅球菌、6株分枝桿菌、1株束村氏菌、1株戈登氏菌、2株糖多孢菌、4株棒狀桿菌均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計基于鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌特異性基因序列，通過CmSuite軟件(v8.0)和BLAST軟件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)共設(shè)計16對引物。引物由北京生工生物工程(上海)股份有限公司合成，本研究采用的兩對引物，見表1。

表1 諾卡菌靶基因及引物信息Tab.1 Pathogen target gene and primer information

1.2.2 DNA提取 將細(xì)菌接種于BHI液體培養(yǎng)基中，待生長至對數(shù)生長期，取菌液200 μL接種于20 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌18 h，4 000 r/min離心10 min棄上清，按照Wizard基因組DNA純化試劑盒提取模板，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 質(zhì)粒制備 鼻疽諾卡菌特異性靶基因為NFA_41530，巴西諾卡菌特異性靶基因為O3I_RS18895，擴增片段交由上海生工公司制備質(zhì)粒pESI-NFA_41530和pESI-O3I_RS18895。每個堿基的平均分子量為660，pESI-T質(zhì)粒含1 865個堿基，單質(zhì)粒分子量為660×(目的基因片段堿基數(shù)+1 865)，每微升拷貝數(shù)=(質(zhì)粒濃度/單質(zhì)粒分子量)×10-9×阿伏伽德羅常數(shù)。

1.2.4 SS-PCR條件優(yōu)化 以標(biāo)準(zhǔn)菌株巴西諾卡菌DSM 43758、鼻疽諾卡菌IFM 10152的DNA為模板，擴增體系為25 μL，其中引物0.1～1 μL(10 μmol/L)設(shè)10個梯度，模板1 μL，用金牌Mix補齊至25 μL。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度設(shè)58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃，6個梯度30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；終末延伸5 min。最后取4 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖180 V 15 min進(jìn)行電泳，使用成像儀觀察目的條帶大小，并記錄結(jié)果。

1.2.5 SS-PCR特異性的評價 使用108株目標(biāo)菌株和42株非目標(biāo)菌株進(jìn)行特異性檢測。以巴西諾卡菌DSM 43758和鼻疽諾卡菌IFM 10152作為陽性對照，無核酶水作為陰性對照。

1.2.6 SS-PCR靈敏度的評價 將鼻疽諾卡菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、巴西諾卡菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別按10倍梯度進(jìn)行逐級稀釋成108～103copies/μL。然后通過SS-PCR方法分別對鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌的質(zhì)粒進(jìn)行擴增，每個濃度設(shè)3個平行樣本，實驗均為陽性結(jié)果則判定為陽性。同時將標(biāo)準(zhǔn)菌株巴西諾卡菌DSM 43758、鼻疽諾卡菌IFM 10152的菌液按照108～101cfu/mL濃度梯度稀釋，提取DNA，每個稀釋度取3 μL作為模板。

1.2.7 模擬痰樣本的檢測 先用PBS調(diào)菌懸液至OD值為1，再對20份健康人痰液樣本進(jìn)行依次編號，將每份痰樣本分為兩組。一組為試驗組：每份模擬痰樣本總體積為1 mL，其中1-5號樣本中加入100 μL鼻疽諾卡菌懸液，6-10號樣本中加入100 μL巴西諾卡菌懸液，11-20號樣本中加入鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌懸液各100 μL，用痰液樣本補齊至1 mL。另外一組做平行對照：加入相對應(yīng)體積的PBS于痰液樣本，使得每份陰性對照樣本總體積為1 mL?；靹?，提取核酸。采用SS-PCR方法判斷痰樣本中檢測符合率。

2 結(jié) 果

2.1 SS-PCR引物的確定 通過篩選最終選擇種特異性引物farToT_F/R和braToT_F/R，最后將PCR產(chǎn)物送到上海生工測序，所得到的序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明擴增產(chǎn)物與目標(biāo)菌株序列一致。

2.2 SS-PCR擴增條件的優(yōu)化 經(jīng)多次調(diào)整，最終確定反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火溫度68 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；終末延伸5min。反應(yīng)體系為25 μL，其中farToT_F/R為0.2 μL(10 μmol/L)，braToT_F/R為0.5 μL(10 μmol/L)；模板為1 μL；金牌Mix補齊25 μL。分別以巴西諾卡菌DSM 43758、鼻疽諾卡菌IFM 10152為模板進(jìn)行單一PCR擴增時，結(jié)果顯示巴西諾卡菌和鼻疽諾卡菌擴增為單一且清晰的目的條帶；其次將二者同時加入該反應(yīng)體系中，結(jié)果均能夠擴增出鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌的目的片段(圖1)。表明SS-PCR可以同時擴增出巴西諾卡菌和鼻疽諾卡菌，且兩者間無交叉反應(yīng)。

注：M.DNA Marker DL2000；1. O3I_RS18895 gene；2. NFA_41530 gene；3. NFA_41530 gene and O3I_RS18895 gene；4.Negative control。圖1 NFA_41530基因和O3I_RS18895基因的PCR擴增 Fig.1 PCR amplification of NFA_41530 and O3I_RS18895 genes

2.3 SS-PCR特異性評價 分別采用鼻疽諾卡菌、巴西諾卡菌和非目標(biāo)菌株引物擴增，結(jié)果顯示鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌分別呈現(xiàn)清晰且單一的目的條帶(805 bp左右和378 bp左右)，非目標(biāo)菌株無擴增條帶，重復(fù)3次，結(jié)果均一致。表明本試驗種特異性引物farToT_F/R和braToT_F/R具有很好的特異性及穩(wěn)定性(圖2)。

注：M.DNA Marker DL2000；1-22.鼻疽諾卡菌，目的片段805 bp左右；23-32.巴西諾卡菌，目的片段378 bp左右；33-47.紅球菌、鏈霉菌、分枝桿菌、戈登氏菌、糖多孢菌、束村氏菌、亞洲諾卡菌、蓋爾森基興諾卡菌、星形諾卡菌、肉色諾卡菌、新星諾卡菌、豚鼠諾卡菌、膿腫諾卡菌、紋帶棒狀桿菌、老兵諾卡菌；48.陰性對照。圖2 SS-PCR特異性檢測Fig.2 SS-PCR for species-specific detection

2.4 SS-PCR靈敏度評價 巴西諾卡菌質(zhì)粒濃度為58.2 ng/μL；鼻疽諾卡菌質(zhì)粒濃度為37.4 ng/μL。計算得到NFA_41530質(zhì)粒、O3I_RS18895質(zhì)粒的拷貝數(shù)分別為1.3×109copies/μL、2.4×109copies/μL。將鼻疽諾卡菌、巴西諾卡菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，在稀釋至104copies/μL后仍能擴增出目標(biāo)條帶，靈敏度分別為1.3×104copies/μL、2.4×104copies/μL；此外，擴增體系檢測靈敏度為103cfu/mL。表明該方法具有較高的靈敏度(圖3、圖4)。

注：M.DNA Marker DL2000；1-6.鼻疽諾卡菌基因1.3×108至1.3×103 copies/μL DNA，藍(lán)色圈出1.3×104 copies/μL，大小為805 bp；7.陰性對照。圖3 鼻疽諾卡菌靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity verification for Nocardia farcinica

注：M.DNA Marker DL2000；1-6.巴西諾卡菌基因2.4×108至2.4×103 copies/μL DNA，藍(lán)色圈出2.4×104 copies/μL，大小為378 bp；7.陰性對照。圖4 巴西諾卡菌靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity verification for Nocardia brasiliensis

2.5 SS-PCR對模擬痰標(biāo)本的鑒定結(jié)果 結(jié)果顯示試驗組1-5號樣本呈現(xiàn)單一目的條帶，大小為805 bp；試驗組6-10號樣本呈現(xiàn)單一目的條帶，大小為378 bp；試驗組11-20號樣本分別在805 bp和378 bp處呈現(xiàn)目的條帶；對照組均無出現(xiàn)擴增條帶。表明SS-PCR在20份痰樣本中檢測符合率為100%，該方法在痰樣本中具有良好的靈敏度(圖5)。

注：M.DNA Marker DL2000；1-5.模擬鼻疽諾卡菌陽性痰標(biāo)本，目的片段805 bp；6-10.模擬巴西諾卡菌陽性痰標(biāo)本，目的片段378 bp；11-20.模擬鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌混合痰標(biāo)本；21.陽性對照；22.陰性對照；23-42.健康人痰標(biāo)本陰性對照。圖5 SS-PCR痰模擬樣本檢測Fig.5 SS-PCR sputum simulation sample detection

3 討 論

近年來，國內(nèi)外關(guān)于鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌病例的報道逐漸增多，由諾卡菌引起腦膿腫的發(fā)生率也在逐年增高[12-14]。目前，諾卡菌的鑒定方法主要為16SrRNA基因鑒定，然而該方法依賴于測序，鑒定時間較長，早期診斷價值較低[9]。近年來，核酸擴增技術(shù)的檢測越來越多地用于細(xì)菌檢測[15-17]，但很少有研究報道使用特異性基因全長作為擴增目的片段。由于巢氏PCR技術(shù)需要使用第1次擴增產(chǎn)物作為第2次擴增的模板，導(dǎo)致操作復(fù)雜；而實時熒光PCR依賴實時收集熒光信號的儀器，設(shè)備昂貴。因此，高效且精準(zhǔn)鑒定鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌的方法亟待解決。

本研究首次利用鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌的NFA_41530、O3I_RS18895基因全長設(shè)計特異性引物建立SS-PCR方法，該技術(shù)可在2 h內(nèi)精確鑒定到種水平。并且具有靈敏度高和特異性強的優(yōu)點，可以對分類學(xué)上易混淆的物種進(jìn)行區(qū)分。與以往孫渭歌等[18]報道的PCR方法相比，后者采用多重PCR方法，同時檢測諾卡菌的rpoB、secA1、16SrRNA基因(擴增體系檢測靈敏度為104cfu/mL)，SS-PCR采用特異性基因的靈敏度更高，可達(dá)103cfu/mL。

本研究使用的雙重SS-PCR技術(shù)引物長度大于20 bp，引物之間的潛在相互作用容易形成二級結(jié)構(gòu)；此外，諾卡菌的基因組GC含量較高，長串聚嘌呤或聚嘧啶加大了引物設(shè)計的難度[5]。本研究共設(shè)計16對引物通過不斷優(yōu)化篩選出最優(yōu)引物組合，為了兼顧同一體系中鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌的靈敏度和特異性，我們篩選出最優(yōu)的引物濃度分別為0.2 (10 μmol/L)、0.5 (10 μmol/L)，體系中引物的含量的差異可能是兩對引物擴增效率的不同。

本研究也存在一定局限性。鑒于臨床分離的菌株種類較單一，收集的巴西諾卡菌臨床菌株數(shù)量較少；此外，由于諾卡菌在臨床診斷中易被忽視，增加了收集樣本的難度，因此本研究只能采用模擬痰樣本預(yù)估實用性。

綜上所述，本研究建立的SS-PCR方法能快速檢出鼻疽諾卡菌和巴西諾卡菌，快速、靈敏、特異的SS-PCR方法不僅為我們提供了一個有價值的檢測工具，而且也為基層地區(qū)的防控提供了技術(shù)支持，對諾卡菌的臨床診斷具有重要的潛在應(yīng)用價值。

利益沖突：無