吳珊 邱俊 陳俊宇 陳瑩瑩 王月婷 王楠 劉淑香 趙淑華

(1吉林大學第二醫(yī)院，吉林 長春 130041；2空軍航空大學門診部；3吉林大學護理學院；4浙江大學醫(yī)學院附屬婦產科醫(yī)院)

核酸外切酶(EXO)1兼有5'端-3'端外切酶及5'端結構特異性內切酶活性〔1〕，屬于皮瓣結構特異性內切酶(Rad)2/著色性干皮病(XP)G組蛋白家族的成員。EXO1蛋白具有EXO1a及EXO1b兩種異構體，其中EXO1b的C端額外具有48個氨基酸，因而活性明顯優(yōu)于EXO1a〔1〕，但兩者的功能并無區(qū)別。

EXO1不僅參與DNA損傷細胞的周期調控和細胞凋亡的調節(jié)，還在DNA錯配修復(MMR)、DNA雙鏈斷裂修復(DSBR)、DNA損傷應答(DDR)、DNA末端剪切及細胞分裂的重組修復中發(fā)揮重要作用。研究表明，EXO1基因缺陷可能增加乳腺癌、卵巢癌及肺癌等多種惡性腫瘤的易感性及化療耐藥性。此外，EXO1的多態(tài)性可預測胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、上皮性卵巢癌及非小細胞肺癌的預后〔2〕。本文就EXO1蛋白在DNA損傷中研究進展予以綜述。

1 EXO1參與細胞周期調控

真核細胞發(fā)生DNA損傷時，調控DNA修復及細胞周期進程的信號通路激活，從而保持基因組的完整性〔3〕，EXO1可與多種細胞周期調節(jié)蛋白相互作用。在細胞增殖的S期，增殖細胞核抗原(PCNA)與EXO1表達共定位，通過與EXO1中的PCNA相互作用蛋白盒(PIP-box)結合，激活EXO1對雙鏈DNA(dsDNA)的外切酶活性〔4〕。DNA損傷檢測點Cdc25磷酸化可介導細胞G1/S期轉化，并為14-3-3蛋白提供結合位點〔5〕。14-3-3蛋白具有多種異構體，在細胞信號轉導、細胞凋亡及細胞分裂中發(fā)揮重要作用，其中，14-3-3η及σ可激活人EXO1蛋白。研究發(fā)現，結直腸癌細胞中14-3-3σ過表達可誘導G2期阻滯，在dsDNA末端剪切過程中14-3-3σ可抑制PCNA依賴的EXO1蛋白激活途徑，DNA損傷時EXO1蛋白還可作為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3的上游分子，參與細胞凋亡〔6〕。

2 EXO1參與DNA MMR

MMR是一種高度保守的DNA修復途徑，通過更正DNA復制、修復及重組過程中出現的DNA堿基錯配、插入和缺失環(huán)(IDLs)，維持基因組穩(wěn)定性〔7〕。MMR分為兩種途徑，一方面，減數分裂重組蛋白(MRE)11、DNA交聯修復蛋白(DCLRE)1C及FAN1 (FANCD2/FANCI-Associated Nuclease 1)不依賴EXO1直接參與MMR〔8〕。另一方面，EXO1蛋白的N端和C端分別與錯配修復蛋白Muts同源體(MSH)3、MLH1 和MSH2相互作用，從而完成MMR〔9〕。MSH2和MSH6形成異二聚體MutSα，識別堿基錯配和最多3 nt的IDL；MSH2和MSH3形成異二聚體MutSβ，識別13 nt大小的IDL，從而啟動MMR〔10〕。之后，MutL同源體(MLH)1和MLH4形成具有內切酶活性的異二聚體MutLα，后者與PCNA及復制因子(RF)C一同聚集至錯配位點，繼而招募EXO1與MutSα(或β)及MutLα相互作用，對含有錯配堿基的DNA鏈進行剪切。在此過程中，復制蛋白(RP)A通過調節(jié)EXO1蛋白對DNA的親和力，確保剪切的安全性〔11〕。研究發(fā)現，EXO1敲除的細胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)增加，EXO1基因缺陷小鼠的腫瘤易感性增加〔12〕。

3 EXO1參與DDR

DDR是一種復雜的DNA損傷修復機制，通過多種蛋白的參與，恢復DNA的完整性及保真性，維持其遺傳穩(wěn)定性。其中，FANA、B、C、E、F、G、L和M可啟動DNA鏈間交聯(ICL)修復，MSH2、MSH3、MSH6、MLH1和MLH4可啟動MMR修復，XPC組、損傷特異性DNA結合蛋白(DDB)2和可卡因綜合征蛋白(CS)A可啟動核苷酸切除(NER)修復，Ku蛋白及MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復合物可分別啟動非同源末端連接(NHEJ)修復及同源重組(HR)修復，多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)可啟動DNA單鏈斷裂(SSB)修復。研究發(fā)現，EXO1敲除小鼠發(fā)生染色體斷裂及堿基錯配的概率升高，淋巴瘤易感性增加；EXO1null/null細胞的染色體不穩(wěn)定，對電離輻射的敏感性高〔13〕。在DNA損傷修復的過程中，RPA與DNA損傷反應蛋白激酶ATM及ATR結合并發(fā)生磷酸化，從而參與DNA修復過程。有證據表明EXO1參與RPA的招募，通過HR修復維持基因組穩(wěn)定性〔14〕。此外，PARP1合成的PAR不僅參與EXO1向DNA損傷位點的快速募集，也參與調節(jié)EXO1的外切酶活性〔15〕。同時，PARP1可與EXO1相互作用并激活EXO1的5'端剪切活性〔16〕。

4 EXO1與DNA末端剪切

在所有DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂(DSB)對細胞的危害作用最強，如不及時修復，可阻斷DNA復制、引起染色體缺失，進而導致細胞死亡或腫瘤轉化。DSBR過程包括相互競爭的兩種作用，一是Ku蛋白依賴的NHEJ途徑，另一種是MRN復合物依賴的HR途徑〔17〕。Ku70和Ku80異構體是構成NHEJ的重要成分，與雙鏈DNA末端緊密結合，從而阻礙EXO1介導的DNA末端剪切，并防止核酸酶發(fā)生過度酶切〔17〕。而MRE11和SAE2〔人羧基末端結合蛋白反應蛋白(CtIP)的同源基因〕可阻止Ku70/80參與DSBR，從而促進EXO1的剪切〔18〕。此外，CtIP可直接與EXO1相互作用從而抑制后者的外切酶活性〔19〕。

DNA末端剪切是HR途徑的重要步驟，主要通過兩種途徑進行，一種是RPA介導的DNA末端剪切途徑，另一種是由EXO1介導，通過激活BLM、MRN及RPA而發(fā)揮作用。Bloom綜合征解旋酶(BLM)可增加EXO1對DNA末端的親和力，MRN則負責招募EXO1并增強其作用〔20〕。研究發(fā)現，MRE11、RAD50或奈梅亨斷裂綜合征蛋白(NBS)1基因缺陷具有致死性，而EXO1基因缺陷雖然對小鼠的存活幾乎無影響〔13〕，但小鼠表現為嚴重的發(fā)育障礙、胚胎死亡及染色體不穩(wěn)定，在細胞表型上表現為DNA復制、DNA修復、檢測點信號及DDR方面的功能缺陷〔21〕。EXO1外切酶活性可被人RecQ解旋酶RECQL1、BLM及Werner綜合征解旋酶(WRN)所激活〔22,23〕。然而，DNA末端被EXO1剪切的程度可能受到WRN、RPA、Ku70/80和(或)CtIP的限制〔24,25〕。此外，EXO1還通過微同源序列介導的末端連接，參與DNA剪切〔26〕。

5 EXO1與減數分裂重組修復

研究發(fā)現，小鼠需要 EXO1的酶切活性完成減數分裂Ⅱ期。EXO1null/null小鼠與野生型小鼠雜交后出現生育障礙〔12〕。相同大小或體重的EXO1null/null雄性小鼠的睪丸小于野生型小鼠。由于減數分裂Ⅱ期進展障礙，EXO1null/null雄性小鼠的精子發(fā)生存在缺陷〔13〕，但EXO1在減數分裂中維持基因穩(wěn)定性的機制尚未明確。

6 EXO1與端粒維持

端粒位于染色體末端，通過端粒結合蛋白作用，防止DNA末端發(fā)生降解和DNA復制相關的損耗。端粒的末端攜帶t-loop結構〔27〕，通過與端粒特異性結合蛋白復合物shelterin如TFR1和TFR2、POT1、RAP1、TIN2、TPP1、MRE11、Ku70/80、BLM、WRN及RECQL4等緊密結合發(fā)揮作用〔28〕。缺乏功能性shelterin的細胞表現為染色體不穩(wěn)定、端端染色體融合及端?？s短。實驗表明，端粒功能障礙是導致細胞周期阻滯的重要機制，可干擾細胞分裂，從而影響腫瘤形成〔29〕。然而研究發(fā)現，端粒功能失調的小鼠，EXO1缺失有助于維持器官穩(wěn)定性并延長小鼠壽命，且不增加染色體不穩(wěn)定性及腫瘤形成，表明EXO1缺失可能在端粒功能失調中具有延長生存期的作用〔30〕。

7 EXO1與年齡及惡性腫瘤的關系

EXO1缺失可影響基因組穩(wěn)定性，并降低神經干細胞(NSCs)的增殖能力〔31〕，如EXO1null/nullNSCs表現出分化受損、嗅覺神經減少、微衛(wèi)星和基因不穩(wěn)定性增加等現象〔31〕，但EXO1并不直接與年齡增長或年齡相關疾病有關。

一些研究發(fā)現EXO1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與人類細胞中MSI及癌癥易感性相關〔32〕。EXO1蛋白在正常組織中多呈低表達，且不隨細胞周期及細胞增殖狀態(tài)的改變而變化〔33〕。但其表達呈組織特異性，如在小鼠模型中，EXO1蛋白在睪丸及脾臟中高表達，而在甲狀腺、淋巴結及骨髓組織中呈適度表達。在人類組織中，EXO1蛋白在甲狀腺、結腸及胎盤組織均有表達，但在睪丸中表達度最高〔11〕。EXO1蛋白在一些腫瘤細胞中呈過表達〔34〕，是乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃腸道腫瘤的易感基因〔35〕，且可能與腫瘤的化療耐藥有關〔36〕。

8 總結與展望

EXO1蛋白同時具有內切酶及外切酶活性，不僅參與DNA損傷細胞的周期調控，調節(jié)細胞的凋亡，還通過與多種蛋白相互作用，參與MMR、DSBR、DDR、DNA末端切除與減數分裂和有絲分裂的重組修復等多種損傷修復，從而維持DNA的完整性及基因組的穩(wěn)定性。EXO1基因缺陷與肺癌、乳腺癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤的易感性密切相關，可作為腫瘤標志物用于高危人群篩查。此外，EXO1蛋白可能參與惡性腫瘤的化療耐藥，因此有望作為藥物研發(fā)的靶點，提高耐藥患者的化療敏感性。但EXO1蛋白在端粒維持中的作用仍需深入探索，且EXO1蛋白在DNA損傷修復機制中的具體信號通路及在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用仍需進一步研究。