胞內(nèi)補體系統(tǒng)的研究進展①

許 晅 李 璋 馬群飛 柳春燕 邵太麗 袁平川 陳靠山（山東大學生命科學學院，青島 266237）

補體系統(tǒng)被認為是由血清、組織液和細胞膜表面的一組不耐熱的具有酶活性的球蛋白組成的生物效應系統(tǒng)，由復雜的酶促級聯(lián)反應最終形成攻膜復合體，實現(xiàn)對靶細胞的裂解和破壞以保護宿主機體。補體系統(tǒng)有3 條相互交叉的途徑：經(jīng)典途徑（classical pathway，CL）、替代途徑（alternative pathway，AP）以及凝集素途徑（mannose-bing lectin，MBL），主要在病原體感染、局部性組織損傷以及炎癥與過敏等方面起關鍵性免疫調(diào)節(jié)作用。其中，肝臟是機體補體的最主要來源，由此產(chǎn)生的補體被稱為系統(tǒng)補體，主要負責血清的補體免疫調(diào)節(jié)；局部感染或損傷條件下，機體組織細胞也會產(chǎn)生補體，稱為局部補體［1］。這兩類補體發(fā)揮黏附細胞、中和病毒、降解免疫復合物以及調(diào)節(jié)適應性免疫的作用，因此，補體也被視為連接固有免疫和適應性免疫的橋梁［2］。

近年細胞中補體及其功能的研究受到越來越多關注［3-4］。研究表明，細胞內(nèi)可能也存在由補體、補體受體、組織蛋白酶等組成的一個相對獨立的可調(diào)控細胞代謝與功能的胞內(nèi)生物效應系統(tǒng)，由于其存在與功能區(qū)別于由肝細胞、巨噬細胞等分泌的“胞外”補體系統(tǒng)，又被稱為胞內(nèi)補體系統(tǒng)（intracelluar complement system,ICS）［5］。胞內(nèi)補體在細胞中具有特定亞細胞定位區(qū)室，與域蛋白3（NLRP3）炎癥小體形成密切相關，因此，PETER GARRED 建議將其命名為complosome，即補體小體［6］。

1 胞內(nèi)補體的發(fā)現(xiàn)

C3 和C5 在“胞外”補體系統(tǒng)中處于關鍵地位，其產(chǎn)生的活性組分C3a 和C5a（也被稱為過敏毒素，anaphylatoxin）不僅能夠招募單核細胞、粒細胞、肥大細胞等免疫細胞到感染部位，還可產(chǎn)生增強平滑肌細胞收縮、舒張血管、誘導粒細胞與肥大細胞脫顆粒和促進細胞因子分泌等作用［7］。在細胞內(nèi)ICS中，C3 和C5 也處于類似的關鍵地位，但卻發(fā)揮全然不同的細胞生物學效應。尤其在人CD4+T免疫細胞中，胞內(nèi)C3 和C5 系統(tǒng)對該細胞的靜息態(tài)與激活態(tài)維持與轉(zhuǎn)變、營養(yǎng)代謝與增殖分化、凋亡調(diào)控等方面均具有重要作用［8］。

自2005 年起，研究者開始認識到源自T 細胞內(nèi)的補體對Th1 效應細胞分化以及IFN-γ 表達發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，尤其是C3a 和C3b 及其各自受體C3aR和CD46［9-13］。后來，LISZEWSKI 等［3］發(fā)現(xiàn)人CD4+T細胞受外源刺激時會在極短時間（5 min 內(nèi)）將胞內(nèi)的C3a 和C3b 分泌至細胞外并與細胞膜上各自的受體結(jié)合，進而誘導Th1 效應細胞分化。但胞內(nèi)C3 補體的快速響應現(xiàn)象并不能用蛋白從頭合成的時間線機制合理解釋。隨后研究表明，靜息狀態(tài)下，人CD4+T 細胞中會儲存C3、組織蛋白酶L（cathepsin L，CSTL）、C3a、C3b 以及C3aR 和CD46，這些組分共同構(gòu)成一個相對獨立的胞內(nèi)C3補體系統(tǒng)。其中，胞內(nèi)C3 可被CSTL 裂解產(chǎn)生活性組分C3a 和C3b。ARBORE 等［14］又在人CD4+T 細胞中發(fā)現(xiàn)了胞內(nèi)C5系統(tǒng)并證實其對細胞營養(yǎng)代謝、線粒體氧化磷酸化、NLRP3 炎癥小體裝配、IL-1β 自分泌以及IFN-γ 誘導等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

研究者在免疫細胞（單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、NK 細胞，粒細胞，T 細胞、B 細胞）和非免疫細胞（纖維母細胞、表皮細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、膠質(zhì)細胞）發(fā)現(xiàn)了多種胞內(nèi)補體，表明胞內(nèi)補體的存在具有普遍性［3，15-17］。但ICS 及其功能仍處于初步階段，研究者對此的認知也存在多種見解，有待進一步研究，這是由于胞內(nèi)補體的組成與功能因物種與細胞類型不同而存在差異。

2 ICS在免疫細胞中的作用

目前，研究者對人CD4+T 細胞內(nèi)的C3 補體系統(tǒng)和C5 補體系統(tǒng)的研究和認識更為充分。而小鼠CD4+T 細胞內(nèi)缺乏CD46，而其胞內(nèi)C3 被轉(zhuǎn)運至胞外后經(jīng)由C3轉(zhuǎn)化酶裂解為具有活性的組分［18-19］。

2.1 胞內(nèi)C3 補體系統(tǒng) 人CD4+T 細胞的胞內(nèi)C3依賴于淋巴細胞功能相關抗原1（lymphocyte func?tion associated antigen 1，LFA1）合成［20-21］。當該細胞處于靜息狀態(tài)時，胞內(nèi)C3 可被位于溶酶體的CSTL裂解為活性組分C3a 和C3b，并與各自受體C3aR和CD46暫存于溶酶體中。當細胞受TCR（+CD3）、協(xié)同刺激受體（CD28）、IL-12 等外源刺激后，胞內(nèi)的C3aR和CD46 首先被快速轉(zhuǎn)運至細胞膜，隨后，胞內(nèi)的C3a 和C3b 也從溶酶體轉(zhuǎn)移至胞外并與膜上各自受體結(jié)合，迅速激活CD4+T 細胞分化為Th1 效應細胞并誘導產(chǎn)生IFN-γ［3，9］。當外源刺激終止后，胞內(nèi)C3系統(tǒng)還可調(diào)整人CD4+T 細胞從表達IL-2 轉(zhuǎn)而表達IL-10，促使效應細胞從激活態(tài)向靜息態(tài)轉(zhuǎn)變［22-23］。

早期研究發(fā)現(xiàn)，缺失C3 或CD46 的T 細胞雖能正常分化為Th2 效應細胞，但不能分化為Th1 效應細胞，上述研究結(jié)果給出了一個合理解釋［24-25］。

2.2 胞內(nèi)C5 補體系統(tǒng) 人CD4+T 細胞內(nèi)有兩種C5 活性組分，即C5a 和C5a-desArg，以及兩種C5a 受體，即C5aR2（GPR77，C5L2）和C5aR1（CD88）。其中，C5aR1主要分布于質(zhì)膜，而C5aR2存在于細胞內(nèi)和質(zhì)膜［20］。研究證實組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）可裂解C5生成活性組分C5a，而組織蛋白酶G（cathepsin G，CTSG）則能夠酶解C5aR1 并使之失活［26］。靜息狀態(tài)下，人CD4+T 細胞內(nèi)儲存有較低含量的C5 及其活性組分C5a，而C5a 受體以C5aR2 為主。當CD4+T 細胞受到外界刺激后，胞內(nèi)C5a 含量增多，C5aR 受體也轉(zhuǎn)為以C5aR1 為主。胞內(nèi)的C5a與C5aR1 被轉(zhuǎn)運至細胞膜并相互結(jié)合，一方面可誘導線粒體產(chǎn)生ROS，另一方面也能促進NLRP3 炎癥小體裝配從而激活IL-1β 自分泌，最終誘導IFN-γ產(chǎn)生［20］。當刺激終止后，C5aR2 表達水平恢復并與C5aR1 形成二聚體，不僅可負調(diào)控由C5aR1 介導的上述胞內(nèi)信號途徑，還可通過抑制由C5aR1 介導的胞外ERK1/2 信號途徑，使T 細胞IFN-γ 表達下降，IL-10表達增加，促使細胞從激活態(tài)快速恢復至靜息態(tài)［27-31］。ARBORE 等［4］在C5缺陷患者中也發(fā)現(xiàn)了類似于C3缺陷患者的CD4+T細胞無法正常分化為Th1效應細胞的現(xiàn)象，證實了胞內(nèi)C5 系統(tǒng)對T 細胞活性與功能調(diào)節(jié)的重要性。

但HAGGADONE 等［32］在單核/巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)C5a 介導的信號途徑卻能夠抑制NLRP3 炎癥小體裝配。此外，研究還發(fā)現(xiàn)補體調(diào)節(jié)蛋白CR1（CD35）和CD59 以及補體C1q 可負調(diào)控T 細胞存活及其細胞因子分泌［33-35］。以上研究表明ICS 可能因細胞類型差異而發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用。

3 胞內(nèi)補體對細胞基本代謝的調(diào)控

ICS 也在細胞有氧糖酵解、線粒體氧化磷酸化途徑、細胞周期轉(zhuǎn)換、細胞凋亡等基本代謝方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

3.1 胞內(nèi)補體對細胞營養(yǎng)代謝和線粒體氧化磷酸化的影響 作為一種補體跨膜蛋白受體，CD46存在于所有有核細胞細胞膜，具有2 種胞質(zhì)末端，即CYT-1 和CYT-2［36-37］。當人CD4+T 細胞處于靜息狀態(tài)時，其細胞膜上的CD46 主要以CD46-CYT-2 形式存在。而細胞受刺激后會分泌C3b 與CD46 結(jié)合并上調(diào)CD46-CYT-1含量。隨后，胞質(zhì)末端的CYT-1被γ-分泌酶（γ-secretase）切割，入核后誘導多種營養(yǎng)代謝相關基因表達，如葡萄糖轉(zhuǎn)運體1（GLUT1，SLC2A1）與L 型氨基酸轉(zhuǎn)運體1（LAT1，SLC7A5），從而促進外源葡萄糖和氨基酸內(nèi)流；此外，CD46-CYT-1信號途徑也可調(diào)節(jié)受體調(diào)控蛋白（LAMTOR5，一種氨基酸感應調(diào)節(jié)復合物的組成亞基）表達。最終，通過上述兩條途徑實現(xiàn)mTORC1 在溶酶體膜上的駐留，進而調(diào)整細胞營養(yǎng)代謝水平，使胞內(nèi)糖酵解和線粒體氧化磷酸化處于高水平狀態(tài)以利于Th1細胞增殖分化和IFN-γ 表達［8，38-40］。當刺激信號終止時，T 細胞CD46-CYT-2 恢復至主導地位，并使細胞因子IL-10 上調(diào)，糖酵解水平恢復至常態(tài)，實現(xiàn)Th1效應細胞活性回縮［17］。說明胞內(nèi)補體及其受體動態(tài)變化影響細胞靜息態(tài)與激活態(tài)轉(zhuǎn)變。另外，ASGARI 等［41］在巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)C3aR 能夠誘導胞內(nèi)ATP 外流并激活TLR 介導的炎癥小體裝配，認為細胞內(nèi)存在“補體-代謝-炎癥小體”信號軸，且對免疫細胞效應活性調(diào)節(jié)起關鍵作用［14］。

3.2 胞內(nèi)補體對細胞周期與凋亡的影響 研究表明，C3a 和C5a 能夠通過激活NF-κB 和STAT-3 兩條信號途徑起始細胞周期基因轉(zhuǎn)錄從而使細胞進入G1 期；CR3 與CR4（均為iC3b 受體）促使細胞周期從G1期轉(zhuǎn)入S期；而C5aR1能夠通過促進DNA合成以及細胞分裂進而觸發(fā)細胞向G2/M期轉(zhuǎn)變［42-43］。

LISZEWSKI 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)CSTL 酶解產(chǎn)生的胞內(nèi)C3a 對人CD4+T 細胞存活至關重要。缺失C3a 會導致該細胞在8～12 h 凋亡，同時，其對C3 缺失的T 細胞研究發(fā)現(xiàn)，該類T 細胞無法正常分化為Th1效應細胞因而無法產(chǎn)生IFN-γ，但仍能產(chǎn)生足夠胞內(nèi)C3a 使T 細胞正常存活。另外，當間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）處于低氧條件時會下調(diào)胞內(nèi)C3 含量以延長細胞存活時間［44］。而CD46、C5aR1 以及亞溶解型攻膜復合體（sublytic MAC）等可通過激活Bcl-2表達抑制細胞凋亡［16，45-46］。MARTIN 等［47］發(fā)現(xiàn)凋亡細胞內(nèi)的補體調(diào)節(jié)因子FH能夠調(diào)節(jié)CTSL對內(nèi)源性C3酶解活性以產(chǎn)生活性組分iC3b 從而增強凋亡細胞調(diào)理作用。此外，神經(jīng)元細胞受低氧損傷時會通過胞內(nèi)C1q和位于線粒體的受體gC1qR 結(jié)合促使線粒體產(chǎn)生更多ROS，最終誘導細胞凋亡［48］。

4 胞內(nèi)補體與受補體調(diào)節(jié)的胞內(nèi)病原體的作用

胞內(nèi)補體研究讓研究者對由補體侵染細胞的胞內(nèi)病原體有了更為深刻的認識。當不同胞內(nèi)病原體“劫持”補體并侵染細胞時，胞內(nèi)補體會觸發(fā)多種途徑產(chǎn)生或有利于病原體，或有利于宿主細胞生物學效應發(fā)揮。這種對抗與協(xié)助的雙重效應可能與胞內(nèi)補體在細胞基本代謝中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用有關。

CHEN 等［49］發(fā)現(xiàn)人宮頸癌C33a 細胞和SiHa 細胞能夠通過胞內(nèi)qC1qR 激活線粒體產(chǎn)生過量ROS誘導細胞凋亡以阻止人乳突病毒HPV-16侵染。部分胞內(nèi)病原體與胞內(nèi)C3識別后，可直接介導靶向線粒體抗病毒信號蛋白MAVS，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1 入核，使細胞產(chǎn)生大量促炎細胞因子（IL-6、IL-1β、IFN-β）［50］。當李斯特菌侵染巨噬細胞時，該細胞膜上的VSIG4（一種位于巨噬細胞和樹突狀細胞上的跨膜蛋白）可識別C3b并與之相互作用，通過誘導巨噬細胞凋亡小體形成以清除李斯特菌［51］。C3 可誘導NADPH-oxidase 信號途徑增強中性粒細胞對類鼻疽伯克氏菌（B.seudomallei）的殺傷力，也能通過激活NF-κB 信號途徑增強抗腺病毒反應［52-53］。研究發(fā)現(xiàn)，通過阻斷補體受體CR1 和CR2可起抑制丙型肝炎病毒HCV 結(jié)合B 細胞的作用［54］。另外，F(xiàn)H 在牛結(jié)核分枝桿菌BT 侵染巨噬細胞的早期階段可與牛結(jié)核分枝桿菌結(jié)合并誘導細胞表達大量促炎細胞因子抑制該菌增殖［55］。SHAH 等［56］發(fā)現(xiàn)抑制人腎上皮細胞293T 胞內(nèi)CTSB 和CTSL 活性可阻止SARS 病毒和埃博拉病毒侵染。

相反地，丙型肝炎病毒HCV 在侵入T 細胞時，其核心蛋白與qC1qR 結(jié)合抑制ERK/MEK 信號通路，使IL-2表達降低，抑制T細胞增殖［57］。水皰型口炎病毒VSV 可利用線粒體上的qC1qR 以不依賴PI3K的方式下調(diào)RIG-Ⅰ活性，從而促進病毒胞內(nèi)復制［58］。C 型慢性肝炎病毒可識別C3d 并在CD19 和CD81 共同作用下與B 細胞結(jié)合，通過改變B 細胞受體類型抑制B 細胞活化、增殖及抗病毒能力［59］?？死撞暇勺R別C3 并依賴于細胞膜上的玻連蛋白（vitronectin）侵染非吞噬細胞和非免疫細胞［60］。人類免疫缺陷病毒HIV 能夠利用C5aR1-CCR5 二聚體侵染宿主細胞［61］。

5 總結(jié)與展望

綜上，細胞內(nèi)存在由補體、補體受體以及組織蛋白酶共同構(gòu)成的ICS，其存在與功能均相對獨立于“胞外”補體系統(tǒng)。ICS 不僅起維持細胞存活作用，還影響細胞基本代謝活動。尤其在免疫細胞中，胞內(nèi)“補體-代謝-炎癥小體”信號軸調(diào)節(jié)細胞靜息態(tài)和激活態(tài)維持與轉(zhuǎn)變，使細胞在響應外源刺激時能夠快速調(diào)整細胞代謝水平，并影響細胞增殖分化和細胞因子表達與分泌［16］。近來研究者也發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)補體與“胞外”補體在一定條件下存在交流現(xiàn)象。Ca2+作用下，C3可依賴脂蛋白受體相關蛋白/α2-巨球蛋白受體（lipoprotein-receptor-related protein/α2-macroglobulin receptor）從細胞外轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)［62］。ELVINGTON 等［63］發(fā)現(xiàn)C3（H2O）通過未知受體可從細胞外迅速轉(zhuǎn)入細胞內(nèi)。但GHANNAM等［24］發(fā)現(xiàn)外源C3 對記憶B 細胞分化的調(diào)控作用是胞內(nèi)C3無法代替的。

與“胞外”補體系統(tǒng)相比，ICS 可能更為復雜，原因在于胞內(nèi)補體組成與功能因細胞類別不同而有所差異。研究表明，不同類別細胞存在多種組織蛋白酶，可將胞內(nèi)補體裂解成不同活性組分；而同一種細胞也存在有無外源刺激等因素引起的胞內(nèi)補體組成與活性變化。如人CD4+T 細胞的胞內(nèi)C3 活化依賴于CTSL，而人上皮細胞的胞內(nèi)C3 活化不依賴于CTSL［17］。胞內(nèi)C3 可被酶解為C3a、C3b、iC3b、C3f、C3c 以及C3dg 等不同活性組分，這些組分在細胞內(nèi)定位也不同。其中，C3a 主要定位于溶酶體，而iC3b/C3dg 主要定位于順面高爾基體［64］。此外，CTSD 能夠?qū)5 酶解為C5a，而CTSG 能夠降解C5aR1［26］。

人類存在多種因補體缺失、功能障礙或過度活化引起的免疫性疾?。?，65］，如幼年特發(fā)性關節(jié)炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、年齡相關性黃斑變性等。其中，JIA是一種因T細胞內(nèi)C3a 高表達引起的自身免疫性疾病，過量C3a 與C3aR 結(jié)合不僅活化了蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），還會增強mTOR 信號通路，導致T 細胞分泌大量IFN-γ、腫瘤壞死因子（TNF）等促炎因子［66-68］。而LISZEWSK等［3］發(fā)現(xiàn)CSTL抑制劑可降低此類患者T細胞內(nèi)過量的C3a，從而抑制Th1效應細胞過度活化并使IFN-γ 等促炎因子表達恢復正常。SAMATAD等［20］發(fā)現(xiàn)通過抑制CTSL 和CTSB 活性能夠使胞內(nèi)補體過度激活導致的腸道組織炎癥損傷得到有效緩解。而胞內(nèi)補體的發(fā)現(xiàn)不僅為補體研究打開了新局面，也讓研究者對多種受補體調(diào)節(jié)的胞內(nèi)病原體和因補體功能紊亂引起的免疫性疾病有了更深入的認識，更為研究與開發(fā)治療相關免疫疾病藥物提供了新的思路和方法。