謝 輝 ， 劉玉梅 ， 張 昕 ， 孫瑩瑩 ， 常趙陽 ， 張自強(qiáng)

(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院 ， 河南 洛陽 471023)

兔葡萄球菌病是家兔養(yǎng)殖中的常見疾病，由金黃色葡萄球菌感染引起。該病在一年四季均可發(fā)生，尤其在溫暖潮濕的季節(jié)多發(fā)[1]。當(dāng)家兔被金黃色葡萄球菌感染時，常見癥狀為家兔的乳房炎、腳皮炎和皮下膿腫[2-4]等，嚴(yán)重時可導(dǎo)致全身性感染，并迅速死亡[5]。哺乳母兔乳房感染金黃色葡萄球菌時，仔兔吸食乳汁會引發(fā)初生仔兔腸炎和仔兔黃尿病[6-7]，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)通過對某兔場送來的死亡哺乳母兔進(jìn)行病理剖檢，初步判斷為金黃色葡萄球菌感染。為了進(jìn)一步確定該病病原，無菌采集病兔的皮下膿腫、肝臟、脾臟等組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。通過分離菌的菌落形態(tài)、染色鏡檢、16S rDNA基因序列分析，最終確定致病菌為金黃色葡萄球菌，同時對分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以期對兔葡萄球菌病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 患病母兔來自洛陽某兔場，發(fā)病兔主要表現(xiàn)為拉水樣稀糞、消瘦、沉郁。病兔送到實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行病理剖檢，并采集樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離純化和鑒定。

1.2 試劑儀器 普通瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，均購自杭州百思有限公司；紅霉素、麥迪霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、丁胺卡那、頭孢氨芐、頭孢呋辛、呋喃唑酮、羧芐西林、哌拉西林、諾氟沙星、多黏菌素B、多西環(huán)素、慶大霉素和新霉素共16種抗生素藥敏片，均購自比克曼生物公司；PremixTaqTM(ExTaqTMVersion 2.0 plus dye),購自大連TaKaRa公司；溴化乙錠溶液，購自蘇州天可貿(mào)易有限公司；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、DL2 000 Marker、Proteinase K，均購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌采集病兔的肺臟、肝臟、脾臟等，劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的生長情況，挑取典型單個菌落在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢測 將純化后的菌液涂片、固定。之后用革蘭染色試劑染色，在光學(xué)顯微鏡下對細(xì)菌的形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的金黃色葡萄球菌16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)引物，由安徽通用生物公司合成，預(yù)擴(kuò)增的片段長度約為480 bp。引物信息見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物信息

1.6 16S rDNA序列擴(kuò)增 按照細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書的步驟提取分離菌的DNA。以分離菌的基因組為模板，利用設(shè)計(jì)的特異性引物在PCR儀內(nèi)進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃變性 4 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將特異性擴(kuò)增產(chǎn)物送至通用生物實(shí)驗(yàn)公司測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析。

1.7 藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片法進(jìn)行操作和結(jié)果判斷(2005年修訂版)。選取16種抗生素紙片對分離純化的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。取200 μL菌液涂布于普通瓊脂平板，均勻地在平板上貼上藥敏片。37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑，測量3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 剖檢變化 對病兔剖檢時發(fā)現(xiàn)，病兔腹腔有大量淡黃色積液，皮下有白色腫塊(圖1A)；肺臟腫大、出血(圖1B)；肝臟出血、腫大，表面附著有白色膿性物質(zhì)(圖1C)；脾臟腫大，呈藍(lán)紫色(圖1D)。

圖1 病兔病理剖檢

2.2 分離菌的形態(tài)觀察 從患病母兔的皮下膿性物質(zhì)和肺臟等組織中分離到菌落形態(tài)一致的菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成中等大小、圓形濕潤的微黃色菌落。革蘭染色后可在光鏡下觀察到藍(lán)紫色、呈單個、雙或串狀排列的革蘭陽性球菌(圖2)。

圖2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

2.3 PCR鑒定 利用特異性引物分別對從肺臟、肝臟、脾臟中分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離菌16S rDNA基因產(chǎn)物約480 bp，長度與預(yù)期相符(圖3)。由PCR鑒定結(jié)果證實(shí)分離菌為金黃色葡萄球菌。

圖3 分離菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

2.4 分離菌基因序列分析 將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)BLAST進(jìn)行分析，分析結(jié)果顯示分離菌株和金黃色葡萄球菌的同源性最高，采用MEGA 7．0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，分離菌與金黃色葡萄球菌(登錄號為MN843752.1)的同源性為97%(圖4)。

圖4 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗(yàn) 分離菌對不同藥物的敏感性結(jié)果見表2。由表2可知，分離菌對羧芐西林、哌拉西林、諾氟沙星、多黏菌素B、多西環(huán)素、慶大霉素、新霉素7種藥物敏感，對紅霉素、麥迪霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、丁胺卡那、頭孢氨芐、頭孢呋辛、呋喃唑酮具有耐藥性。

表2 不同藥物對金黃色葡萄球菌菌株的抑菌效果

3 討論

兔葡萄球菌病已成為家兔養(yǎng)殖中的常見疾病之一，因其感染部位和菌株的毒力大小不同呈現(xiàn)不同的病理變化。在以往的研究中，被金黃色葡萄球菌感染的成年家兔多以皮下和組織器官膿腫為主要特征[4,8]。趙蕾等[9]研究顯示，被金黃色葡萄球菌感染的家兔除了形成膿腫，還具有拉稀糞、流鼻涕、肺臟和氣管出血等癥狀。王華等[10]給健康的家兔接種金黃色葡萄球菌，可導(dǎo)致家兔出現(xiàn)脾臟腫大、肝臟出血腫大、皮膚潰瘍等病理特征。本試驗(yàn)病兔的臨床癥狀和剖檢結(jié)果與上述研究相似，但同時也出現(xiàn)了病兔腹腔積液、腹部被毛潮濕等癥狀。因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌感染家兔所引起的臨床癥狀和病理特征既具有廣泛性，又具有復(fù)雜性，致使當(dāng)金黃色葡萄球菌單獨(dú)感染或和其他致病菌混合感染家兔時，僅以臨床觀察和病理剖檢難以準(zhǔn)確判斷致病原，因此采用分子生物學(xué)手段對分離菌16S rDNA序列進(jìn)行鑒定是很有必要的。

針對金黃色葡萄球菌感染，臨床上主要依賴于抗菌藥物進(jìn)行治療。但隨著抗生素的長期大量使用，導(dǎo)致了金黃色葡萄球菌的耐藥性不斷增加，給本病的防治造成了極大的困難?？咕幬锸褂迷斐傻倪x擇性壓力是細(xì)菌耐藥的關(guān)鍵因素[11],耐藥性金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的青霉素酶，從而使抗菌藥物失效[12-13]。隨著耐藥基因在金黃色葡萄球菌中的傳播，致使兔源性金黃色葡萄球菌多重耐藥性趨勢上升。根據(jù)鄧釗賓等[14]的報道，從四川地區(qū)部分規(guī)?；脠龇蛛x出的41株金黃色葡萄球菌株對β-酰胺類、大環(huán)內(nèi)脂類、四環(huán)素類、氨基糖苷類藥物的耐藥率較高，其中29株具有多重耐藥性。侯景等[15]對取自四川某兔場的1株兔肺源金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離菌株具有多重耐藥性，僅對頭孢噻吩、頭孢拉定、頭孢哌酮、哌拉西林4種藥物敏感，對其他測試藥物均耐藥。金黃色葡萄球菌可因動物源性和地域的不同而使耐藥性存在差異，如張國權(quán)等[16]的研究顯示從獺兔中分離到的金黃色葡萄球菌菌株對阿米卡星、阿莫西林、頭孢曲松和頭孢哌酮敏感，對鏈霉素、慶大霉素、多黏菌素B等7種藥物耐藥。而在本試驗(yàn)中，藥敏試驗(yàn)結(jié)果與張國權(quán)等的結(jié)果具有一定差異，這可能是由于不同地區(qū)抗生素的使用情況不同導(dǎo)致，但具體原因仍需進(jìn)一步探究。細(xì)菌對某種抗生素耐藥率的變化，不僅與該種抗生素的用量有關(guān)，和其他種藥物的使用也具有一定的相關(guān)性[17]。因此，為了防止肉兔生產(chǎn)中抗生素的濫用，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，有必要對病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和耐藥性檢測。在選擇藥物時，可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感藥物進(jìn)行治療，以期取得最好的治療效果。在用藥的同時，也要對兔舍和籠具進(jìn)行嚴(yán)格消毒，防止病原在兔群中的傳播。