高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定粳米中D(-)-抗壞血酸和L(+)-抗壞血酸的方法優(yōu)化

曾雪儀

（肇慶市食品檢驗(yàn)所，廣東肇慶 526000）

抗壞血酸是人體必不可缺的微量營(yíng)養(yǎng)元素之一，它不僅廣泛參加機(jī)體的多項(xiàng)生命活動(dòng)，還有助于增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抵御心血管疾病和動(dòng)脈硬化[1-2]。抗壞血酸主要以D(-)-抗壞血酸和L(+)-抗壞血酸兩種形式存在。L(+)-抗壞血酸，又稱為維生素C，對(duì)人體具有生命活性；D(-)-抗壞血酸，是L(+)-抗壞血酸的光學(xué)異構(gòu)體，對(duì)人體基本沒有生物活性，且攝入過多會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞抵抗病毒的能力下降，甚至出現(xiàn)腹瀉、尿酸結(jié)石、皮疹等病癥[3]。人體無法自動(dòng)合成抗壞血酸，只能從食物中獲取，因此研究定量檢測(cè)食品中的抗壞血酸，對(duì)于食品安全和人體健康意義重大[4]。

目前檢測(cè)抗壞血酸的方法有2,6-二氯靛酚滴定法[5]、電化學(xué)法[6]、原子吸收光譜法[7]及高效液相色譜法[8]等。相比于其他方法，高效液相色譜法具有高靈敏度、高穩(wěn)定性、高分離效率等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于抗壞血酸的檢測(cè)?，F(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測(cè)定》（GB 5009.86—2016）[9]提供了高效液相色譜法測(cè)定食品中抗壞血酸的方法，但該方法用于檢測(cè)谷物中的抗壞血酸回收效率低，且使用表面活性劑作為流動(dòng)相，致使基線不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)峰漂移現(xiàn)象。因此，本研究選擇無表面活性劑且配制方式更為簡(jiǎn)單的0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 作為流動(dòng)相，采用冰浴且二次超聲的方式來提高提取效率，為高效地測(cè)定谷物中抗壞血酸含量提供準(zhǔn)確、可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L(+)- 抗壞血酸、D(-)- 抗壞血酸（99.9%，Stanford）；偏磷酸、L-半胱氨酸、磷酸三鈉、磷酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀、十六烷基三甲基溴化銨（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；粳米（市售）；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II），配備二極管陣列檢測(cè)器（Agilent G7115A）；pH 計(jì)（PHSJ-4F，雷磁）；臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗機(jī)（KQ-300DA，昆山舒美超聲儀器有限公司）；超純水機(jī)（comfort II，德國(guó)賽多利斯）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取1.5 g 粳米樣品于50 mL 離心管中，加入25 mL 20 g·L-1的偏磷酸，搖勻，浸泡30 min，冰浴超聲15 min，于8 000 r·min-1離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 棕色容量瓶，用25 mL 20 g·L-1的偏磷酸重復(fù)提取1 遍并轉(zhuǎn)移至容量瓶，最終用20 g·L-1的偏磷酸定容至50 mL。吸取上述溶液約2 mL 過0.45 μm 的水相濾膜，上機(jī)檢測(cè)抗壞血酸的兩種異構(gòu)體含量。移取定容后的上清液20 mL，加入10 mL 濃度為40 g·L-1的L-半胱氨酸溶液，先用濃度為100 g·L-1的磷酸三鈉把pH 值調(diào)至7.0～7.2，再用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.5～2.8，最后用偏磷酸定容至50 mL 刻度線，混合均勻后，過0.45 μm 的水相濾膜，上機(jī)，測(cè)得粳米樣品中包括脫氫型的L（+）-抗壞血酸的總量（整個(gè)實(shí)驗(yàn)在避光條件下進(jìn)行）。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取L（+）-抗壞血酸和D（-）-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，用20 g·L-1的偏磷酸定容至10 mL，得到1.000 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用偏磷酸稀釋到特定的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：月旭AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：0.1%磷酸∶甲醇=98∶2；流速：0.7 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方式的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

抗壞血酸具有較強(qiáng)的還原性，容易受到光照和溫度的影響，且在中性和堿性條件下穩(wěn)定性差，但在酸性環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了0.1 mol·L-1草酸、0.1%鹽酸、0.1 mol·L-1磷酸和20 g·L-1的偏磷酸作為提取溶劑，使用粳米樣品，分別做添加回收率實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，相比于其他提取溶劑，用20 g·L-1的偏磷酸作為提取溶劑具有較高的回收率。因此，選取20 g·L-1的偏磷酸作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)回收率的影響圖

2.1.2 提取方式的選擇

為研究不同提取方式對(duì)粳米樣品提取效率的影響，在優(yōu)化提取溶劑的條件下，研究了不同提取條件（超聲5 min、超聲15 min、超聲25 min、冰浴超聲15 min 和浸泡30 min+冰浴超聲15 min）對(duì)提取效率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，超聲5 min ＜超聲25 min ＜超聲15 min ＜冰浴超聲15 min ＜浸泡30 min+冰浴超聲15 min，表明先用20 g·L-1的偏磷酸浸泡30 min 使偏磷酸先充分滲透粳米樣品，以便于更好地提取抗壞血酸，且冰浴條件有穩(wěn)定抗壞血酸的作用。因此，選擇先用20 g·L-1的偏磷酸浸泡30 min，再冰浴超聲15 min 的提取方式，得到良好的提取效率。

圖2 不同提取方式對(duì)反應(yīng)的影響圖

2.1.3 提取次數(shù)的選擇

在優(yōu)化條件后，分別對(duì)同一批次粳米進(jìn)行了3次提取并測(cè)定抗壞血酸的含量。由圖3知，2 次提取高于1 次提取，但2 次與3 次提取結(jié)果相差不大，因此本實(shí)驗(yàn)選擇2 次提取的方式。

圖3 提取次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響圖

2.2 流動(dòng)相的選擇

現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用的流動(dòng)相含有十六烷基三甲基溴化銨，而十六烷基三甲基溴化銨是一種表面活性劑，易產(chǎn)生氣泡，致使基線不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)峰漂移現(xiàn)象，對(duì)被分析物的定性和定量帶來影響，且長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)降低色譜柱的性能[10]。本實(shí)驗(yàn)選用無表面活性劑且配制方式更簡(jiǎn)單的0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 作為流動(dòng)相，得到良好的分離效果（圖4），同時(shí)實(shí)現(xiàn)基線和保留時(shí)間穩(wěn)定。

圖4 L（+）-抗壞血酸、D（-）-抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3 線性方程、方法檢出限和定量限

配制系列濃度為0.5 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、25.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，在最優(yōu)條件下，上機(jī)采集信號(hào)。以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）作圖。結(jié)果顯示，在0.5～50.0 μg·mL-1，Y與X呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均為0.999 96。L（+）-抗壞血酸的線性方程為Y=93.2X+1.42，D（-）-抗壞血酸的線性方程為Y=98.9X+1.06。

與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB 5009.86—2016）相比（表1），本實(shí)驗(yàn)方法具有更低的檢出限和定量限。

表1 線性范圍、檢出限、定量限

2.4 回收率和精密度

采用在陰性粳米樣品中加標(biāo)的方法來測(cè)定回收率和精密度。取同一批次的陰性粳米樣品6 份進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加入混合標(biāo)準(zhǔn)液，使抗壞血酸異構(gòu)體的上機(jī)最終濃度分別為5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1，每個(gè)加標(biāo)濃度做3 個(gè)平行，取平均值。結(jié)果如表2所示，L（+）-抗壞血酸的回收率為96.0%～99.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%～1.00%；D（-）-抗壞血酸的回收率為98.8%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68%～1.21%。

表2 L（+）-抗壞血酸、D（-）-抗壞血酸的回收率及精密度

2.5 本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果比較

選擇同一批陰性粳米樣品取6 份樣品，各準(zhǔn)確稱取1.5 g，加入L（+）-抗壞血酸和D（-）-抗壞血酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，使L（+）-抗壞血酸和D（-）-抗壞血酸上機(jī)的最終濃度均為10 μg·mL-1，分別按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.86—2016 和本方法進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)試，平行3 次。由表3看出，兩種方法都能滿足檢測(cè)粳米中抗壞血酸的要求，而本方法采用先浸泡后兩次提取的方式，對(duì)粳米中的抗壞血酸具有更高的提取效率；同時(shí)選取無表面活性劑的流動(dòng)相，使檢測(cè)結(jié)果精密度更高，定量更為準(zhǔn)確。

表3 本方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比

3 結(jié)論

本研究建立了一種利用高效液相色譜高回收率、快速靈敏地檢測(cè)粳米中D(-)-抗壞血酸、L(+)-抗壞血酸和抗壞血酸總量的方法，基于冰浴且二次超聲的提取方式，采用0.1%磷酸∶甲醇=98∶2 為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)綠色、穩(wěn)定地同步檢測(cè)粳米抗壞血酸。