花椒抑制神經(jīng)性疼痛的作用機制探討

趙 忠 葉河楊 申小年

（安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽 蕪湖 241000）

0 引言

神經(jīng)性病理性疼痛（Neuropathic Pain，NP）是一種常見的由體感神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的慢性頑固性疼痛，導致患者出現(xiàn)睡眠障礙甚至抑郁，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。最近基于聚類分析研究表明，大多數(shù)神經(jīng)性疼痛患者可分為三種感覺表型之一：感覺喪失、機械痛覺過敏和熱痛覺過敏[2]。傷害性疼痛涉及在不損害神經(jīng)系統(tǒng)的情況下激活傷害感受器，而神經(jīng)性疼痛與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的改變有關(guān)。慢性疼痛本身以及從急性疼痛到慢性疼痛的轉(zhuǎn)變可能是由表觀遺傳控制的[3]。感覺表型與神經(jīng)性疼痛狀況對幸福感、日常功能和生活質(zhì)量的影響有關(guān)，但與疼痛強度的相關(guān)性較小。NP 即直接由影響體感系統(tǒng)的病變或疾病引起的疼痛，是一種常見的臨床問題，通常表現(xiàn)為持續(xù)疼痛（灼燒、擠壓）或陣發(fā)性疼痛（電擊樣感覺、刺痛）、誘發(fā)（觸誘發(fā)、壓力誘發(fā)、冷誘發(fā)）或麻木和感覺異常[4]。

花椒因其獨特的香氣和味道而在中國是一種非常珍貴的香料[5]。不同的成分引起的芳香感覺是不同的，這歸因于與瞬時受體電位通道蛋白V1(TRPV1)、瞬時受體電位通道蛋白A1(TRPA1)的相互作用機制不同[6]?；ń匪纳飰A類成分主要有茵芋堿（Skimmianine）、青椒堿（Schinifoline）、香草木寧和帕洛平等。羥基α 山椒素（Hydroxy-α-sanshool，HAS）是不飽和脂肪酸酰胺從花椒中提取出來，具有降血脂、降血糖、抗炎、神經(jīng)營養(yǎng)等作用[7]。HAS 通過降低AD 小鼠海馬Cyt-c、Bax 和Caspase 3 的mRNA 和蛋白表達，增加Bcl-2 的表達，顯著抑制神經(jīng)元凋亡。因而花椒及其所含生物成分，在NP 疾病的治療中有潛力，但其作用機理仍然不清楚。基于網(wǎng)絡藥理學的方法，本研究的重點是調(diào)控效應的機理，闡明花椒在分子水平上對神經(jīng)性疼痛特異性靶點和分子信號通路的作用，并設計新的藥物開發(fā)及臨床應用。

1 材料和方法

1.1 藥物和疾病相關(guān)效應的目標獲取

利用數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索了花椒的化學成分信息。在UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uniprot/）中獲得人類基因靶點。

為了獲得NP 相關(guān)的靶基因，將搜索詞“神經(jīng)病理性疼痛”輸入GeneCard（http: // www.genecards.org）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://www.omim.org）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org）和TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果被合并，刪除重復的目標器以獲取所有的目標的靶點。

1.2 獲取藥物靶點基因和疾病基因交集圖

利用Venn2.1 軟件，將篩選出的花椒的活性成分對應的靶點與NP 靶點對應的疾病靶點進行交叉，并通過Venn 圖獲得共同的靶點。將預測目標導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）以進行進一步的預測。

1.3 藥物活性成分的構(gòu)建與疾病

使用Cytoscape3.8.0 軟件生成了活性組件與目標之間的相互作用以及靶標之間的相互作用的網(wǎng)絡圖。用網(wǎng)絡將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡導入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物—化合物—靶點”網(wǎng)絡圖進行可視化分析。

1.4 核心基因篩選

PPI（Protein-Protein Interaction）是指兩個或兩個以上的蛋白質(zhì)分子通過非共價鍵形成蛋白質(zhì)復合體（Protein complex）的過程。STRING 數(shù)據(jù)庫收集了一個大量的蛋白質(zhì)相互作用，并含有一個數(shù)據(jù)置信范圍低置信值：＜0.4；最低置信度：0.15；中度置信度：0.4；高置信：0.7；最高置信度：0.9。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

各種生物信息分析和可視化結(jié)果可以通過軟件R 項目來實現(xiàn)。首先，獲得核心靶點的Entrez 基因ID 通過RGUI 和組織。然后是GO 函數(shù)富集（分子功能，MF；生物過程，BP；細胞組分，CC）和KEGG 通路豐富的RGUI，劑量和集群分析器。再設置pvalue ≤0.05，分析的結(jié)果是選擇了前8 個條目的富集和以條形圖的形式顯示。

2 結(jié)果

2.1 獲取藥物靶點基因和疾病基因交集圖

從數(shù)據(jù)庫中共鑒定出101 個化合物相關(guān)靶點（注：OB≥0）和藥用類（DL≥0）。共獲得1 593 個神經(jīng)病理性疼痛靶基因和花椒336 個成分靶點的112 疾病相關(guān)基因。圖1、圖2 所示。

圖1 神經(jīng)病理性疼痛疾病基因交集Venn 圖

圖2 花椒成分靶點與神經(jīng)性疼痛疾病基因交集的Venn 圖

2.2 花椒活性成分基因靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

為了明確中藥、活性成分和花椒的潛在靶點之間的關(guān)系，用網(wǎng)絡將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡導入Cytoscape3.8.0 軟件，構(gòu)建“藥物化合物—靶點”網(wǎng)絡圖進行可視化分析，如圖3 所示。

圖3 花椒藥物分子與神經(jīng)性疼痛疾病基因相關(guān)性交接圖

2.3 PPI 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡和核心蛋白網(wǎng)絡

通過蛋白互作網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)NP 的主要靶點為SRC、HSP90AA1、JUN、MAPK3、RELA、AKT1 和ESR1。GO項目數(shù)為2009 項（P＜0.05），其中BP∶1 745 項，CC∶87 項，MF∶177 項。MF 與轉(zhuǎn)錄因子以及一種特異性蛋白相互作用，并表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，如圖4 所示。

圖4 蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡；潛在治療靶點的核心基因

2.4 GO 和KEGG 富集

為了通過調(diào)節(jié)特定途徑來研究藥物治療中靶點的生物學效應。根據(jù)富集程度篩選前30 繪制柱狀圖。同樣，選擇（P＜0.05）為聚類分析的重要路徑，根據(jù)富集程度篩選前30 繪制柱狀圖和氣泡圖。

GO 分析顯示，發(fā)現(xiàn)了大部分潛在的靶點在BP，其中包括：藥物反應、循環(huán)系統(tǒng)中的血管突起、調(diào)節(jié)管徑調(diào)節(jié)血管直徑、管徑調(diào)節(jié)、對脂多糖、對細菌來源分子的反應、血管直徑負調(diào)節(jié)、多細胞有機過程、血管縮小。圖5 是GO 富集分析的前30 十個主要影響通路。

KEGG 富集分析顯示，影響了171 條通路（P＜0.05）。對神經(jīng)病理性疼痛作用顯著的有5 個富集通路，包括：IL-17 信號通路、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路、ErbB（表皮生長因子受體）信號通路、cGMP-PKG 信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸。

IL-17 信號通路： 上調(diào) Casp、NF-κB、AP-1、Hsp90、IKKα、IKKβ、IκBα、MAPKs、ERK、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL10、CCL2、COX2、MMP1、MMP3、MMP9、IL-1β、IFN-γ；

MAPK 信號通路：上調(diào)GF、RTK、PKA、PKC、NFκB、Rafl、EKR、E1K-1、c-fos、AP1、CASP、AKT、AP1、HSP27；

ErbB 信號通路：上調(diào)PKC、Src、ErbB-3、Jun、Raf、ERK、Elk、PKB/Akt、GSK-3、E1K、PKB/AKt、GSK-3；

cGMP-PKG 信號通路：上調(diào)GPCR、βAR、Akt、RhoA、Raf-1、ERK；

含血清素的神經(jīng)突觸：上調(diào)SEART、MAO-A、SERT、PKC、ERK、Cox、PKA、PKC、Casp3、ERK、Raf。

3 討論

病理性疼痛包括炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛，這是神經(jīng)元可塑性變化的表現(xiàn)過程。主要關(guān)注疼痛管理藥物在臨床應用中的有效性和安全性[8]。由于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病，NP 發(fā)展成如此復雜的疾病，其發(fā)病的全部機制尚不清楚。神經(jīng)免疫系統(tǒng)的激活有助于神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛的誘導和持續(xù)存在。TNF-α/IL-1β介導的NF-κB 活性的激活釋放了多種炎癥介質(zhì)，這可能會導致疼痛加重[9]。外周性和中樞敏感性是疼痛產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)，其中細胞內(nèi)信號通路的激活在其潛在機制中起著關(guān)鍵作用。外周傷害性感受信號通過傳入神經(jīng)纖維導入脊髓背角，導致興奮性氨基酸和應激蛋白的上調(diào)。它導致傷害性神經(jīng)元持續(xù)去極化，并有大量的鈣離子流入。一般來說，MAPK 信號通路涉及多種改變和改變的細胞信號轉(zhuǎn)導通路。MAPK 是真核細胞中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它不僅參與炎癥和細胞凋亡，而且在介導神經(jīng)可塑性和神經(jīng)功能方面也至關(guān)重要。這是一個促進周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)痛覺過敏形成的過程，這有助于疼痛感覺[10]。MAPK 級聯(lián)包括ERK、JNK/SAPK、p38MAPK 和ERK5。這種平行信號通路與疼痛的形成、維持和增強顯著相關(guān)。p38MAPK 與炎癥密切相關(guān)，是中樞膠質(zhì)細胞中產(chǎn)生促炎因子的重要途徑，也是干預疼痛的關(guān)鍵靶點。

4 結(jié)語

花椒是一種常見的中草藥，具有化學復雜性和生物功能多樣性的特點，筆者采用網(wǎng)絡藥理學的生物信息學方法來闡明其生物活性成分發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，并探討其潛在機制。本研究結(jié)果表明，花椒更適合于血管痙攣、炎癥因子和神經(jīng)交互影響等因素引起的疼痛?；ń返纳锘钚曰瘜W物質(zhì)及其潛在靶點作為其鎮(zhèn)痛作用的潛在機制，有利于臨床藥物的開發(fā)和潛在機制的闡明。