賀 清，丁瑞峰，黎 敏，陳 楠，吳 昆，張愛民

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

選擇性環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase 2，COX-2)抑制劑塞來昔布是一種新型非甾體抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAIDs),其對COX-2受體有較高的選擇性，療效與傳統(tǒng)NSAIDs相當(dāng)且不良反應(yīng)少[1]。然而有研究發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)炎大鼠中單次大劑量應(yīng)用塞來昔布(100 mg/kg)會出現(xiàn)類似于傳統(tǒng)NSAIDs胃黏膜損傷[2]，在使用塞來昔布治療的關(guān)節(jié)炎患者中，胃腸道不良事件發(fā)生率為0.34 %，布洛芬和萘普生的分別為0.74 %和0.66 %[3]。目前選擇性COX-2抑制劑的安全性仍具有爭議。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型在人類療效的可預(yù)測性方面已得到證實[4]，因此本實驗通過建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，給予治療量的塞來昔布灌胃，探究其是否加重佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷及機制，為臨床安全用藥提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組方法 SPF級成年雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量500～600 g，日齡210～240 d,由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供[實驗動物機構(gòu)許可證號:SCXK(京)2019-0010]。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度50 %～70 %，光照周期12 h，喂食標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量分層原則隨機分為4組，每組8只，分別為A組空白對照組(正常大鼠+甲基纖維素)、B組關(guān)節(jié)炎對照組(關(guān)節(jié)炎大鼠+甲基纖維素)、C組正常給藥組(正常大鼠+塞來昔布)、D組關(guān)節(jié)炎給藥組(關(guān)節(jié)炎大鼠+塞來昔布)。每天至少對動物的健康進行2次評估，對發(fā)生與實驗無關(guān)不良反應(yīng)的大鼠給予過量水合氯醛處死。實驗操作流程符合《實驗動物管理和使用指南》的規(guī)定，遵循包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物倫理操作規(guī)范。

1.2主要試劑及儀器 塞來昔布膠囊(美國輝瑞公司，國藥準(zhǔn)字J20140072，批號AL5873)；弗氏完全佐劑(美國Sigma公司，型號F5881-10 mL，批號SLCB4664)；甲基纖維素(美國Sigma公司，型號V900506-250G，批號WXBD00S9V)；顯微鏡(Olympus，型號 CX23)、包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號JB-P7)、石蠟切片機(中國金華科迪，型號KD-3358)。

1.3佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的制備 模型組(B、D)通過右足底皮下注射完全弗氏佐劑200 μL建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，對照組(A、C)給予相同劑量生理鹽水。相較于對照組大鼠而言，造模3 d后的模型組大鼠右后足跖部明顯腫脹，皮溫明顯升高，7 d后繼發(fā)性炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為耳廓、足趾關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)不同程度地發(fā)紅、腫脹，活動受限，提示造模成功。

1.4實驗方法 造模1周后開始給予塞來昔布(20 mg/kg，溶于1 %甲基纖維素中，灌胃容積5 mL/kg)，灌胃28 d，對照組給予相同劑量甲基纖維素，藥物均現(xiàn)用現(xiàn)配。實驗第42 d開始禁食36 h后，10 %水合氯醛0.1 mL/100 mg腹腔注射麻醉處死全部大鼠，取胃組織，用PBS液沖洗干凈。

1.5胃組織病理學(xué)觀察 從幽門部沿胃大彎剪開，取1 cm×1 cm胃標(biāo)本置4 %多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。由專人盲法閱片，每個樣本隨機計數(shù) 20個視野，對每個視野按標(biāo)準(zhǔn)進行單獨評分，取20個視野最后平均數(shù)為最終病理評分。胃黏膜損傷病理評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：顯微鏡下觀察胃組織切片1 cm 范圍，上皮細胞及或腺體破壞，計1分；上層黏膜充血或水腫，計2分；中、下層黏膜充血、出血性損害，計3分；深層壞死或潰瘍形成，計4分；計算每張切片的累積評分。

1.6胃組織大體觀察 從幽門部沿胃大彎剪開，將胃組織平鋪于紗布上, 觀察胃大體損傷。參考Guth標(biāo)準(zhǔn)[6]，以游標(biāo)卡尺測定，計分：0分(正常)；1分(斑點糜爛)；2分(糜爛長度<1 mm)；3分(糜爛長度1～2 mm)；4分(糜爛長度2～3 mm)；5分(糜爛長度> 3 mm)。寬度> 1 mm時分值乘以2，各分值累計相加為損傷總分值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。變量各組間不滿足正態(tài)分布和方差齊性要求，整體差異性檢驗采用Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗；數(shù)值采用M[P25，P75]表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠的一般情況 空白對照組大鼠飲食、活動、大便如常。模型組(B、D)造模后第3 d開始出現(xiàn)右后足紅腫、皮溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、變形，第7 d達到高峰，第14 d出現(xiàn)對側(cè)后足腫脹，右后足關(guān)節(jié)僵硬變形，皮下結(jié)節(jié)多而明顯。用藥后關(guān)節(jié)炎給藥組右后足周徑逐漸下降，給藥第2 d關(guān)節(jié)炎給藥組部分出現(xiàn)少動、易激，部分毛發(fā)失去光澤，無明顯食欲下降等。

2.2胃黏膜病理組織學(xué)觀察及評分 胃黏膜HE染色示：空白對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃小凹和腺體清晰，未見明顯損傷及炎癥反應(yīng)；關(guān)節(jié)炎對照組大鼠胃黏膜上皮脫落，血管擴張；正常給藥組大鼠胃黏膜出現(xiàn)輕度黏膜脫落，范圍較??；關(guān)節(jié)炎給藥組大鼠胃黏膜出現(xiàn)深層黏膜損傷，血管擴張。關(guān)節(jié)炎給藥組胃黏膜損傷評分較空白對照組、正常給藥組明顯增加，但與關(guān)節(jié)炎對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表1。

表1 各組大鼠胃病理評分結(jié)果

圖1 各處理組胃病理照片(HE染色 ×400)

2.3胃大體損傷評分 空白對照組、正常給藥組大鼠未見明顯胃損傷，而關(guān)節(jié)炎對照組、關(guān)節(jié)炎給藥組可觀察到多處點狀胃糜爛。關(guān)節(jié)炎給藥組大鼠胃大體損傷評分較空白對照組、正常給藥組明顯增加，但與關(guān)節(jié)炎對照組無顯著差異。見表2。

表2 各組大鼠胃大體損傷評分結(jié)果

3 討論

選擇性COX-2抑制劑，通過保留具有保護性的COX-1，同時抑制具有促炎性的COX-2而在發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用的同時避免胃黏膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)正常給藥組雖較空白對照組出現(xiàn)了部分胃黏膜輕度脫落，但范圍較小且兩組病理評分以及大體損傷評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這表明治療劑量下塞來昔布對健康大鼠的胃黏膜幾乎無損害作用，Kato等[2]的研究中也證明了這一點。Silverstein等[7]研究表明選擇性COX-2抑制劑已安全地用于健康人且不會引起胃黏膜損傷。關(guān)節(jié)炎對照組與正常對照組相比病理評分、大體損傷評分均明顯增加，這可能是由于關(guān)節(jié)炎引起的全身慢性炎癥所致。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種全身性自身免疫性疾病[8]，劉健等[9]研究發(fā)現(xiàn)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，表現(xiàn)為線粒體腫脹變性，棘突破壞或消失，細胞凋亡率高于正常大鼠，這可能是關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷的原因之一。Kato等[2]表明COX-2主要在關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜巨噬細胞中表達，并且胃黏膜血管通透性較正常大鼠的有所增加，關(guān)節(jié)炎大鼠本身患有慢性全身炎癥，胃黏膜中COX-2的表達和巨噬細胞數(shù)量的增加可能與此有關(guān)。PGE2通過增加胃黏膜微血管血流量和黏液分泌、抑制白細胞粘附血管內(nèi)皮等參與消化道黏膜微循環(huán)的調(diào)節(jié)和損傷的修復(fù)[10]，Takeuchi等[11]指出PGE2通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達和激活EP4受體刺激血管生成，對胃黏膜損傷有促進愈合的作用。血管生成是愈合過程的關(guān)鍵，受促血管生成因子(如VEGF)和抗血管生成因子(如內(nèi)皮抑素)的調(diào)節(jié)，這種情況在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[12]和實驗性潰瘍[13]愈合中均存在。因此我們推測PGE2在維持胃黏膜的完整性起到了關(guān)鍵性作用，關(guān)節(jié)炎黏膜局部PGE2減少，內(nèi)皮抑素與VEGF的比值增加，也會使損傷的胃黏膜愈合過程受到限制。Kato等[2]通過對自身免疫性疾病的誘導(dǎo)較敏感的DA大鼠建立關(guān)節(jié)炎模型，發(fā)現(xiàn)單次大劑量使用塞來昔布(100 mg/kg)雖在正常大鼠中不會造成胃黏膜損傷，但在關(guān)節(jié)炎大鼠中確實會造成類似于傳統(tǒng)NSAIDs藥物的胃黏膜受損。而我們觀察到應(yīng)用治療劑量塞來昔布[20 mg/(kg·d)，28 d]的SD關(guān)節(jié)炎大鼠，雖然出現(xiàn)了黏膜深層損傷，血管擴張，但其病理評分、大體損傷評分與關(guān)節(jié)炎對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，證明塞來昔布并不會加重關(guān)節(jié)炎所致的胃黏膜損傷，這與Blackler等[14]的研究一致，他們發(fā)現(xiàn)接受塞來昔布(10 mg/kg，2次/d，14d)灌胃的關(guān)節(jié)炎大鼠其胃黏膜損傷程度可以忽略不計。我們推測，這些損傷差異可能與藥物具體的種類、劑量、用藥時間、實驗鼠種等有一定的關(guān)系。

總之，塞來昔布不會造成正常大鼠胃黏膜損傷，也不會加重關(guān)節(jié)炎大鼠胃黏膜損傷，在考慮整個胃腸道的安全性時，目前研究支持使用“昔布類”而不是傳統(tǒng)NSAIDs。然而，使用該藥物應(yīng)與心血管疾病風(fēng)險相平衡，尤其是在心血管疾病高風(fēng)險患者中。必要時，應(yīng)規(guī)定傳統(tǒng)NSAID或“昔布類”的最短持續(xù)時間和最低有效劑量[15]。