丁 寧， 徐曉波， 周潔白， 張 勇， 劉子龍， 劉 潔， 張東輝，2，李佳旻， 胡 潔，2

200032 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科1；201104 上海，上海市老年醫(yī)學(xué)中心呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科2

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)陽性非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌一種分子亞型，占比3%～7%[1]。ALK基因與其他基因發(fā)生斷裂后重排，產(chǎn)生ALK融合蛋白，通過激活PI3K-AKT、RAS、JAK-STAT信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤增殖，被認(rèn)為是肺癌的驅(qū)動(dòng)基因之一[2-3]。間變性淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制劑(anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitor，ALK-TKIs)通過與激酶域特定區(qū)域(三磷酸腺苷結(jié)合口袋)結(jié)合，進(jìn)而抑制其激酶活性，阻斷ALK融合蛋白激活下游通路，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[2-3]，進(jìn)而顯著提高ALK陽性晚期NSCLC患者的生存率。但ALK-TKIs治療后腫瘤細(xì)胞可進(jìn)化獲得耐藥性，仍會(huì)導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。研究表明，ALK-TKIs的獲得性耐藥機(jī)制通常為ALK依賴型及非ALK依賴型[4-6]。第二代ALK-TKIs后線治療的耐藥機(jī)制中有相對(duì)較高比例的ALK激酶域二次突變發(fā)生(50%～70%)[5-7]。而體外細(xì)胞株研究結(jié)果顯示，不同二代ALK-TKIs對(duì)不同突變位點(diǎn)的活性存在差異和交叉耐藥[7-9]。因此，有必要深入了解不同二代ALK-TKIs耐藥機(jī)制之間的差異，從而對(duì)臨床用藥的全局化管理提供佐證。

本研究為觀察性研究，ALK陽性晚期NSCLC患者在二代ALK-TKIs后線治療耐藥后再活檢的腫瘤組織或液體活檢樣本的腫瘤相關(guān)基因變異情況，比較不同二代ALK-TKIs的耐藥機(jī)制差別，以期指導(dǎo)未來的治療決策。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究納入103例2014年1月至2020年10月本中心確診的ALK融合陽性非小細(xì)胞肺癌患者。受試者入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC患者；初診時(shí)具有完整的影像學(xué)和內(nèi)鏡檢查結(jié)果，根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會(huì) (International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC)第8版TNM分期明確為IV期或不可根治治療的III期患者； 初始診斷時(shí)腫瘤組織標(biāo)本采用以下任意一種或多種方法檢測為ALK陽性：Ventana免疫組化染色、原位免疫熒光雜交(FISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)或二代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)；接受一代ALK-TKI克唑替尼治療后，按實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.1)評(píng)估確認(rèn)為疾病進(jìn)展，并緊接著以二代ALK-TKIs(阿來替尼、色瑞替尼、布格替尼、恩沙替尼)為后續(xù)治療者；在二代ALK-TKIs治療后以RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)為疾病進(jìn)展，且具有足夠符合標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)標(biāo)本進(jìn)行NGS檢測，并具有完整臨床相關(guān)信息資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：非ALK+肺癌患者；患者未采取二代TKI作為二線靶向治療方案。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(B2017-142R)，患者均知情同意。

1.2 研究方法

為比較4種二代ALK-TKIs的耐藥后的基因組圖譜，送檢標(biāo)本包括腫瘤組織、血漿、腦脊液和胸腔積液。為了克服腫瘤異質(zhì)性，本研究匯集了在同一時(shí)間點(diǎn)收集的所有類型合格標(biāo)本中檢測到的基因改變進(jìn)行分析。所有樣本與全血樣本匹配，作為陰性對(duì)照。生存隨訪：無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)定義為從開始特定ALK-TKIs治療之日起至疾病進(jìn)展或最后一次隨訪之日。

1.3 基因檢測NGS方法

樣本檢測采用基于靶向425或139個(gè)癌癥相關(guān)基因的基因組DNA提取和雜交捕獲。如以往研究報(bào)道進(jìn)行 DNA 提取、文庫制備和基于雜交的靶向富集，以及測序和數(shù)據(jù)分析[10]。2個(gè)基因panel均覆蓋ALK基因所有外顯子(包括側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域)和融合相關(guān)內(nèi)含子。

腫瘤組織原始中位平均測序深度1310X(128X-4992X)，去dup后中位平均測序深度802X(36X-3728X)；血漿ctDNA和胸水或腦脊液上清cfDNA原始中位平均測序深度5827X(1096X-40334X)，去dup后中位平均測序深度2528X(438X-10158X)。白細(xì)胞對(duì)照原始平均測序深度>100X。

不同樣本類型基因擴(kuò)增定義閾值不同，腫瘤組織基因擴(kuò)增定義為≥4.0拷貝數(shù)，血漿ctDNA和胸水/腦脊液上清樣本基因擴(kuò)增定義為≥3.2拷貝數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用Fisher精確檢驗(yàn)用于比較不同藥物治療組別患者之間以及不同變異體組別患者之間的基因突變頻率，使用R軟件(4.0.3版本)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征

本研究納入2014年1月至2020年10月共計(jì)103例符合入組標(biāo)準(zhǔn)的ALK融合陽性晚期NSCLC患者，均為一線克唑替尼治療耐藥后、二線接受二代ALK-TKIs治療后再次耐藥，且行再活檢進(jìn)行下一代測序(NGS)檢測。中位年齡48(25～76)歲， 大部分為65歲以下、女性、不吸煙、腺癌，其中99例(阿來替尼組56例、色瑞替尼組25例，布加替尼組15例、恩沙替尼組3例)檢測到ALK變異和具有臨床意義的其他腫瘤驅(qū)動(dòng)基因變異納入耐藥后基因變異分子圖譜分析。阿來替尼、色瑞替尼、布加替尼3組患者的中位PFS分別為7.5、6.5和14.2個(gè)月，因恩沙替尼僅3例患者，故未統(tǒng)計(jì)PFS。具體患者信息見表1。

2.2 二線二代ALK-TKIs 治療后耐藥突變圖譜復(fù)雜多樣

66.7%(66/99)檢出ALK激酶結(jié)構(gòu)域耐藥突變，其中G1202R/K比例最高，占18.2%(18/99)，L1196M其次，占14.1%(14/99，圖1)；21.2%(21/99)患者檢出旁路和下游信號(hào)通路活化，其中包括PIK3CA(5/99)、KRAS(4/98)、PTEN(4/99)、MET(3/99)。12.1%(12/99)患者出現(xiàn)2種ALK耐藥突變，有5.1%(5/99)患者出現(xiàn)多個(gè)ALK耐藥突變(見表2)。此外，有33.3%(33/99)患者耐藥原因?yàn)榉茿LK依賴型。

表1 103例應(yīng)用二代ALK-TKIs二線治療ALK陽性晚期

圖1 二代ALK-TKIs 二線治療ALK 陽性晚期NSCLC耐藥后基因變異圖譜比例圖

表2 不同ALK-TKIs治療組二線治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后的ALK突變數(shù)量 [n =99，例(%)]

注：餅圖的比例是把所有患者檢測到的ALK突變個(gè)數(shù)相加，計(jì)算ALK激酶域每個(gè)突變占比

2.3 不同EML4-ALK融合變體不同耐藥基因發(fā)生率存在顯著差異

45例V1型變異體和35例V3型變異體經(jīng)過一代克唑替尼和二代ALK-TKIs二線治療后，ALK繼發(fā)突變發(fā)生率存在顯著差異。V3型患者更易發(fā)生ALK激酶結(jié)構(gòu)域繼發(fā)性突變，發(fā)生率為85.7%(30/35)，而V1型發(fā)生率則僅為55.6%(25/45)(P=0.003 9)。V3型的G1202R/K突變發(fā)生率顯著高于V1型，分別為57.1%(20/35)、4.4%(2/45)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。L1196M發(fā)生率則在V1型中相對(duì)更為常見(31.1%，14/45)，V3型為14.3%(5/35)(P=0.079 4，圖2)。

2.4 不同二代TKI二線治療耐藥突變圖譜存在差異

因?yàn)榇舜稳虢M的恩沙替尼患者只有3例，不具代表性，因此主要分析了其余3種二代TKIs的耐藥后基因變異圖譜(圖3)。阿來替尼、色瑞替尼和布加替尼3種藥物二線治療耐藥后的主要差異之一為ALK繼發(fā)突變發(fā)生率不同，分別為76.8%(43/56)、48%(12/25)、53.3%(8/15)(P=0.02)，其中阿來替尼的ALK繼發(fā)突變發(fā)生率最高。

其次是耐藥位點(diǎn)存在差異：其中G1202R發(fā)生率分別為31.6%(阿來替尼)，33.3%(色瑞替尼)及10.0%(布加替尼)，但P值無顯著差異(P=0.24)；G1269A(7/56)均發(fā)生在阿來替尼組(P=0.07)，其中有2例為與其他ALK位點(diǎn)的復(fù)合突變；色瑞替尼G1202R、L1196M、F1174X和C1156Y發(fā)生率較高；而布加替尼F1174X、D1203N、E1210K發(fā)生率較高。D1203N(P=0.000 2)和E1210K(P=0.003 5)主要發(fā)生在布加替尼耐藥后，布加替尼組F1174X發(fā)生率也高于阿來替尼和色瑞替尼組(P=0.13，圖4)。

3 討論

3.1 ALK-TKIs治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后基因變異圖譜具有共性

本研究為目前最大樣本量、根據(jù)耐藥后再活檢的NGS結(jié)果，比較同期接受不同二代ALK-TKIs治療耐藥后基因變異圖譜異同的真實(shí)世界研究。雖然目前對(duì)ALK-TKI的獲得性耐藥機(jī)制基本已有初步認(rèn)識(shí)[4,11]，主要為以下四種類型：①ALK激酶結(jié)構(gòu)域的耐藥突變；②旁路及下游信號(hào)通路的激活(如EGFR擴(kuò)增、IGF1R過表達(dá)、HER2擴(kuò)增、MET擴(kuò)增、BRAFV600E突變等)；③組織學(xué)轉(zhuǎn)化(如腺癌-小細(xì)胞癌轉(zhuǎn)化等)；④一代ALK-TKIs藥物的藥代動(dòng)力學(xué)因素導(dǎo)致的耐藥，但一代ALK-TKIs與二代ALK-TKIs的上述各耐藥機(jī)制發(fā)生占比有所差異[6]，二代ALK-TKIs耐藥后ALK激酶結(jié)構(gòu)域的耐藥比例達(dá)50%～60%，遠(yuǎn)高于一代ALK-TKIs的20%～30%。有研究報(bào)道克唑替尼最常見的ALK獲得性耐藥突變?yōu)镚1269A、F1174X和L1196M；而接受過一種或多種二代ALK-TKIs治療患者主要的ALK耐藥突變?yōu)镚1202R/del。我們此次研究的結(jié)果也進(jìn)一步佐證了這一現(xiàn)象。

圖3 二代ALK-TKIs二線治療ALK陽性晚期NSCLC耐藥后基因突變圖譜

注：餅圖的比例是把所有患者檢測到的ALK突變個(gè)數(shù)相加，計(jì)算ALK激酶域每個(gè)突變占比

3.2 不同變異體ALK陽性晚期NSCLC二代ALK-TKIs二線治療后的耐藥基因圖譜存在顯著差異，提示臨床治療決策時(shí)需要充分考慮ALK變異的異質(zhì)性

本研究比較了V1和V3型患者接受二線二代ALK-TKIs治療后的耐藥機(jī)制差異。V1及V3型是ALK融合患者最常見的兩種變體，本研究納入的V1及V3型患者占總研究人群的78.7%，兩者間的耐藥機(jī)制存在差異：V3型患者的ALK激酶結(jié)構(gòu)域突變比例明顯高于V1型，且V3的G1202R突變型明顯高于V1型，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與既往報(bào)道相一致[16]。本研究亦觀察到V1型患者的L1196M突變明顯高于V3型患者的趨勢。這些發(fā)現(xiàn)有助于為ALK陽性晚期NSCLC患者的精準(zhǔn)分層治療提供依據(jù)，例如，V3亞型的患者是否可以優(yōu)先推薦三代ALK-TKI的前線應(yīng)用，從而規(guī)避后續(xù)獲得性G1202R耐藥，以期延長患者的PFS甚至OS。

3.3 不同二代ALK-TKIs用于二線治療ALK陽性晚期NSCLC的耐藥突變圖譜差異明顯，且復(fù)合突變比例高，無法充分發(fā)揮其特異性抑制ALK變異的優(yōu)勢

本研究結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)不同二代ALK-TKIs的ALK耐藥突變存在差異。阿來替尼耐藥后ALK激酶結(jié)構(gòu)域突變比例最高。對(duì)于二代ALK-TKI治療患者最常見的耐藥突變G1202R突變，則更常見于阿來替尼和色瑞替尼，這也是符合既往文獻(xiàn)的分析報(bào)道[6]。G1296A(7/56)突變則全部發(fā)生在阿來替尼組，其中有3例患者同時(shí)存在G1296A位點(diǎn)和其他位點(diǎn)的復(fù)合突變，2例患者同時(shí)存在PTEN等旁路或下游信號(hào)通路激活，其他2例患者僅僅找到G1296A的單一位點(diǎn)突變。因此對(duì)于G1296A是否為阿來替尼獨(dú)有的耐藥機(jī)制需作以下思考：① 在ALK-TKIs的體外試驗(yàn)顯示色瑞替尼和阿來替尼均能有效抑制G1296A突變，但體外試驗(yàn)的結(jié)論并不能完全替代藥物的臨床療效，因此在色瑞替尼組無一例出現(xiàn)G1296A突變，反之驗(yàn)證了G1296A可能是阿來替尼獲得性耐藥的重要位點(diǎn)[7]；②G1296A也常見于克唑替尼耐藥后，因本試驗(yàn)缺乏克唑替尼耐藥后的基因數(shù)據(jù)做參考，無法確定G1296A出現(xiàn)的與治療相關(guān)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)[6]；③對(duì)于同時(shí)存在其他ALK復(fù)合突變及旁路或下游信號(hào)通路活化的患者，需考慮除外G1296A，存在阿來替尼多重耐藥機(jī)制的可能；④ 存在其他沒有檢測到的耐藥基因(如血液樣本檢測對(duì)MET擴(kuò)增檢測的挑戰(zhàn))。另外，布加替尼組耐藥突變D1203N(4/15)、E1210K(3/15)發(fā)生率高于阿來替尼組和色瑞替尼組。同樣從體外試驗(yàn)來看，單一的D1203N及E1210K突變均對(duì)布加替尼敏感[7]，而本試驗(yàn)布加替尼組耐藥后出現(xiàn)的D1203N及E1210K突變比例最高。仔細(xì)分析可以看到本組試驗(yàn)人群中其中D1203N突變均為ALK復(fù)合突變，而3例E1210K突變有2例為ALK復(fù)合突變，這也能解釋布加替尼的耐藥原因。二代ALK-TKIs二線治療耐藥機(jī)制的異同，進(jìn)一步佐證了多種ALK-TKIs的先后應(yīng)用可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)生多種復(fù)雜的耐藥機(jī)制共存的現(xiàn)象，如包含ALK的復(fù)合突變與ALK合并其他旁路下游通路激活等同時(shí)發(fā)生。這一復(fù)雜耐藥機(jī)制必將增加后續(xù)治療難度。二代ALK-TKIs的交替應(yīng)用，或三代ALK-TKI也未必能全面克服這些多種耐藥機(jī)制共存的復(fù)雜局面。

本研究中出現(xiàn)ALK位點(diǎn)的復(fù)合突變比例較文獻(xiàn)報(bào)道略高，可能的原因一是與連續(xù)的ALK-TKIs的應(yīng)用導(dǎo)致ALK的復(fù)合突變有關(guān)，也可能是由于NGS檢測平臺(tái)探針設(shè)計(jì)覆蓋ALK基因所有外顯子(包括側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域)和融合相關(guān)內(nèi)含子，使ALK檢出率提高，但更為重要的是，復(fù)合突變無疑會(huì)增加后線藥物治療難度。

因此二代ALK-TKIs應(yīng)用于二線治療無疑較難發(fā)揮他們特異性抑制ALK基因變異的優(yōu)勢。本研究中阿來替尼、色瑞替尼、布加替尼三組的中位PFS分別僅為7.5，6.5及14.2個(gè)月，與目前已報(bào)道的二代ALK-TKI二線治療臨床研究報(bào)道中位PFS相仿[12-15]，遠(yuǎn)不如二代ALK-TKIs一線治療ALK陽性晚期NSCLC的數(shù)據(jù)。臨床上有必要將高效的特異性抑制劑前線使用，發(fā)揮最大療效。同時(shí)，也必須重視基因的動(dòng)態(tài)監(jiān)測在ALK陽性患者治療過程中的重要性，幫助臨床醫(yī)生明確患者耐藥機(jī)制，采用針對(duì)性的新一代靶向治療，或采用基于化療或其他靶點(diǎn)的聯(lián)合治療，當(dāng)然這都需要未來臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 本研究的局限性

因本研究開展的時(shí)間和藥物的可及性因素影響，入組的患者均采用克唑替尼作為一線治療。當(dāng)今ALK陽性晚期NSCLC患者一線治療優(yōu)先推薦二代或者三代ALK-TKIs，因此我們還需要深入研究新一代ALK-TKIs一線治療的耐藥機(jī)制差異，助力對(duì)ALK陽性晚期NSCLC患者一線精細(xì)分層精準(zhǔn)治療和全程治療策略的全局把握。

本研究還具有以下幾個(gè)局限性：①本研究缺少克唑替尼耐藥后樣本，比較遺憾無法分辨克唑替尼一線治療和二代ALK-TKIs二線治療耐藥誘導(dǎo)的ALK耐藥突變。②由于組織可及性有限以及血漿檢測MET擴(kuò)增的挑戰(zhàn)性，我們無法對(duì)所有患者進(jìn)行MET突變分析，可能對(duì)MET擴(kuò)增耐藥機(jī)制的發(fā)生率會(huì)有一定影響。

總之，本研究深入分析了幾種2代ALK-TKIs藥物作為二線治療ALK陽性晚期NSCLC患者的獲得性耐藥基因變異圖譜的共性與差異。再次驗(yàn)證了ALK激酶結(jié)構(gòu)域的耐藥突變是二代ALK-TKIs最主要的獲得性耐藥機(jī)制；發(fā)現(xiàn)不同的變體如V1及V3型患者的耐藥突變譜有所不同；且不同的2代ALK-TKIs耐藥譜亦有差異，不僅加深了對(duì)ALK-TKIs耐藥機(jī)制的理解，而且為臨床制定ALK陽性晚期NSCLC治療方案的決策提供了重要參考。