劉澤宇，羅袁登，李 勛，謝傳明，張雷達

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院全軍肝膽外科研究所

肝癌是一種高度侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤，是世界范圍內(nèi)第三大癌癥死亡原因，患病率居第六位[1-4]。70%～85%的原發(fā)性肝癌為肝細胞癌。雖然檢測和檢驗的技術(shù)手段不斷發(fā)展，但如今肝癌的早期診斷仍具有挑戰(zhàn)性，患者診斷出肝癌時往往已是晚期[5-8]，而術(shù)后5年腫瘤復(fù)發(fā)的發(fā)生率可高達70%[9-14]。因此，為了改善肝癌患者的預(yù)后，亟待需要新的生物標志物出現(xiàn)[15]，以幫助早期診斷，風(fēng)險評估和靶向治療[14, 16]。N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶(N-acetylgalacto-samine-6-sulfatase, GALNS)是一種溶酶體酶，能夠水解糖胺聚糖，如軟骨素-4-硫酸酯和硫酸角蛋白[17-19]。有研究報道稱，GALNS基因突變可促進了細胞外基質(zhì)中硫酸角蛋白的積累[20-21]，進而引起腫瘤發(fā)生[22]。另外以往的研究中也已發(fā)現(xiàn)在幾種惡性腫瘤患者的血清中存在高水平的GALNS，并且證明其可作為診斷肺癌的潛在生物標志物[23]。但目前對GALNS與肝細胞癌的臨床關(guān)系尚不清楚，本研究收集西南醫(yī)院肝癌術(shù)后隨訪患者的臨床病理數(shù)據(jù)，首次探究GALNS在肝細胞癌的臨床意義及體外生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 一般資料

采用回顧性隊列研究，收集陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年至2014年間的72例肝細胞癌患者，其中男性49例，女性23例；中位年齡為47歲，年齡范圍為19～73歲?；颊咝g(shù)中取新鮮冰凍肝癌組織及癌旁組織標本。本研究通過中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批件號：KY2020127。

1.2 納排標準及病例篩選流程圖

納入標準：①肝癌患者行肝癌切除術(shù)；②術(shù)后組織病理學(xué)檢查為肝細胞癌；③臨床病理資料完整。

排除標準：①非肝癌因素死亡；②圍手術(shù)期死亡的患者；③合并其他惡性腫瘤；④術(shù)前行介入栓塞或其他治療。

病例篩選流程圖見圖1，入組72例患者基本資料見表1。

表1 入組病例基本資料表 (n=72)

圖1 病例篩選流程圖

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 將收集的標本以福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片。采用DAB染色方法，操作步驟參照試劑盒說明書進行染色。GALNS抗體濃度為1∶150。由兩位獨立的病理科醫(yī)師進行雙盲閱片，評估染色結(jié)果。

1.3.2 RT-qPCR 通過TRIzol法提取細胞總RNA，采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以GAPDH為內(nèi)參對照，檢測GALNS mRNA的表達水平，采用2-ΔΔCt法分析定量PCR結(jié)果。

1.3.3 細胞體外遷移實驗 Huh7細胞和LM3細胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS與siCtrl，48 h后將細胞消化接種于24孔板的Transwell小室內(nèi)。24孔板內(nèi)加入600 μL完全培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入200 μL無血清培養(yǎng)基重懸的細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。采用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min，擦拭去室內(nèi)未穿過的肝癌細胞。在100倍視野下拍照計數(shù)。

1.3.4 細胞增殖實驗 Huh7細胞和LM3細胞接種于96孔板中，轉(zhuǎn)染siGALNS與siCtrl。培養(yǎng)72 h后，用酶標儀檢測波長450 nm下吸光度(OD值)。

1.4 觀察指標和評價標準

1.4.1 觀察指標 ①肝癌組織和癌旁組織GALNS表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，包括性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤長徑、美國癌癥聯(lián)合會(American Jiont Committee on Cancer, AJCC)TNM分期、血管侵犯、病理分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。②肝癌患者預(yù)后及影響因素分析：GALNS表達、性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤長徑、血管侵犯、病理分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。③體外實驗驗證GALNS對肝癌細胞遷移與細胞增殖的影響。

1.4.2 評價標準 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以染色強度及陽性細胞百分比進行評分，0分為陰性表達，1～4分為弱表達，5～8分為中表達，9～12分為高表達，將陰性表達、弱表達和中表達統(tǒng)一為低表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 26 for Windows和R4.2.1統(tǒng)計分析及畫圖軟件。分類計數(shù)資料，采用χ2檢驗來分析GALNS表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用獨立樣本t檢驗分析連續(xù)性變量的差異。Cox風(fēng)險回歸分析用于單因素和多因素分析肝細胞癌危險因素，并評估風(fēng)險比(HR)和95%置信區(qū)間(CI)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織GALNS表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

肝癌組織芯片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：如表2，GALNS在72例肝癌組織中低表達40例(陰性表達、弱表達、中表達分別為2、12、26例)，高表達32例；GALNS在72例癌旁組織中低表達68例(陰性表達、弱表達、中表達分別為44、13、11例)，高表達4例。通過卡方檢驗，較癌旁組織，GALNS于肝癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.250，P<0.05)。免疫組化染色結(jié)果顯示GALNS主要位于細胞質(zhì)，見圖2。

表2 肝癌患者癌與癌旁組織GALNS蛋白表達的

肝癌組織中GALNS蛋白高表達和低表達分別為32、40例，腫瘤長徑為≤5 cm和>5 cm分別為19、53例，TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期分別為34、38例，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的分別為61、11例。GALNS蛋白高表達與腫瘤長徑、TNM分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.649，14.849，5.667，P<0.05)，性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、血管侵犯和病理分期與GALNS蛋白高表達無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

圖2 GALNS蛋白在HCC癌旁組織和肝癌組織中的表達

表3 GALNS低表達與高表達肝癌患者臨床病理特征比較

2.2 肝細胞癌患者的預(yù)后及危險因素分析

72例患者均獲得門診或電話隨訪，術(shù)后中位隨訪時間為16.9個月。GALNS蛋白低表達和高表達肝癌患者，術(shù)后1、3、5年生存率分別為87.50%、42.50%、40.00%和37.50%、12.50%、3.13%。GALNS低表達組的生存率優(yōu)于高表達組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.268，P<0.05)，見圖3。

圖3 肝癌患者中GALNS低表達與高表達患者術(shù)后生存曲線

單因素Cox風(fēng)險分析結(jié)果顯示：GALNS、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤長徑、TNM分期、血管侵犯和病理分期是影響肝癌患者術(shù)后總體生存率的相關(guān)因素(P<0.05)，性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移不是影響肝癌患者術(shù)后總體生存率的相關(guān)因素(P>0.05)，見表4。多因素Cox風(fēng)險回歸分析，采用逐步回歸法篩選變量，結(jié)果提示：GALNS、遠處轉(zhuǎn)移、血管侵犯和病理分期均為肝細胞癌患者的獨立危險因素，見表5。

表4 影響72例肝癌患者術(shù)后總體生存率的單因素分析

2.3 抑制GALNS表達對肝癌細胞增殖與遷移的影響

2.3.1 qRT-PCR檢測siGALNS敲低GALNS mRNA效果 轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的Huh7細胞中，GALNS mRNA的相對表達量分別為(31.35±3.6)%和(100±13.86)%。采用獨立樣本t檢驗比較，siGALNS可顯著敲低GALNS mRNA表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.66，P<0.05)。轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的LM3細胞中，GALNS mRNA的相對表達量分別為(27.4±3.53)%和(100±8.25)%，采用獨立樣本t檢驗比較siGALNS可顯著敲低GALNS mRNA表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.26，P<0.05)。

表5 影響72例肝癌患者術(shù)后總體生存率的多因素分析

2.3.2 CCK-8檢測細胞增殖情況 Huh7細胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，CCK-8吸光度值分別為(0.67±0.08)和(1.18±0.12)，敲低GALNS可顯著抑制Huh7細胞增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.05，P<0.05)。LM3細胞分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，CCK-8吸光度值分別為(0.86±0.07)和(1.25±0.18)，敲低GALNS可顯著抑制LM3細胞增殖能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.51，P<0.05)，見圖4。

A：Transwell檢測敲低GALNS后對Huh7和LM3細胞遷移能力的影響(結(jié)晶紫)；B： Huh7、LM3細胞遷移能力分析 a：P<0.05，與siCtrl組比較

2.3.3 Transwell實驗檢測細胞遷移情況 分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的Huh7細胞，穿膜細胞數(shù)分別為(13.5±1.85)和(38.46±3.25)，敲低GALNS可顯著抑制Huh7細胞遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.61，P<0.05)。分別轉(zhuǎn)染siGALNS和siCtrl的LM3細胞，穿膜細胞數(shù)分別為(32.59±3.62)和(62.49±4.5)，敲低GALNS可顯著抑制LM3細胞遷移能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.72，P<0.05)。見圖5。

3 討論

肝癌是全球第三大癌癥死亡原因，患病率居第六位。肝細胞癌占肝癌總數(shù)的75%～85%。其起病隱匿，早期癥狀不典型，患者確診時腫瘤常已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，失去根治性手術(shù)機會導(dǎo)致預(yù)后較差。因此研究肝細胞癌預(yù)后標志物具有重要意義。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)展的細胞環(huán)境，除腫瘤細胞本身以外，腫瘤微環(huán)境還包括了細胞類型、細胞外基質(zhì)、生長因子、蛋白水解酶及其他信號分子[24-25]。其中細胞外基質(zhì)與腫瘤細胞之間的相互作用常常與腫瘤發(fā)生、進展和患者預(yù)后有著顯著關(guān)聯(lián)[26]。異常的胞外基質(zhì)表達可促進癌細胞的遷移[22, 27]。軟骨素-4-硫酸鹽是一類糖胺聚糖，可共價連接在蛋白質(zhì)上形成蛋白聚糖，也是細胞外基質(zhì)的成分之一。不少研究報道其與膠質(zhì)瘤[22]、前列腺癌[28]和乳腺癌[29]等惡性腫瘤均有關(guān)。既往有報道稱致癌性HRAS信號通路活化可導(dǎo)致C4S減少，促進腫瘤細胞遷移能力增強和患者惡性腫瘤的易感性提高[30]。而GALNS是一類硫酸酯酶可去除C4S的硫酸鹽基團，引起C4S水解[31-32]，這提示GALNS可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 “癌化”的微環(huán)境可給腫瘤生長和轉(zhuǎn)移提供“溫床”，癌細胞分泌的各種酶類可誘導(dǎo)細胞周圍基質(zhì)的變化[33-34]。相對穩(wěn)定的細胞外基質(zhì)是一個成分豐富的大分子網(wǎng)絡(luò)，為細胞提供機械支架，介導(dǎo)信號分子的傳遞以維持細胞功能。周圍基質(zhì)的降解導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的重塑有利于腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[35-36]。而GALNS作為消化糖胺聚糖的酶，其表達水平增高導(dǎo)致C4S等糖胺聚糖過度水解，引起細胞外基質(zhì)成分的變化，有助于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

因此，本研究通過臨床病理資料分析及體外實驗驗證GALNS在肝細胞癌中的臨床意義及生物學(xué)功能：GALNS在大部分肝癌患者的腫瘤組織中表達水平升高；進一步分析了肝細胞癌患者臨床病理因素與GALNS蛋白的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：GALNS與腫瘤長徑、TNM分期和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示GALNS的異常高表達與肝細胞癌患者的不良臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)；多因素Cox風(fēng)險回歸分析結(jié)果表明：GALNS表達、遠處轉(zhuǎn)移[37]、血管侵犯[38]和病理分期[39]是影響肝癌患者總體生存率的獨立危險因素。由于GALNS與腫瘤長徑、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，通過體外細胞實驗檢測發(fā)現(xiàn)GALNS具有促進肝癌細胞增殖和遷移的能力，敲低GALNS可有效抑制肝癌細胞增殖與遷移。今后深入研究GALNS在肝癌中的分子作用機制，未來有望作為診斷肝癌及靶向治療的潛在生物標志物。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突