乳酸菌發(fā)酵對(duì)四種雜豆蛋白凝膠及消化特性的影響

姜文鎧，李秋艷，盛文洋，王雅瓊，芮 昕

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

近年來，隨著植物基酸奶市場(chǎng)的飛速發(fā)展以及消費(fèi)者對(duì)健康消費(fèi)理念的升級(jí)，植物基酸奶已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)問題。植物基酸奶是以豆類、堅(jiān)果類、谷物類或其他富含蛋白質(zhì)的植物為原料，經(jīng)發(fā)酵作用而形成的具有低飽和脂肪酸，不含膽固醇和反式脂肪酸等特點(diǎn)的植物基食品[1]。由于植物基蛋白與牛乳蛋白結(jié)構(gòu)與特性的差異，導(dǎo)致以植物蛋白為原料的發(fā)酵酸奶存在口感粗糙、粉感嚴(yán)重以及豆腥味重等問題[2]。目前，國內(nèi)外市場(chǎng)上銷售的植物基酸奶的基底多以大豆為主[3]，而以雜豆為基底的植物基酸奶市場(chǎng)占比較少。

據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）數(shù)據(jù)顯示，2020年世界雜豆生產(chǎn)總值達(dá)370118.7萬美元，我國的雜豆生產(chǎn)總值達(dá)2148.3萬美元，我國為世界少數(shù)幾個(gè)雜豆資源非常豐富的國家之一。其中，蕓豆、鷹嘴豆、豌豆和小扁豆分別為世界產(chǎn)量第一、第二、第三和第六[4]的雜豆類。雜豆蛋白含量較高，鷹嘴豆、紅蕓豆、小扁豆和豌豆蛋白含量為23%～30%，且組成較為均衡，研究表明，鷹嘴豆蛋白所含必需氨基酸齊全，易消化[5]，為優(yōu)質(zhì)植物蛋白；此外，研究表明一些雜豆蛋白具有獨(dú)特的生理功能，如紅蕓豆蛋白產(chǎn)生的肽段具有較高的抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)[6]等功能；小扁豆蛋白具有預(yù)防心血管疾病和降低膽固醇[7]等生理功能；豌豆蛋白產(chǎn)生的多肽具有抗氧化[8]、抗癌防癌、抗菌消炎和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生理功能。因此，四種雜豆蛋白是營養(yǎng)、功能價(jià)值較高的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源，在植物基酸奶的應(yīng)用中具有廣闊的市場(chǎng)前景。

蛋白凝膠是決定酸奶品質(zhì)的重要因素。乳酸菌發(fā)酵誘導(dǎo)蛋白凝膠是典型的酸誘導(dǎo)凝膠。乳酸菌在發(fā)酵過程中pH降低，促使經(jīng)適當(dāng)熱前處理的蛋白質(zhì)分子在接近等電點(diǎn)時(shí)分子間靜電斥力減弱，從而形成有序的三維凝膠結(jié)構(gòu)，這在牛乳和大豆中已有較多相關(guān)報(bào)道[9-10]。然而，不同植物基來源的蛋白由于其自身特性的差異，在乳酸菌發(fā)酵作用下形成的凝膠能力可能不同，凝膠結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)特性可能存在差異，繼而影響植物基酸奶的感官品質(zhì)。關(guān)于雜豆蛋白在乳酸菌作用下的凝膠特性的相關(guān)報(bào)道較少，Boeck等[11]研究指出小扁豆蛋白在乳酸菌發(fā)酵作用下可形成凝膠，且質(zhì)構(gòu)和流變學(xué)特性結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)與酸牛乳凝膠類似，該作者指出，小扁豆蛋白在其他發(fā)酵乳制品替代品中顯示出很高的應(yīng)用潛力。而截止目前，鷹嘴豆、紅蕓豆、豌豆尚未有相關(guān)研究報(bào)道。

食品基質(zhì)（Food Matrix）是影響營養(yǎng)素分子釋放與吸收的重要因素。研究表明，蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的差異性將進(jìn)一步引發(fā)蛋白質(zhì)分子在胃腸道消化過程中重排，導(dǎo)致差異性的分子釋放及降解模式，最終影響其營養(yǎng)價(jià)值[12]。發(fā)酵牛乳凝膠結(jié)構(gòu)狀態(tài)與蛋白質(zhì)分子的消化特性已得到較為充分的研究[13]。然而，雜豆蛋白在該領(lǐng)域的研究尚屬空白。本研究主要探究乳酸菌對(duì)鷹嘴豆、豌豆、紅蕓豆、小扁豆這四種雜豆蛋白的凝膠形成、凝膠特性、微觀結(jié)構(gòu)、體外動(dòng)態(tài)胃腸道消化中的消化行為的影響及蛋白凝膠對(duì)乳酸菌的保護(hù)作用，以期為植物基酸奶發(fā)酵底物的選擇和發(fā)揮益生作用等方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌B1-6（Lactobacillus plantarumB1-6） 來源于新疆傳統(tǒng)發(fā)酵飲品BOZA，保藏于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。該菌株通過16S rDNA序列鑒定，基因加入號(hào)KM200717；樣品

采購自江蘇省南京市玄武區(qū)蘇果超市，選取自帶包裝、成熟干燥且來自不同產(chǎn)地的雜豆4種，于20 ℃條件下儲(chǔ)藏。四種雜豆為鷹嘴豆（品種：卡布里；產(chǎn)地：新疆）、紅蕓豆（品種：英國大紅；產(chǎn)地：遼寧）、小扁豆（品種：04鑒1；產(chǎn)地：甘肅）和豌豆（品種：中豌6號(hào)；產(chǎn)地：山東）；α-淀粉酶（來自人類唾液，A1031，1500 U/mg）、胃蛋白酶（來自豬胃粘膜，P7125，400 U/mg）、胰酶（來自豬胰腺，p7545，200 U/mg）、膽汁鹽（來自豬，B8631） 美國Sigma-Aldrich公司；MRS培養(yǎng)基 青島海博生化科技有限公司；正戊烷

色譜純，上海沃凱試劑公司；甲醇 色譜純，美國Tedia試劑公司；考馬斯亮藍(lán)G250、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA） 分析純，南京壽德試劑公司；牛血清白蛋白 分析純，上海源葉生物公司；胰酪蛋白胨 分析純，美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LRH-150型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SU8010型冷凍電子顯微鏡 日本東京日立公司；64RL型高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；TLP型質(zhì)構(gòu)分析儀 美國Food Technology公司；CR-400型色差儀 英國Norma Lab公司；Bionic Rat Model II+型機(jī)械小鼠模型 江蘇省南通東概念新材料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雜豆蛋白提取 鷹嘴豆蛋白的提取參照安馨等[14]的方法，紅蕓豆蛋白的提取參考梁珊等[15]的方法，小扁豆蛋白的提取參考聶麗潔[16]的方法，豌豆蛋白的提取參考秦高一鑫等[17]的方法。

1.2.1.1 脫脂 雜豆粉碎過篩（100目標(biāo)準(zhǔn)篩）。稱取100 g雜豆粉置于1 L三角瓶中，用500 mL正己烷混溶，放入攪拌機(jī)（180 r/min，20 ℃）攪拌60 min，取沉淀倒回三角瓶，加正己烷重復(fù)3次，最后取沉淀，用平板晾曬一晚后收集。

1.2.1.2 雜豆蛋白提取工藝 脫脂豆粉用水按1:10（50 g脫脂豆粉：500 mL純水）的比例混合均勻，調(diào)節(jié)溶液pH，室溫下攪拌提取，后離心棄沉淀，調(diào)節(jié)上清液pH至等電點(diǎn)后離心，收集沉淀冷凍干燥得到四種雜豆蛋白。

提取參數(shù)：鷹嘴豆調(diào)節(jié)溶液pH至10.0，攪拌提取80 min（180 r/min），離心20 min（3500 r/min，4 ℃），調(diào)至等電點(diǎn)pI值4.5，離心10 min（4000 r/min，4 ℃）；紅蕓豆調(diào)節(jié)溶液pH至9.0，攪拌提取120 min（180 r/min），離心30 min（3500 r/min，4 ℃），調(diào)至等電點(diǎn)pI值4.5，離心20 min（4000 r/min，4 ℃）；小扁豆調(diào)節(jié)溶液pH至9.0，攪拌提取90 min（180 r/min），離心20 min（3800 r/min，4 ℃），調(diào)至等電點(diǎn)pI值4.6，離心15 min（3800 r/min，4 ℃）；豌豆調(diào)節(jié)溶液pH至9.0，攪拌提取120 min（180 r/min），離心10 min（4000 r/min，4 ℃），調(diào)至等電點(diǎn)pI值4.2，離心10 min（4000 r/min，4 ℃）。獲取的鷹嘴豆蛋白、紅蕓豆蛋白、小扁豆蛋白和豌豆蛋白分別被簡(jiǎn)稱為CP、RKP、LP和PP。

1.2.1.3 雜豆蛋白主要成分的測(cè)定 水分含量測(cè)定：采用GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》的直接干燥法；灰分含量測(cè)定：采用GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》的灼燒法；總蛋白含量測(cè)定：采用GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的凱氏定氮法；粗脂肪含量測(cè)定：采用GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》的索氏抽提法；碳水化合物含量測(cè)定：采用GB/Z 21922-2008《食品營養(yǎng)成分基本術(shù)語》的減法計(jì)算。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵制備雜豆蛋白凝膠

1.2.2.1 菌種活化 菌種活化按照Blana等[18]的方法。將植物乳桿菌B1-6接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行活化培養(yǎng)。兩次連續(xù)培養(yǎng)后，將發(fā)酵液離心30 s（10000 r/min，20 ℃），在菌體沉淀中加入等體積生理鹽水（0.85%，m/v）以洗去培養(yǎng)基。清洗兩次后加入等體積生理鹽水混合均勻后備用。

1.2.2.2 雜豆蛋白凝膠的制備 采用去離子水分別配制終濃度在0.1%～3.0%（w/v）的四種雜豆蛋白溶液，雜豆蛋白溶液濃度的選擇參考Rui等[19]的方法。調(diào)節(jié)pH至7.0，85 ℃滅菌10 min，加入過濾除菌的葡萄糖使其終濃度為2.0%（w/v），分別接種3.0%（v/v）的植物乳桿菌B1-6發(fā)酵種子液，置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵。

1.2.2.3 發(fā)酵速率的測(cè)定 參考Rui等[19]的方法，乳酸菌發(fā)酵速率以乳酸菌在雜豆蛋白體系發(fā)酵產(chǎn)酸致pH降低所需的時(shí)間進(jìn)行計(jì)量，具體計(jì)算公式如下：

式中：v表示乳酸菌發(fā)酵速率，1/h；ΔpH表示發(fā)酵雜豆蛋白pH降低值；t表示pH降低所需的發(fā)酵時(shí)間，h。

1.2.3 發(fā)酵雜豆蛋白凝膠特性研究

1.2.3.1 最小臨界凝膠濃度的研究 根據(jù)Guldiken等[20]的方法對(duì)四種雜豆蛋白的凝膠形成能力進(jìn)行分析。在平底玻璃管內(nèi)監(jiān)測(cè)雜豆蛋白凝膠的直觀圖像。在發(fā)酵pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5時(shí)將各蛋白濃度樣品倒置，當(dāng)樣品不流動(dòng)時(shí)，表明凝膠形成，倒置后樣品有少許流動(dòng)時(shí)表明弱凝膠形成。臨界凝膠濃度（LGC）為將平底玻璃管倒置后，樣品能夠形成倒置不流動(dòng)凝膠的最小蛋白濃度，低于此濃度不能形成自支撐凝膠。樣品的pH由pH計(jì)測(cè)量。

1.2.3.2 質(zhì)構(gòu)特性 探明四種雜豆蛋白最小凝膠濃度后，采用蛋白濃度在2.0%（w/v）發(fā)酵雜豆蛋白凝膠樣品，將其切為23 mm高×25 mm直徑的圓柱體，使用TLP質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品的硬度、彈性、內(nèi)聚性和膠黏性，測(cè)定模式選用T.P.A模式，具體參數(shù)設(shè)置如下：探頭型號(hào)選擇p/50，選擇探頭直徑50 mm的平頭探頭，前速度為1 mm/s測(cè)量時(shí)速度為5 mm/s，返回速度為5 mm/s，觸發(fā)力為5 g，2次壓縮中停頓時(shí)間設(shè)為5 s，探頭移動(dòng)距離為30%。

1.2.3.3 凝膠色差 采用CR-400色差儀測(cè)定，測(cè)量結(jié)果用亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）表示。色差值（ΔE）的計(jì)算公式如下：

1.2.3.4 微觀結(jié)構(gòu) 發(fā)酵雜豆蛋白凝膠樣品的微觀結(jié)構(gòu)測(cè)定參考 Liu 等[21]的方法。采用日立 SU8010掃描電鏡，配有冷凍固定裝置。低溫固定是將少量樣品放置在樣品專用槽上，通過超快速冷卻技術(shù)將溫度降至液氮（-196 ℃）或以下。將冷凍固定試樣在真空條件下進(jìn)行低溫?cái)嗔眩杂^察其內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)，電壓為15 kV。

1.2.4 發(fā)酵雜豆蛋白凝膠胃腸道消化特性研究

1.2.4.1 動(dòng)態(tài)模擬胃腸道消化 參考Pongmalai等[22]的方法，配制模擬胃液和模擬腸液并對(duì)體外模擬胃腸道消化模型的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。模擬胃液（SGF）：緩沖液KCl（6.9 mmol/L）、NaHCO3（25 mmol/L）、KH2PO4（0.9 mmol/L）、NaCl（47.2 mmol/L）、（NH4）2CO3（0.5 mmol/L）和MgCl2（H2O）6（0.1 mmol/L），用緩沖液配制胃蛋白酶（0.27 g/L）和粘蛋白（1.5 g/L），pH調(diào)至1.6，置于37 ℃水浴中20 min激發(fā)酶的活力。模擬腸液（SIF）：緩沖液為KH2PO4（0.8 mmol/L）、KCl（6.8 mmol/L）、NaCl（38.4 mmol/L）、NaHCO3（85 mmol/L）和MgCl2（H2O）6（0.33 mmol/L），用緩沖液配制胰酶（5.62 g/L）和膽鹽（8.17 g/L），pH調(diào)至7.0，置于37 ℃水浴中20 min激發(fā)酶的活力。

消化開始前，調(diào)節(jié)溫度設(shè)置為37 ℃并提前預(yù)熱。預(yù)熱結(jié)束后，在胃中加入0.6 mL的SGF，再注入5 mL的樣品。設(shè)置設(shè)備運(yùn)行參數(shù)：模擬胃液、腸液注入速度52 μL/min；排空速度104 μL/min；胃擠壓頻率3 cpm，胃滾動(dòng)頻率12 cpm，腸滾動(dòng)頻率36 cpm，消化時(shí)間為3 h，在腸消化0、30、90及180 min分別取模擬消化樣品。取樣后用于乳酸菌活菌計(jì)數(shù)樣品不經(jīng)滅酶過程直接測(cè)定，用于可溶性蛋白、肽含量測(cè)定的樣品置于沸水浴滅酶處理5 min后進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4.2 肽含量測(cè)定 參照吳寒等[23]的方法進(jìn)行肽含量的檢測(cè)。取不同消化時(shí)間的樣品200 μL，加入等體積10%三氯乙酸（w/w），充分混勻后在20 ℃條件下靜置沉淀4～5 h，離心15 min（5000 r/min，4 ℃）后收集上清液。取5 μL上清液，加入200 μL OPA反應(yīng)試劑，室溫下反應(yīng)2 min，在340 nm波長下測(cè)定吸光值，以胰酪蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲方程為y=0.1885x+0.1516，R2=0.9981，計(jì)算肽含量（μg/mL）。

1.2.4.3 可溶性蛋白含量測(cè)定 參照李洋[24]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）進(jìn)行可溶性蛋白含量測(cè)定。準(zhǔn)確吸取1 mL樣液與5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液混勻，室溫下反應(yīng)5 min，在595 nm波長下測(cè)定吸光值。根據(jù)以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲方程為y=0.1429x+0.3075，R2=0.9922，計(jì)算可溶性蛋白含量（μg/mL）。

1.2.4.4 乳酸菌活菌計(jì)數(shù) 乳酸菌活菌數(shù)參照Feng等[25]的方法，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。具體方法是：吸取雜豆凝膠消化產(chǎn)物100與900 μL無菌生理鹽水（0.85%，v/v）充分混合后梯度稀釋至一定倍數(shù)，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)48 h計(jì)菌落總數(shù)，測(cè)定乳酸菌活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，應(yīng)用Duncan檢測(cè)對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種雜豆蛋白提取物的主要成分分析

四種雜豆蛋白提取物的主要成分含量如表1所示。由表1可知，四種雜豆蛋白提取物蛋白質(zhì)含量均達(dá)80%以上，其中，LP蛋白質(zhì)含量最高，CP蛋白質(zhì)含量最低，四種雜豆蛋白含量均具有顯著差異性（P＜0.05）。PP和RKP脂肪含量較高于CP與LP。四種雜豆蛋白中RKP碳水化合物含量最低，CP、LP和PP碳水化合物含量相似。CP灰分含量為5.81%，顯著高于其他三種雜豆（P＜0.05），RKP、LP與PP灰分含量無顯著差異（P＞0.05）。

表 1 四種雜豆蛋白提取物的主要成分含量Table 1 The content of main components of four pulse proteins

2.2 四種雜豆蛋白種類及濃度對(duì)發(fā)酵速率的影響

四種雜豆蛋白種類及濃度對(duì)發(fā)酵速率的影響如表2所示。發(fā)酵導(dǎo)致四種雜豆蛋白的pH均呈下降趨勢(shì)。由表2可知，下降速率隨pH降低逐漸減緩。四種雜豆蛋白相比，蛋白濃度為0.1%（w/v）的RKP和PP樣品發(fā)酵速率更快；蛋白濃度為1.0%～3.0%（w/v）的LP和RKP樣品發(fā)酵速率更快，這說明低蛋白濃度的RKP和PP和高濃度的LP和RKP發(fā)酵性能更優(yōu)異。此外，高濃度蛋白（2.0%～3.0%，w/v）條件下，pH下降速率減緩，蛋白濃度在3.0%（w/v）的CP、RKP和PP在pH5.5至4.5酸化速率變慢，而3.0%（w/v）的LP酸化速率無明顯變化。說明LP的膠凝過程受蛋白濃度影響較小，而高濃度的CP、RKP和PP可以顯著延緩植物乳桿菌的產(chǎn)酸速率（P＜0.05），這可能與高濃度蛋白具有更強(qiáng)的緩沖作用有關(guān)[26]。四種雜豆蛋白發(fā)酵速率的差異與乳酸菌差異化利用雜豆蛋白作為生長所需氮源密切相關(guān)。四種雜豆蛋白的組成、結(jié)構(gòu)、小分子肽含量均可能導(dǎo)致乳酸菌代謝變化，從而影響產(chǎn)酸速率。郭增旺等[27]發(fā)現(xiàn)球蛋白含量影響了蕓豆蛋白的成膠速率。

2.3 最小臨界凝膠濃度的測(cè)定

不同發(fā)酵時(shí)間及不同pH對(duì)四種雜豆蛋白成膠特性的影響如圖1所示。CP、RKP、LP和PP的最小臨界凝膠濃度（LGC）分別為1.6%（w/v）、1.6%（w/v）、1.4%（w/v）和1.2%（w/v），說明PP可以在較低的蛋白濃度下形成凝膠，其次為LP，而CP和RKP需要較高的濃度才可以形成凝膠。四種雜豆蛋白的LGC值均低于文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌誘導(dǎo)大豆蛋白形成凝膠的LGC值，說明四種雜豆蛋白具有良好的成膠特性[26]。

圖 1 不同蛋白濃度及不同發(fā)酵終點(diǎn)pH對(duì)四種雜豆蛋白成膠特性的影響Fig.1 Effects of different protein concentrations and fermentation terminal pH values on the gelatinization characteristics of four pulse proteins

四種雜豆LGC值的差異可能與各雜豆蛋白組成及蛋白結(jié)構(gòu)差異密切相關(guān)。安馨等[14,16]研究表明雜豆蛋白中球、清蛋白含量均占80%以上，但其比例各不相同，如蕓豆、鷹嘴豆、小扁豆球蛋白含量較高，而清蛋白含量較低；豌豆蛋白中球蛋白含量較低（56.6%±0.60%），清蛋白含量較高（34.0%±4.34%）。這可能是造成PP的LGC值較低的原因之一。此外，提高蛋白濃度促使雜豆蛋白在較高的pH條件下形成凝膠。當(dāng)?shù)鞍兹芤簼舛忍嵘?.0%（w/v）時(shí)，CP 和 LP 初始凝膠 pH 由 4.5 上升至 5.0，RKP 和 PP初始凝膠pH分別由4.5和5.0上升至5.5，這可能與四種雜豆蛋白中游離巰基等基團(tuán)含量的差異有關(guān)，Yang等[28-29]研究指出PP和RKP的游離巰基含量高于LP和CP的游離巰基含量，且游離巰基含量可能與蛋白凝膠點(diǎn)呈正相關(guān)。

表 2 雜豆蛋白種類及濃度對(duì)發(fā)酵速率的影響Table 2 Effects of four pulse proteins and concentrations on the fermentation rate

2.4 四種雜豆蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性分析

根據(jù)雜豆蛋白的最小凝膠濃度和發(fā)酵過程中pH下降規(guī)律，選取蛋白濃度在2.0%（w/v），發(fā)酵終點(diǎn)pH為5.0的四種雜豆蛋白凝膠做進(jìn)一步研究。

四種雜豆蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性如表3所示。由表3可知，雜豆蛋白種類對(duì)凝膠彈性和膠粘性的影響差異不顯著（P＞0.05）。CP與LP蛋白凝膠的硬度顯著高于RKP與PP（P＜0.05），且LP蛋白凝膠的硬度顯著高于CP（P＜0.05），說明CP與LP的蛋白凝膠機(jī)械強(qiáng)度更高，特別是LP蛋白凝膠，而RKP與PP硬度較低。CP、PP和RKP蛋白凝膠的內(nèi)聚性顯著高于LP（P＜0.05），說明LP蛋白凝膠內(nèi)部結(jié)合力更小，這可能與四種雜豆蛋白組成差異有關(guān)。四種雜豆蛋白凝膠硬度和彈性值與文獻(xiàn)報(bào)道的乳酸菌發(fā)酵大豆蛋白凝膠相比較低，說明雜豆蛋白形成的凝膠比較柔軟，可能與LGC值較低有關(guān)[9]。

表 3 四種雜豆蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性Table 3 Textural properties of four pulses protein gels

2.5 四種雜豆蛋白發(fā)酵前后的色差分析

凝膠的色澤是影響其外觀和認(rèn)可度的重要指標(biāo)之一，其中L*代表亮度，a*為紅度值，b*為黃度值，ΔE越大表示樣品的顏色變化的程度越大。

四種雜豆蛋白發(fā)酵前后的色澤的變化如表4所示。由表4可知，發(fā)酵后四種雜豆蛋白的L*值均增大，說明四種雜豆蛋白發(fā)酵后凝膠亮度增加，其中，LP的亮度提升程度較高。這可能與凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增大了光反射的程度有關(guān)[30]。有研究[31]證明孔隙更小的凝膠網(wǎng)絡(luò)會(huì)導(dǎo)致反射光增強(qiáng)，因此亮度值更大。這與樣品的微觀結(jié)構(gòu)相符。此外，CP、LP和PP的a*值均偏向綠色且b*值均偏向黃色，而RKP的a*值偏向紅色且b*值偏向黃色。發(fā)酵沒有改變四種雜豆蛋白的a*、b*值偏向，但改變了其偏向程度。發(fā)酵后CP、LP和PP蛋白的a*、b*絕對(duì)值增大，而RKP的a*、b*絕對(duì)值減小，說明發(fā)酵增加了CP、LP和PP的黃綠程度且降低RKP的紅黃程度。從總色差（ΔE）的測(cè)定來看，發(fā)酵后四種雜豆蛋白凝膠樣品的總色差均減小且總色差仍差異顯著（P＜0.05），其中，CP和LP樣品降幅明顯小于RKP和PP，說明LP和CP顏色變化程度更淺。這與計(jì)紅芳等[32]研究報(bào)道豌豆蛋白與牛肉鹽溶蛋白共混形成凝膠后樣品亮度增大以及紅度和黃度偏向加深相符。

表 4 四種雜豆蛋白發(fā)酵前后的色差分析Table 4 Chromatic aberration between the four pulse proteins before and after fermentation

2.6 四種雜豆蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

微觀結(jié)構(gòu)的表征是研究凝膠結(jié)構(gòu)與特性的重要手段。四種雜豆蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。由圖2可知，所有雜豆蛋白凝膠樣品的微觀結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，且不同雜豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在一定差異。RKP和PP樣品均具有帶非均質(zhì)孔[33]和大量粗鏈的凝膠結(jié)構(gòu)，其孔徑約為20 μm。而CP和LP呈現(xiàn)出密集和精細(xì)的蛋白三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，其孔徑約為2.5 μm。與LP相比，CP的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)含有大量粗鏈且網(wǎng)孔分布不均勻，LP形成一種無粗鏈結(jié)構(gòu)、孔洞均勻的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)。聶麗潔[16]曾指出球蛋白含量更高的CP和LP蛋白凝膠結(jié)構(gòu)更致密。Xing等[34]研究報(bào)道乳酸菌發(fā)酵的大豆生物豆腐中呈現(xiàn)類似的蜂窩狀凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[35]。

圖 2 四種雜豆蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of four pulses protein gels

2.7 雜豆蛋白凝膠對(duì)動(dòng)態(tài)胃腸道消化的pH影響分析

四種雜豆蛋白凝膠對(duì)胃腸道消化pH的影響如圖3所示。雜豆蛋白凝膠中蛋白質(zhì)等物質(zhì)具有一定的緩沖作用。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可能引起酶解特性[36]的變化。由圖3可知，腸道消化的初始pH為7.0，在腸消化前期（0～30 min），LP的腸消化液的pH最高，PP的腸消化液pH最低，各樣品間均存在顯著差異（P＜0.05），這可能與其胃腸轉(zhuǎn)換速率及堿性氨基酸的釋放有關(guān)[37]。在腸消化中期和后期（30～180 min），RKP與PP蛋白的腸消化液pH變化比CP與LP更劇烈，說明CP與LP蛋白對(duì)胃腸液的緩沖能力高于RKP與PP蛋白，這可能與致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)更耐受胃腸液的環(huán)境[38]有關(guān)。有研究表明雜豆蛋白中球蛋白在胃腸消化過程中緩沖能力高于清蛋白[16]，這可能是球蛋白含量高的CP和LP蛋白凝膠樣品具有更強(qiáng)的緩沖能力的原因。

圖 3 四種雜豆蛋白凝膠對(duì)動(dòng)態(tài)胃腸道消化pH的影響Fig.3 Effects of four pulses protein gels on the pH of dynamic gastrointestinal digestion

2.8 雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中可溶性蛋白含量的變化

四種雜豆蛋白凝膠在腸消化中可溶性蛋白的含量如圖4所示。可溶性蛋白含量表征容易發(fā)生酶水解的蛋白質(zhì)數(shù)量指標(biāo)[39]。由圖4可知，四種蛋白凝膠經(jīng)動(dòng)態(tài)胃腸消化后可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在消化早期（0～30 min），各組雜豆凝膠可溶性蛋白呈上升趨勢(shì)且于腸消化30 min達(dá)到頂點(diǎn)，表明可溶性蛋白在消化早期呈現(xiàn)釋放過程。其中，LP消化產(chǎn)物可溶性蛋白含量最高，其次為CP和RKP，而PP可溶性蛋白顯著較低（P＜0.05）。這一研究結(jié)果說明LP、CP與RKP凝膠在腸道蠕動(dòng)、pH作用與消化酶解作用下更易釋放可溶性蛋白。在消化中期和后期（30～180 min），各組樣品可溶性蛋白含量下降，這可能是由于排空或蛋白降解[40]為小分子肽所致，CP和LP蛋白凝膠的可溶性蛋白含量減少量顯著低于RKP和PP蛋白凝膠（P＜0.05），可能與其較為致密的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)。Yang等[41]研究指出致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)會(huì)延緩胃消化過程的蛋白質(zhì)水解速率。

圖 4 四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 The dynamic change of soluble protein content in four pulse protein gels at gastrointestinal digestion

2.9 雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化過程中肽含量的變化

四種雜豆蛋白凝膠在腸消化時(shí)間（0、30、90、120 min）的消化產(chǎn)物中肽的含量變化如圖5所示。由圖5可知，在腸消化早期（0～30 min），CP與LP蛋白凝膠釋放的肽含量明顯高于RKP與PP蛋白凝膠且CP與LP蛋白凝膠的肽含量均為RKP和PP蛋白凝膠的兩倍左右，說明CP和LP凝膠酶解速率較快，這可能與蛋白酶對(duì)CP和LP蛋白水解作用更強(qiáng)和可溶性蛋白底物量更高有關(guān)[42]；在消化中期和后期（30～180 min），盡管RKP和PP消化產(chǎn)物的肽含量得到了一定程度的提升，但CP和LP的肽含量仍顯著高于RKP和PP（P＜0.05），且CP與LP之間的肽含量仍存在顯著差異（P＜0.05），這說明不同雜豆在乳酸菌作用下形成的凝膠及結(jié)構(gòu)差異可能蛋白酶切位點(diǎn)暴露的差異，從而影響其消化效率。結(jié)果表明，結(jié)構(gòu)較為致密的凝膠（CP和LP）釋放肽的能力優(yōu)于結(jié)構(gòu)較為疏松的凝膠（RKP和PP）。四種雜豆蛋白凝膠肽含量變化趨勢(shì)與大豆蛋白凝膠的體外消化特性相似，研究表明，乳酸菌誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)消化及釋放肽有一定的延緩作用[43]。這與本研究結(jié)果相似。

圖 5 四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道消化中肽含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律Fig.5 The dynamic change of peptide content in four pulse protein gels at gastrointestinal digestion

2.10 雜豆蛋白凝膠在動(dòng)態(tài)胃腸消化中對(duì)植物乳桿菌B1-6活力的保護(hù)作用研究

乳酸菌通常以口服的形式進(jìn)入人體，所以只有耐受胃及十二指腸道的嚴(yán)苛環(huán)境，到達(dá)小腸才能發(fā)揮生理功效。因此，對(duì)植物乳酸桿菌在不同雜豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)內(nèi)的耐受胃腸消化的程度進(jìn)行了比較研究。

四種雜豆蛋白凝膠在胃腸道中消化對(duì)植物乳桿菌B1-6活菌數(shù)的影響如圖6所示。由圖6可知，經(jīng)動(dòng)態(tài)胃腸消化后，四種雜豆蛋白凝膠中植物乳桿菌的存活率均呈下降趨勢(shì)。在消化前期與中期（0～90 min），CP、LP與PP樣品的植物乳酸桿菌存活率顯著高于RKP（P＜0.05）。在消化后期（90～180 min），所有雜豆蛋白的植物乳桿菌存活率均下降至最低且四組凝膠不存在顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，消化前期和中期致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)作用更佳，凝膠結(jié)構(gòu)在消化后期的解構(gòu)導(dǎo)致植物乳桿菌的保護(hù)作用的大幅削弱。這與伍鵬等[44]報(bào)道發(fā)酵乳中酪蛋白在胃腸道消化環(huán)境中形成結(jié)構(gòu)致密的凝聚物對(duì)乳酸菌有保護(hù)作用類似。李軍等[45]曾報(bào)道腸道消化階段末期動(dòng)物雙歧桿菌活菌數(shù)大量下降，這與本研究結(jié)果一致。

圖 6 胃腸道消化過程中四種雜豆蛋白凝膠中植物乳桿菌活菌數(shù)的變化規(guī)律Fig.6 Changes in vitality of Lactobacillus plantarum in four pulses protein gels at the gastrointestinal digestion

3 結(jié)論

本文對(duì)植物乳桿菌引導(dǎo)四種雜豆（鷹嘴豆、紅蕓豆、小扁豆、豌豆）蛋白凝膠形成及特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：鷹嘴豆蛋白、紅蕓豆蛋白、小扁豆蛋白和豌豆蛋白的最小臨界凝膠濃度（LGC）分別為1.6%（w/v）、1.6%（w/v）、1.4%（w/v）和1.2%（w/v）；質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果表明CP和LP蛋白凝膠硬度顯著高于RKP和PP蛋白凝膠（P＜0.05），微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果表明CP和LP形成的凝膠具有較為致密而均勻的三維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)，而RKP與PP形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)較為疏松。采用動(dòng)態(tài)模擬胃腸道消化模型對(duì)具有不同結(jié)構(gòu)特征的四種雜豆蛋白凝膠進(jìn)行消化特性評(píng)估，結(jié)果表明，CP、LP蛋白在消化早、中期的可溶性蛋白和肽含量顯著高于另兩組蛋白凝膠（RKP和PP），且CP、LP蛋白凝膠對(duì)植物乳桿菌B1-6的保護(hù)作用顯著優(yōu)于另兩組蛋白凝膠。本研究結(jié)果有助于加深對(duì)四種雜豆蛋白在乳酸菌發(fā)酵作用下表現(xiàn)出差異性膠凝能力及消化特性的影響認(rèn)知，為明確不同雜豆蛋白在乳酸菌作用下的發(fā)酵性能、凝膠特性及營養(yǎng)特性提供了理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。