生物表面活性劑鼠李糖脂發(fā)酵液分離純化研究

李麗(南京華獅新材料有限公司，江蘇 南京 211800)

0 引言

表面活性劑結(jié)構中一般含有疏水基團和親水基團[1]，這樣的結(jié)構使其在有機溶劑和水中均可溶。目前市場上絕大多數(shù)的表面活性劑都是通過化學法合成而來，在其生產(chǎn)和使用的過程中都會產(chǎn)生嚴重的環(huán)境污染問題。與傳統(tǒng)的化學合成表面活性劑不同，生物表面活性劑是真菌、細菌和酵母等在特定的生長條件下分泌的代謝產(chǎn)物，是一種由微生物合成的表面活性兩親性物質(zhì)，屬于天然表面活性劑[2-3]。

與化學合成的表面活性劑相比，生物表面活性劑不僅表面活性更優(yōu)良，而且還具有物理化學穩(wěn)定性好、低毒、易降解、環(huán)境友好及生物相容性好等優(yōu)點[4]。某些生物表面活性劑還具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等醫(yī)學藥理作用和免疫功能。其中，鼠李糖脂是目前研究最廣泛的生物表面活性劑之一[5]，作為一種陰離子生物表面活性劑，鼠李糖脂在生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、二次采油等方面具有很高的應用潛力。

1 鼠李糖脂簡介

1.1 鼠李糖脂的化學結(jié)構及其理化性質(zhì)

鼠李糖脂于1949年第一次被發(fā)現(xiàn)報告，一般是由銅綠假單胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，其種類多達60種。作為生物表面活性劑的成員，和其他的表面活性劑一樣，鼠李糖脂的結(jié)構也由兩部分組成，一部分是極性基團，另一部分是碳氫鏈組成的非極性基團。這使得鼠李糖脂不僅親水而且親油，因此，鼠李糖脂不僅溶于甲醇、氯仿和乙醚等有機溶劑，而且在堿性水溶液的溶解性也很優(yōu)良。鼠李糖脂的分子結(jié)構中一般含有一到兩個的鼠李糖分子與一到兩個飽和或不飽和的脂肪酸長鏈(C8-C24)[6-7]，其中鼠李糖分子呈親水性，脂肪酸碳鏈呈疏水性。根據(jù)鼠李糖脂分子結(jié)構中含有的鼠李糖分子的數(shù)目，鼠李糖脂可分為單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂；根據(jù)鼠李糖脂分子結(jié)構中所含的脂肪酸碳鏈數(shù)量，鼠李糖脂可以分為單脂鼠李糖和雙脂鼠李糖。因此，鼠李糖脂的各種同系物可被總結(jié)歸納為4類，即單糖單脂、單糖雙脂、雙糖單脂、雙糖雙脂結(jié)構。

在微生物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂的過程中，菌株的生產(chǎn)、培養(yǎng)時間和碳源等因素會影響單、雙鼠李糖脂的比例，而鼠李糖脂的化學結(jié)構不同，其理化性質(zhì)和生物學功能也有所不同。單、雙不同結(jié)構的鼠李糖脂的臨界膠束濃度(CMC)值分別約在40 mg/L和5 mg/L左右，親水性鼠李糖脂的CMC值約200 mg/L，而以不飽和脂肪酸為基本結(jié)構的鼠李糖脂CMC值則為120 mg/L。鼠李糖脂在不同pH的水溶液中呈現(xiàn)不同形態(tài)，一般情況下隨pH值的升高，鼠李糖脂水溶液的粒徑尺寸減小。根據(jù)文獻報道，鼠李糖脂在酸性(pH約4～5)條件下，鼠李糖脂會形成囊泡；在微酸性(pH約6.0～6.6)條件下，鼠李糖脂分子間相互作用，在溶液中以薄片結(jié)構或脂質(zhì)顆粒存在；在中性或者堿性條件下，鼠李糖脂分子間相互交聯(lián)形成小尺寸的膠束，以膠束形式存在[8]。如溶液pH為7.35時，單鼠李糖脂分子間相互聚集形成分子量為38 kDa的膠束；溶液pH為8.5時，雙鼠李糖脂分子之間相互聚集形成分子量為7 kDa的膠束[9]。另外，加入乙醇會破壞鼠李糖脂膠束。龍旭偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在pH為8乙醇加入量為30%的條件下，鼠李糖脂的水力學粒徑降至1 nm以下。

1.2 鼠李糖脂的優(yōu)點及用途

鼠李糖脂不僅具有較好的乳化、破乳、消泡、增溶、濕潤等功能，還具有低毒、環(huán)境友好、易生物降解、降低表面張力的能力顯著等優(yōu)點，最重要的是，在強酸強堿高鹽等極端環(huán)境下較穩(wěn)定。因此，鼠李糖脂在生物醫(yī)藥、石油化工、食品、環(huán)境保護及農(nóng)業(yè)等領域被廣泛應用。

在石油開采中，添加鼠李糖脂降低水、原油、巖石間的界面張力，可以提高原油采收率。據(jù)文獻[10]報道，鼠李糖脂濃度為338 mg/L左右可以回收油泥中92%以上的原油；在原油體系中添加鼠李糖脂，20天后原油降解率由35.7%增加至57.6%；鼠李糖脂濃度為500 mg/L左右時，可提高25%～45%的原油采收率。

在醫(yī)藥和食品工業(yè)中，鼠李糖脂因具有抑菌、抗病毒、增溶等特性被廣泛應用。國外課題組采用三種銅綠假單胞菌，使用不同類型的碳源發(fā)酵得到鼠李糖脂混合物。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該鼠李糖脂混合物對很多革蘭氏陽性菌均有抗菌特性；鼠李糖脂對真菌及植物病原菌也表現(xiàn)出優(yōu)良的抑制效果。在醫(yī)藥行業(yè)中，也發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂對病毒和線蟲等具有抵抗和殺滅的功效。在農(nóng)業(yè)行業(yè)中，有學者為了增強保鮮效果，使用鼠李糖脂和蔗糖酯等制成的涂膜保鮮劑，保鮮效果顯著。

在日化和環(huán)境修護方面，良好的洗滌性能和表面活性使鼠李糖脂可用于織物表面污漬的清洗和土壤中重金屬離子和有機物的洗脫。將10%的鼠李糖脂添加至去污劑中，用于織物表面的清潔洗滌，發(fā)現(xiàn)對織物表面的食用油污漬去除率達30%以上，對巧克力及蛋白類污漬去除率高達90%左右。鼠李糖脂作為陰離子型表面活性劑可以螯合土壤中的重金屬陽離子，尤其對Cd2+的螯合能力最強，可用于重金屬離子污染的土壤修復。龍旭偉等[10]使用鼠李糖脂發(fā)酵液直接洗滌被蛋白污染的膜，將pH為9鼠李糖脂濃度為300 mg/L的溶液作為膜清洗劑，清洗膜設備1 h后，膜元件的水通量恢復至新膜的95%左右。

1.3 鼠李糖脂的生產(chǎn)

目前主要采用發(fā)酵的方法生產(chǎn)鼠李糖脂，發(fā)酵工藝包括固態(tài)發(fā)酵、液態(tài)發(fā)酵和泡沫發(fā)酵等。固態(tài)發(fā)酵是在有一定濕度的水下溶性固態(tài)基質(zhì)中，由一種或多種微生物參與的一個生物反應過程，該發(fā)酵工藝過程中沒有或幾乎沒有自由水存在。該工藝具有投資少、成本低、易操作以及下游處理比較簡單等優(yōu)點，但該工藝發(fā)酵周期長、勞動強度大、工藝參數(shù)控制困難，不適合大規(guī)模在生產(chǎn)中應用。泡沫發(fā)酵工藝是在發(fā)酵的同時耦合了分離方法，可以部分實現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵。該工藝的優(yōu)點是在發(fā)酵的同時進行了產(chǎn)物的分離純化，但通過該工藝得到的鼠李糖脂中含往往有大量的菌體，純度較低，而且泡沫溢出口和補料口的染菌風險較大。液體發(fā)酵是指將物料首先制備成液態(tài)，再將微生物接入而產(chǎn)生的生物反應過程，具有速度快、成本低和產(chǎn)量高等優(yōu)點，是鼠李糖脂生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵工藝。

銅綠假單胞菌是鼠李糖脂的主要產(chǎn)生菌，發(fā)酵所用的碳源一般分為疏水性碳源和親水性碳源，其中疏水性碳源一般為植物油、廢油和烴類等，親水性碳源一般為葡萄糖、甘油、乙醇等。發(fā)酵過程中還需要用到氮源，一般選用硝酸銨、尿素以及一些無機氮源等。選擇合適的碳源和氮源，通過實驗探索出最優(yōu)的C/N比例，而后通過對發(fā)酵時間，發(fā)酵過程中的溫度、pH、溶氧等條件的探索，找到最優(yōu)實驗工藝參數(shù)發(fā)酵得到高產(chǎn)量的鼠李糖脂發(fā)酵液。

2 鼠李糖脂發(fā)酵液的分離純化

鼠李糖脂在微生物發(fā)酵液中的產(chǎn)量較低，約3 g/L。發(fā)酵液中主要含有鼠李糖脂、菌體、未消耗完的培養(yǎng)基以及生產(chǎn)菌的其他代謝產(chǎn)物等，成分比較復雜。因此，從發(fā)酵液中提取鼠李糖脂的難度較大。根據(jù)文獻中報道，鼠李糖脂發(fā)酵液的分離純化成本約占鼠李糖脂生產(chǎn)總成本的60%～70%。

鼠李糖脂易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑，在中性水溶液中溶解性良好，在酸性條件下容易形成沉淀析出，在堿性條件下形成小尺寸的膠束。因此，鼠李糖脂發(fā)酵液的分離純化方法有很多種，主要包括離心法、酸沉法、萃取法、膜分離法、吸附法及泡沫分離法等。

2.1 酸沉-萃取法

酸沉-萃取法是利用鼠李糖脂在酸性條件下容易沉淀，且易溶于有機溶劑的特性。具體操作如下：首先將發(fā)酵液離心后去除菌體，在離心后的上層清液中，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)上清液的pH至1.5～2.0，此時，發(fā)酵液中出現(xiàn)混濁懸浮狀沉淀；而后將其置于0～4 ℃環(huán)境中過夜，第二天取沉淀加入有機溶劑進行萃取，觀察萃取效果。若效果不好，可進行復萃，最后將所有萃取液收集，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)后得到鼠李糖脂。萃取劑一般選用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇及氯仿等，或者將兩種有機溶劑按照一定比例混合后使用。該方法應用范圍廣、易操作、可通過調(diào)節(jié)有機溶劑的比例改變極性、操作靈活。但這種方法擇性差、收率低、過程中需要使用大量的鹽酸及有機溶劑、廢液處理難度大，大大限制了該方法的大規(guī)模使用。

2.2 吸附法

吸附法是利用吸附材料的吸附能力，其中吸附材料一般是苯酚甲醛離子交換樹脂、聚苯乙烯樹脂或者活性炭等。該類型材料同時具有吸附和解吸作用，可以對發(fā)酵液中的生物表面活性劑進行選擇吸附，使其富集吸附在材料表面，而后再選擇合適的洗脫液將其洗脫。具體操作是：首先，將鼠李糖脂發(fā)酵液離心后取上層清液；第二步，將上層清液倒入裝有吸附劑的吸附柱中，用緩沖溶液調(diào)節(jié)其pH，而后用去離子水洗滌吸附劑，以便去除可溶性物質(zhì)及游離脂肪酸；第三步，使用合適的有機溶劑將鼠李糖脂洗脫；最后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到鼠李糖脂。該方法可以連續(xù)進行，吸附劑可循環(huán)使用，所需設備簡單，但過程中會使用有機溶劑作為洗脫液，產(chǎn)生較多的廢液，同時鼠李糖脂收率較低。

2.3 泡沫分離法

泡沫分離法是利用生物表面活性劑在臨界膠束濃度以上形成膠束的特性，是一種連續(xù)提取的新方法。具體操作是：在發(fā)酵時，采用進氣管向發(fā)酵液通入空氣產(chǎn)生氣泡，氣泡從發(fā)酵液底部移動到頂部破裂。鼠李糖脂作為表面活性物質(zhì)優(yōu)先吸附在氣泡上，隨氣泡上升到液體表面形成泡沫。通過收集泡沫即可得到鼠李糖脂。泡沫分離法具有成本低、效益高、空間需求小、操作快速以及能夠?qū)Ξa(chǎn)物進行回收的同時進行濃縮等優(yōu)點，但該方法只適用于發(fā)酵液中鼠李糖脂濃度低和能夠在分離柱中停留時間長的情況，且產(chǎn)物中有效物純度低，含有較多的菌體，需要進行二次純化。

2.4 膜分離法

膜分離法是利用膜孔的篩分作用對物質(zhì)進行選擇性分離的處理技術。在一定壓力下，當發(fā)酵液流經(jīng)膜表面時，分子量小于膜孔徑的小分子溶質(zhì)透過膜孔，分子量大于膜孔經(jīng)的大分子物質(zhì)被截留，從而實現(xiàn)發(fā)酵液中大、小分子的分離，達到流體分離純化和濃縮的目的。同時，該方法還利用了鼠李糖脂在酸堿條件下粒子的顆粒尺寸不同的特性。具體的操作方法是：首先將發(fā)酵液離心后取上清液，在上清液中加入濃鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至5左右，鼠李糖脂在酸性條件下會形成脂粒，更易于被膜孔截留；第二步，使用超濾膜在一定壓力下過濾上述上清液，鼠李糖脂以大尺寸存在的脂粒結(jié)構和大分子的蛋白分子量大于膜孔徑被超濾膜截留，而分子量小于膜孔徑的小分子無機鹽類和色素透過膜；第三步，在上述膜過濾后的濃縮液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9左右，鼠李糖脂在該條件下以小尺寸膠束形式存在，更易于透過膜孔，若在該濃縮液中加入一定比例的乙醇等小分子有機溶劑，會破壞鼠李糖脂膠束，使其以小分子形式存在，更易于透過膜孔；第四步，使用超濾膜在一定壓力下過濾上一步的濃縮液，鼠李糖脂有效物透過膜孔，大分子雜質(zhì)被截留，從而達到分離純化的目的。

3 結(jié)語

生物表面活性劑與化學合成的表面活性劑一樣具有表面活性，同時具有抗菌、抗病毒、穩(wěn)定性強、無毒、易降解及環(huán)境友好等優(yōu)點，因此，引發(fā)越來越多的關注研究。鼠李糖脂是目前研究最廣泛的生物表面活性劑之一，在醫(yī)藥食品、生物化工、環(huán)境保護及二次采油等方面具有很高的應用潛力。鼠李糖脂是采用銅綠假單胞菌，通過生物合成路徑產(chǎn)生的，發(fā)酵時需要選擇合適的碳源、氮源及培養(yǎng)基，控制合適的發(fā)酵條件。

從發(fā)酵液中提取鼠李糖脂的難度較大，分離純化方法主要包括離心法、酸沉法、萃取法、膜分離法、吸附法、泡沫分離法等。各種方法均有不同的優(yōu)缺點，一般根據(jù)不同的需要和用途，對鼠李糖脂發(fā)酵液采用不同的分離純化方法，可能使用單一的某種方法也可能多種方法結(jié)合使用。