淺議馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)在延安地區(qū)的應(yīng)用與發(fā)展

鄧長芳 鄭太波 杜紅梅 黨菲菲 霍延梅 李 媛

（延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 陜西延安 716000）

馬鈴薯具有抗旱、抗寒、耐貧瘠的特點，是延安市僅次于玉米的第二大糧食作物，種植歷史悠久，種植面積常年維持在6.67萬hm2左右，平均產(chǎn)量10～15 t/hm2[1]。馬鈴薯在無性繁殖過程中極易受到病毒侵染，目前已發(fā)現(xiàn)的侵害馬鈴薯的病毒有30多種，其中危害程度嚴(yán)重的有 PVY、PLRV、PVX、PSTV、PVA和PVS 6種[2]。這些病毒的危害程度會隨著馬鈴薯的世代疊加而逐年加劇，從而引起馬鈴薯植株愈加矮小，葉片卷曲，嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量和營養(yǎng)價值[3]。馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)是利用馬鈴薯細胞的全能性及病毒在馬鈴薯不同部位分布不同的特性，應(yīng)用無菌技術(shù)在培養(yǎng)基中培育馬鈴薯植株分離組織和細胞的技術(shù)[4]，可有效緩解病毒對馬鈴薯的危害，解決馬鈴薯種性退化的問題。該方法能夠在短時間內(nèi)培養(yǎng)大量無病毒苗，同時還保持了馬鈴薯的優(yōu)良性狀[5-6]，已成為馬鈴薯脫毒種薯產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)，優(yōu)質(zhì)便捷的莖尖培養(yǎng)技術(shù)也促進了脫毒種薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本文作者主要總結(jié)了馬鈴薯莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的基本原理、操作流程、影響因素，以及該技術(shù)在延安地區(qū)的應(yīng)用和發(fā)展，以期為馬鈴薯脫毒技術(shù)良種繁殖體系的構(gòu)建和優(yōu)質(zhì)高效的生產(chǎn)種植提供實踐經(jīng)驗，從而有效推動本地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的原理

感染馬鈴薯植株的病毒在植物體內(nèi)并不是均勻分布的，越靠近莖頂端的區(qū)域病毒感染度越低，生長點（0.1～1.0 mm區(qū)域）幾乎不含或很少含有病毒。因此，所謂莖尖培養(yǎng)脫毒就是將馬鈴薯的莖尖或芽尖，在無菌的條件下切取0.1～0.3 mm，接種在提前配制好的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，由此發(fā)育成小植株，再采用電子顯微鏡、指示植物等方法進行病毒鑒定，未表現(xiàn)出病毒病癥的植株即為無病毒植株，用無病毒植株在隔離條件下繁育的薯塊為脫毒種薯[7]。

2 莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的操作流程

2.1 外植體的選取與消毒

選取由種薯長出的幼芽，去除不需要的部分后用洗潔精涮洗，并修剪成2～4 cm的頂芽放入燒杯中用蒸餾水反復(fù)漂洗干凈，濾干水分放入超凈工作臺。用70%酒精消毒10～30 s，酒精蒸發(fā)后剝除外層，用0.1%HgCl2滅菌 5～8 min，蒸餾水涮洗 4～5 次，再用無菌水涮洗8～10次后放入培養(yǎng)皿中待分離。

2.2 培養(yǎng)基的制備

采用MS或MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配成后向100 mL的容器內(nèi)裝入30～40 mL的培養(yǎng)基，密封后放入0.1 MPa、121℃的滅菌鍋內(nèi)消毒滅菌20 min。

2.3 分離與接種

接種前4 h用0.3%高錳酸鉀溶液消毒熏蒸并開紫外燈進行滅菌，接種前20 min打開超級工作臺內(nèi)的紫外燈對實驗所用器材、瓶苗、培養(yǎng)基等進行再次消毒；工作人員在緩沖間換好實驗服用流動水清洗干凈雙手后進入接種室，用70%酒精拭擦雙手特別是指甲處。將要切取的莖尖或莖段等外植體材料放置在生物顯微鏡上，用解剖針或解剖刀將尖端切割成含有一個葉原基（0.1～0.3 mm）的小段；打開培養(yǎng)基瓶蓋，將瓶口放酒精燈火焰上方轉(zhuǎn)動，同時，將鑷子放酒精燈火焰上灼燒消毒，然后用鑷子夾取切割好的莖段或莖尖輕插入培養(yǎng)基內(nèi)。初代培養(yǎng)一般每瓶轉(zhuǎn)接1個莖段或莖尖，完成一瓶接種后，用過的鑷子、解剖刀再次放入95%酒精中消毒，培養(yǎng)瓶及瓶蓋再火烤數(shù)秒后上蓋擰緊；分割完一只外植體材料后要及時更換培養(yǎng)皿中的濾紙，每瓶培養(yǎng)基接種前都要將器械進行消毒滅菌以避免交叉感染。

2.4 離體培養(yǎng)

一般情況下，離體培養(yǎng)的溫度控制在23～25℃，光照度最好在3 000 lx，光照時長16 h，將轉(zhuǎn)接好的培養(yǎng)瓶苗放置于培養(yǎng)室的培養(yǎng)架中培養(yǎng)3～5周的時間。

2.5 病毒鑒定

經(jīng)過莖尖培養(yǎng)得到的植株，可采用電子顯微鏡檢查法、抗血清鑒定法、指示植物法、酶聯(lián)免疫鑒定等方法測定是否攜帶病毒，把有毒植株及早清除掉，保留無毒植株，作為脫毒苗隔離加速繁殖。

3 莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)的影響因素

3.1 培養(yǎng)基的成分

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，決定了組織培養(yǎng)過程的成敗，其主要成分包括水、有機物、無機鹽、植物激素等，除此之外，馬鈴薯培養(yǎng)基內(nèi)還需加入固化劑。目前常用的培養(yǎng)基有Morel、MS、MA、農(nóng)事和革新等[8]。不同品種馬鈴薯所需培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分也不盡同，如費烏瑞它適合氮、磷、鉀濃度較高的培養(yǎng)基[9]；在缺鐵的培養(yǎng)基上，隴薯7號葉片發(fā)黃，但隴薯20號可正常生長[10]；克新1號在常規(guī)培養(yǎng)基和僅含大量元素培養(yǎng)基上，株高、莖粗無顯著差異，說明克新1號對微量元素需求較小[11]。當(dāng)培養(yǎng)基中適當(dāng)添加植物激素，可以提高莖尖成活率，促進莖尖組織分化成苗，但激素用量過低效果不顯著，用量過高則可能會效果相反。即使是同一品種，不同地區(qū)培養(yǎng)基成分也有所不同。因此，在培養(yǎng)過程中，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)氐膶嶋H條件，篩選出適宜的培養(yǎng)基配方進行培養(yǎng)基的制備，通過適宜的培養(yǎng)條件提高莖尖成活率。

3.2 莖尖的選取

莖尖的大小是脫毒效果和莖尖成活的關(guān)鍵。莖尖越大，再生植株越容易存活，但脫毒效果就越??；莖尖越小，雖然脫毒效果理想，但植株成活較難，尤其是PVX和PVY病毒，它們的脫毒效果和莖尖的大小呈負相關(guān)。王秀英等[12]研究認(rèn)為，莖尖大小的最佳選擇一般在0.2 mm以下；而齊恩芳等[13]在隴薯6號中發(fā)現(xiàn)，切取2個葉原基時的莖尖脫毒效果最突出。葉原基決定了莖尖分生組織的生長分化能力，所以莖尖大小應(yīng)以生長點帶的葉原基數(shù)目和其鄰近組織大小為標(biāo)準(zhǔn)，且通常帶1～2個葉原基，這種大小的莖尖才既能脫除大多數(shù)病毒，又能保持一定的成苗率。

3.3 病毒的種類

由于馬鈴薯病毒的種類不同，對莖尖的脫毒效果也有很大的影響。目前，馬鈴薯病毒的脫除難度由易 到 難 排 列 如 下 ：PLRV、PVA、PVY、PAMV、PVM、PVX、PXS和PSIVd，但該順序也會隨病毒株系、培養(yǎng)條件、品種不同而有所變化[14]。研究表明，采用莖尖培養(yǎng)與熱療法能夠成功脫除懷玉山高山馬鈴薯的PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV 病毒[15]；電療法對PVX、PVY、PLRV、PVA、PSTVd 等多種病毒具有明顯的脫除作用[16]。

3.4 培養(yǎng)的條件

馬鈴薯莖尖培養(yǎng)所需的光照度隨發(fā)育時期逐漸增加，莖尖培養(yǎng)初期的最佳光照度是1 000 lx，1個月后增加至2 000 lx，大約2個月，光照度應(yīng)增加至4 000 lx。馬鈴薯莖尖的培育溫度沒有特定要求，但溫度過低和過高都不利于莖尖生長發(fā)育。因此，在標(biāo)準(zhǔn)室溫（25±2）℃培養(yǎng)即可。

4 延安市脫毒馬鈴薯發(fā)展現(xiàn)狀

延安市的馬鈴薯脫毒技術(shù)工作主要由延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所負責(zé)開展。自2005年以來，該所利用組培實驗室對克新1號、大西洋、費烏瑞它、青薯9號等品種進行莖尖脫毒培養(yǎng)，經(jīng)過多年試驗研究，總結(jié)出馬鈴薯 “莖尖脫毒→病毒檢測→初代培養(yǎng)→繼代培養(yǎng)→生根培養(yǎng)→煉苗移栽”脫毒苗繁育體系，“移苗→煉苗→扦插→澆水→施肥→防病蟲→收獲”原原種生產(chǎn)技術(shù)體系和 “脫毒苗→原原種→原種→良種”種薯繁育技術(shù)體系三大體系，建立了市、縣、鄉(xiāng)三級從基礎(chǔ)種到合格種的協(xié)作繁種技術(shù)體系，屬省內(nèi)首創(chuàng)，2015年獲得延安市科學(xué)技術(shù)一等獎。近幾年，通過科技成果有效轉(zhuǎn)化，脫毒種薯普及率明顯提高，截止2018年底，累計繁育馬鈴薯脫毒種苗184.6萬株，原種258.44萬粒，原種94.45 t，一級良種1.17萬t，二級良種4.8萬t，種植脫毒種薯119.02萬畝，脫毒種薯普及率在80%以上，解決了馬鈴薯生產(chǎn)中品種結(jié)構(gòu)不合理、繁種育種體系不健全、脫毒種薯覆蓋率低、栽培技術(shù)缺乏等問題，有效提高了當(dāng)?shù)厥磙r(nóng)的生產(chǎn)水平，加速了馬鈴薯無公害、綠色、有機生產(chǎn)的進程，對提高延安市馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)改良起到了積極的推動作用。