細胞內mRNA翻譯影響因素及翻譯組學的研究進展

馬榮 尚方正 潘劍鋒 戎友俊 王敏 李金泉 張燕軍

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特 010018；2.農業(yè)農村部肉羊遺傳育種重點實驗室，呼和浩特 010018；3.內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，呼和浩特 010018；4.內蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術研究中心，呼和浩特 010018）

蛋白質是基因的功能產物，是細胞功能的主要執(zhí)行者，在發(fā)育、神經發(fā)生、記憶形成和衰老等多種生理過程中起著關鍵作用［1-2］。mRNA 是蛋白質合成的信息藍圖，基于高通量測序的轉錄組測序可以反映細胞中mRNA 的種類和數量，且可以檢測mRNA 的序列突變和可變剪切［3-4］。Maier 等［5］對多個物種的轉錄組和蛋白組進行比較后發(fā)現，mRNA 表達水平與其編碼蛋白質的表達量的相關系數在0.01-0.5 之間，表明mRNA 的表達水平并不能較好地作為判斷蛋白質水平的依據。因此，作為轉錄組和蛋白組之間的“橋梁”——翻譯調控被認為是調節(jié)基因表達的主要機制。翻譯調控是一種快速激活或抑制mRNA 翻譯以響應內源、外源信號的機制，可快速靈活的調節(jié)細胞內蛋白質濃度，實現生理變化、維持體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。翻譯調控紊亂會導致細胞無法維持正常的細胞功能或無法適應不斷變化的環(huán)境條件，從而導致多種疾病［6-7］。翻譯可分為3個階段：起始、延伸、終止。其中，翻譯起始長久以來被認為是翻譯速率的主要限速步驟［8］，是決定蛋白質表達量的關鍵，影響著蛋白質的結構和功能，在細胞增殖、凋亡等方面扮演重要角色［9］。

細胞的生長速率、蛋白質合成速率都與核糖體數目密切相關。生物在不同生長階段、不同生長環(huán)境以及應激條件下都是通過對翻譯速率的調控實現對外界刺激迅速產生反應。翻譯速率的探究有助于科研人員更清晰地了解細胞生命活動的快速變化。因此，本文在概述真核、原核細胞內翻譯機制的基礎上，從影響翻譯速率的主要因素和探究翻譯、翻譯速率的主要技術手段兩個方面綜述了mRNA 翻譯的研究現狀，旨在為更多學者進一步了解生物體內翻譯過程提供參考依據。

1 mRNA 翻譯機制

核糖體是mRNA 進行翻譯的主要場所，主要由核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）和多種核糖體蛋白構成，是一類高度復雜的細胞器。核糖體內部有3 個轉運RNA（transfer RNA，tRNA）結合位點，分別為E、P、A 位點，A 是氨酰-tRNA 結合的位點，P 是肽酰-tRNA 結合的位點，E 是核糖體內空載tRNA 釋放位點。攜有氨基酸的tRNA（氨酰-tRNA）會依次經過A、P 位點，隨后將氨基酸結合于多肽鏈末端，最后以空載tRNA 的形式從E 位點移出［10］。當核糖體遇到終止密碼子時，mRNA 翻譯結束，多肽形成［10］。以上是細胞內mRNA 的翻譯過程，分為3 個階段：起始、延伸和終止。生物體內細胞的翻譯過程是高度保守的［11］，機制也十分相似。然而，由于真核、原核細胞內mRNA 結構的不同，因此兩類細胞的翻譯起始方式有明顯差異，但兩類細胞內的翻譯延伸、終止是相似的［12］。因此本文將分別介紹真核細胞和原核細胞內的翻譯機制。

1.1 真核生物mRNA翻譯機制

真核細胞內存在兩類核糖體識別機制，一類為5′端帽子識別機制，另一類為識別核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）機制。有研究表明，細胞內存在部分RNA（大多為非編碼RNA，如lncRNA、circRNA 等）是通過對IRES 的識別進行翻譯，但真核細胞內大多數mRNA 都是通過對5′端帽子結構的識別進行翻譯。因此，本文以5′端帽子識別機制為例進行簡要介紹。

首先，由支架蛋白eIF4G 和結合蛋白eIF4E 共同識別mRNA 的5′帽子結構。隨后在eIF4G 因子的招募下，eIF4A 與mRNA 結合，eIF4A、eIF4E 和eIF4G 共同構成eIF4F，并在eIF4B 的共同作用下破壞mRNA 5′端的二級結構（如發(fā)夾結構等），這為接下43S 前起始復合物的結合提供條件［13］。與此同時，核糖體40S 小亞基也為mRNA 的結合做準備。為使與eIF2-GTP 結合的甲硫氨酸起始子tRNA（MettRNAi）順利的結合在小亞基的P 位點，翻譯起始因子eIF1 首先結合于小亞基E 點，隨后eIF3、eIF5 依次與E 位點的eIF1 結合，共同占據E 位點；而小亞基A 位點則由翻譯起始因子eIF1A 占據。翻譯起始因子eIF5、eIF3、eIF1 和eIF1A 不僅可以確保MettRNAi 準確結合于核糖體P 位點，而且可以阻止核糖體大、小亞基的結合，進而確保翻譯的順利進行。eIF2 以GTP 的形式（eIF2-GTP） 與Met-tRNAi 結合，并在eIF5 的作用下將Met-tRNAi 遷至小亞基P點。此時，由核糖體40S 小亞基、eIF3、eIF5、eIF1和eIF1A 以及GTP、eIF2 和Met-tRNAi 構成的復合物為43S 前起始復合物。eIF3（位于43S 前起始復合物內）被結合于mRNA 5′端的eIF4G 招募，從而形成48S 前起始前復合物［13-14］；48S 前起始前復合物從5′→ 3′方向掃描，直至找到具有Kozak 序列特征的起始密碼子［15-16］。正確的堿基互補配對改變了48S 前起始復合物的構象，促使翻譯起始因子從復合體中釋放，核糖體大亞基與小亞基結合。此時，mRNA 翻譯起始結束，翻譯延伸開始。

在翻譯延伸階段，起始tRNA（Met-tRNAi）停留在具有延伸能力的核糖體的肽基（P）部位，而氨酰-tRNA 在延伸因子的“護送”下移至核糖體A 位點，A 位點氨酰-tRNA 和P 位點的氨基酸相遇并形成肽鍵。肽鍵形成后，核糖體移至下一密碼子，P 位點的tRNA 從E 位點排出，A 位點的tRNA 帶著合成的肽鏈移至P 位點，而A 位點空出，等待下一個氨基酸。翻譯延伸的過程一直持續(xù)到A 位點遇到終止密碼子（UAG、UGA 或UAA），一旦終止密碼子進入核糖體的A 位點，釋放因子則被招募到A 位點，多肽鏈和tRNA 隨即被釋放，核糖體解離成亞單位，循環(huán)用于下一輪翻譯［17］。真核細胞內mRNA 翻譯機制如圖1所示。

圖1 真核細胞內mRNA 翻譯機制Fig.1 mRNA translation mechanism in eukaryotic cells

1.2 原核生物mRNA翻譯機制

原核細胞內mRNA 的5′ 端通常有SD 序列（Shine-Dalgarno sequence），該序列可與核糖體30S小亞基結合，進而促進mRNA 正確翻譯。此外有研究發(fā)現，原核細胞內也存在一類可以進行翻譯且不含SD 序列的mRNA，但其翻譯起始速率低，且具體機制還不清晰。因此，本文以含有SD 序列的mRNA為例進行簡要介紹。

在翻譯起始階段，翻譯起始因子IF3、IF1 與IF2 的復合物質分別占據30S 小亞基的E、A 位點，其不僅促進翻譯起始tRNA 正確的結合，也阻止核糖體大、小亞基的結合［18-19］。隨著3 個起始因子的加入，核糖體小亞基已準備好與mRNA、起始tRNA結合。mRNA 的SD 序列與核糖體小亞基形成穩(wěn)定的SD：aSD 堿基對，促使小亞基與mRNA 的結合；起始tRNA 則在IF2 的招募下，準確地結合于小亞基的P 位點［20-21］。此時，mRNA、核糖體小亞基、起始tRNA、IF3、IF1 以及IF2 共同構成30S 起始復合物。隨著起始tRNA 的結合，核糖體小亞基的構象發(fā)生變化，IF3 從E 位點脫落［16，22］，促使核糖體50S 大亞基與30S 起始復合物結合。IF2 是大亞基初始對接位點，與大亞基相互作用后可激活IF2-GTP 酶的活性，使IF2-GDP、IF1 被釋放，最終形成完整的70S起始復合物。此時，mRNA 翻譯起始結束，翻譯延伸開始。

原核細胞內mRNA 的翻譯延伸、終止機制與真核細胞高度相似，都是將攜有氨基酸的tRNA 進行易位實現翻譯的延伸，通過核糖體識別終止密碼子并招募釋放因子實現翻譯的終止，因此不再做詳細介紹，原核細胞內mRNA 翻譯機制如圖2所示。

圖2 原核細胞內mRNA 翻譯機制Fig.2 mRNA translation mechanism in prokaryotic cells

2 翻譯速率調控

蛋白質是生命活動的實際執(zhí)行者，其豐度主要由合成和降解兩方面決定［23］。研究發(fā)現，蛋白質的降解常數與蛋白質豐度的R2僅為0.10［23］，表明蛋白質的降解對蛋白質豐度的影響很小［24］，即蛋白質的合成是蛋白質豐度的決定因素。翻譯速率不僅是決定蛋白質豐度的關鍵，也是決定蛋白質折疊的關鍵因素之一，異常的翻譯速率將導致癌癥、神經退行等多種疾?。?5-26］。關于核糖體翻譯速率參數的定義，目前國際尚無定論。2009年Ingolia 等［27］將核糖體的標準化read 數除以mRNA 的標準化read 數，定義為翻譯效率。然而mRNA 的翻譯速率與其結合核糖體的數量并不總呈正相關，當翻譯至mRNA的某一位置停止或暫停時，會導致核糖體聚集，若采用平均核糖體密度描述翻譯速率，將會高估這類基因的翻譯速率。同時大量研究表明，翻譯起始是mRNA 翻譯的主要限速步驟，其速率是決定細胞蛋白質水平的關鍵［28］。在翻譯起始階段，除翻譯起始因子影響著翻譯的進行，還有mRNA 的“特殊序列”（真核細胞Kozak 序列、原核細胞SD 序列）、mRNA的二級結構和起始密碼子等因素決定著翻譯的起始速率。

2.1 存在于mRNA的“特殊序列”

2.1.1 真核細胞mRNA 的Kozak 序列 真核細胞mRNA 常以單順反子的形式存在，其鏈內的5′帽子結構或IRES 可以被核糖體小亞基識別并結合，進而識別起始密碼子、開始翻譯。起始密碼子AUG之所以可以被核糖體小亞基識別，是因其兩側翼序列（通常為GCCACCAUGG）可以與翻譯起始因子結合，進而介導5′帽子結構的mRNA 翻譯，這段序列稱為Kozak 序列。Kozak 序列組成并不是完全一致的，但AUG 上游-3 位的A 或G，下游+4 位的G 卻是高度保守的；同時當序列為GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG 時，mRNA 翻譯效率最高。有大量研究證明，Kozak 序列是影響起始密碼子識別的主要因素之一［29］。例如，釀酒酵母轉錄本中Kozak 序列是小核糖體亞單位穩(wěn)定結合位點，其可促進翻譯更快的啟動［30］；在Kozak 序列-6 位的G 以及-1、-2位的C 可以顯著地提高mRNA 翻譯起始效率［30-31］；當上游開放閱讀框（upstream open reading frames，uORF）的AUG 起始密碼子被放置在一個較不理想的Kozak 序列時，uORF 編碼的肽段表達水平較低［32］。

2.1.2 原核細胞mRNA 的SD 序列 1974年John Shine 和Lynn Dalgarno 在大腸桿菌RBS 序列中發(fā)現有一段富含嘌呤的序列，其可促進翻譯的起始［33］，該序列被命名為Shine Dalgarno（SD）。SD 通常指存在于細菌和古細菌等原核生物中的位于翻譯起始密碼子AUG 上游約8-10 個堿基的核糖體結合位點序列，但也被發(fā)現存在于葉綠體和線粒體轉錄本［34］。SD 序列的組成并不完全相同，其可以與核糖體16S rRNA 的anti-SD 序列（aSD）形成穩(wěn)定的SD：aSD堿基對，進而促進核糖體的招募和mRNA 的翻譯。不同堿基組成的SD 序列與anti-SD 序列的配對程度不同，因此翻譯起始效率也有所不同。例如，藍球藻和萊茵衣藻psbD 基因的SD 序列或起始密碼子中引入突變會大大降低翻譯效率［35］；Barrick 等［36］研究了4 種堿基隨機分布的185 種不同組成的SD 序列，以β-半乳糖苷酶為目標蛋白在大腸桿菌中進行表達，其表達量最高和最低相差3 000 多倍。以上表明，SD 序列通過SD：aSD 堿基配對促進翻譯起始，且結合程度越強翻譯起始速率越高，但其并不是決定翻譯的必要條件。此外，SD 序列與起始密碼子的相對位置也影響著翻譯起始效率。例如，枯草芽孢桿菌的胞內蛋白的SD 序列與起始密碼子間隔7-9 個核苷酸的翻譯起始效率是間隔4 個核苷酸翻譯效率的27 倍［37］；RelA 是一類核糖體依賴性合成酶，其通過與SD 序列中的GGAG 序列結合，干擾核糖體與mRNA 的結合，進而抑制翻譯起始，但其抑制程度取決于GGAG 相對于AUG 的距離，縮短GGAG 與AUG 之間的距離則會消除RelA 介導的抑制作用［38］（圖3）。因此，改變SD 序列的堿基組成或改變SD 序列與起始密碼子的相對位置都對mRNA翻譯起始速率有著重要影響。

圖3 ReIA 在SD 區(qū)介導的翻譯起始抑制Fig.3 Inhibition of translation initiation mediated by ReIA in SD region

2.2 mRNA二級結構

在翻譯起始過程中，雖然翻譯起始因子可以消除mRNA 的二級結構［33］，但對于結構穩(wěn)定的二級或高級結構卻很難消除。因此，mRNA 二級結構對于翻譯速率的影響占主導地位，其通過影響核糖體與mRNA 的結合能力阻礙翻譯起始［28］。5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）是指mRNA 的5′末端帽子結構到起始密碼子之間的一段序列，是核糖體識別重要元件之一［39］。該區(qū)域通常存在核糖體開關、miRNA 靶位點等可以調控mRNA 二級結構穩(wěn)定性的調控元件。例如，在枯草芽孢桿菌中xpt-pbuX mRNA 的5′UTR 存在一個對鳥嘌呤高度敏感的核糖體開關，當鳥嘌呤濃度升高時，適體結構域（aptamer domain，AD）結合鳥嘌呤后構象發(fā)生變化，表達結構域（expression domain，EPD）的抗隔離子結構消失，導致隔離子莖環(huán)結構的形成，使SD 序列和翻譯起始密碼子 AUG 參與配對，阻止核糖體的結合，抑制 xpt-pbuX 的翻譯［40］（圖4）；Gu 等［41］系統(tǒng)地對動物和植物中5′UTR 的二級結構的研究中發(fā)現，被miRNA 靶向的mRNA 的5′UTR 往往具有更加穩(wěn)定的局部二級結構，這種趨勢往往存在于動物中，植物中并不存在。此外有研究表明，miRNA 與靶向的mRNA結合后可招募Ago2蛋白沉積于mRNA的靶標；由于Ago2 蛋白的中心結構域與翻譯起始因子eIF4E極為相似，因此被沉積于mRNA 靶標上的Ago2 蛋白與m7G 帽子結合，阻止eIF4E 的招募，進而阻止eIF4F 的形成，抑制翻譯的起始［42］（圖5）。此外有研究發(fā)現，mRNA 在同一密碼子偏好性的前提下，其二級結構的改變可提高mRNA 的翻譯效率，而當二級結構不發(fā)生改變時，僅使用偏好密碼子并不能提高蛋白質的表達，表明稀有密碼子的使用是通過弱化mRNA 的二級結構進而促進其翻譯［43］。以上結果表明，5′UTR 區(qū)內mRNA 的二級結構影響著翻譯起始速率，且稀有密碼子對翻譯速率的影響也是通過強化/弱化mRNA 的二級結構而實現。

圖4 核糖體開關對xpt-pbuX 的調控Fig.4 Regulation of xpt-pbuX by ribosomal switch

圖5 Ago2 蛋白對翻譯起始的抑制機制Fig.5 Mechanism of Ago2 protein on the inhibition of translation initiation

2.3 起始密碼子

細胞內蛋白質的合成并不是從RNA 分子的任何堿基起始的，而是由存在特異序列的AUG 作為起始密碼子，開始多肽鏈的合成。如果沒有特異序列的存在，這個密碼子則會被單純地讀作鏈內甲硫氨酸的密碼子。Ingoli 等［44］通過對小鼠5 647 個典型蛋白質的起始密碼子研究發(fā)現，有79%蛋白質的起始密碼子是AUG，剩余的21%是同源起始密碼子；CUG、GUG、ACG 和UUG 是最常用的同源密碼子，而密碼子AUU、AUC、AUA 和AGG 出現頻率則較少［45］。有研究表明，起始密碼子及其后一位密碼子類型的改變都影響著mRNA 的翻譯起始速率。例如，在真核細胞中，與同源起始密碼子相比，翻譯起始因子在AUG 處持有更有效的翻譯起始［32］；Stenstrom［46］在大腸桿菌中利用缺少明顯SD 序列特征的基因中發(fā)現改變起始密碼子下一位的密碼子可以促使基因翻譯量增加20 倍之多，證明基因表達量與蛋白序列第二位的密碼子有關，并且高表達蛋白的第二位氨基酸傾向使用腺嘌呤含量高的密碼子編碼。此外，5′UTR 區(qū)的非AUG 起始的uORF 通常對下游基因的翻譯產生抑制作用；且該區(qū)的AUG 密碼子也會干擾核糖體的招募，從而導致翻譯起始效率降低［30］。

3 翻譯研究技術

除探究mRNA“特殊序列”、mRNA 的二級結構和起始密碼子對翻譯起始速率的影響外，整體評估m(xù)RNA 翻譯速率對于蛋白質的表達有著重要的意義。mRNA 測序技術非常完善，通過高通量測序技術探究處于翻譯狀態(tài)的mRNA，既可以間接反應蛋白質的翻譯水平，又可以檢測到基因的可變剪接甚至發(fā)現新蛋白質分子［1-2］。因此，利用高通量測序技術對正在翻譯的mRNA 測序和分析成為當今研究的熱點。翻譯組研究最為常見的是多聚核糖體圖譜技術（polysome profiling），此外也有最近發(fā)展起來的翻譯譜分析技術（RNC-RNA-Seq）、核糖體圖譜技術（ribosome profiling）、核糖體親和純化技術（ribosome affinity purification，RAP）。翻譯組研究技術比較見表1。

表1 翻譯組研究技術比較Table 1 Comparison of techniques in translatome

3.1 多聚核糖體圖譜技術

核糖體是細胞內部密度最大的生物分子，單條mRNA 可以同時與多個核糖體結合形成分子量更大的多聚復合物。利用抗生素放線菌酮可將正在翻譯的RNA 固定，阻止核糖體內tRNA 釋放［47］，進而阻止翻譯延伸。隨后利用蔗糖密度梯度離心法將分布在不同梯度溶液中游離的RNA、核糖體大/小亞基以及結合有不同數目核糖體的mRNA 進行分離。根據結合核糖體數目的不同對mRNA 進行分離，并利用Northern 雜交、RT-qPCR［48-49］和微陣列分析［50-53］等方法對每組收集到的特定mRNA 進行分析（圖6）。此外，若對正在翻譯的RNA 進行整體分析，可以通過構建RNA-Seq 文庫、高通量測序［54-56］實現。多聚核糖體圖譜技術在人類癌癥的治療、非編碼RNA 編碼小肽的發(fā)現及植物在逆境脅迫的應答等多方面都得到廣泛應用。例如，Polenkowski 等［57］通過多聚核糖體圖譜技術發(fā)現在肝癌細胞（HCC）中表達且可以編碼功能性小蛋白C20orf204-189AA 的Linc00176，其可能是HCC的特異性靶分子，且C20orf204-189AA 小蛋白也可以增強核糖體RNA 的轉錄，進一步促進HCC 的增殖；高溫脅迫是全球小麥生產的主要限制因素，通過CRISPR /Cas9 的基因編輯和多聚核糖體圖譜等技術分析發(fā)現基因TaMBF1c顯著影響著熱響應因子的翻譯效率，且與熱休克蛋白的翻譯密切相關，其結果揭示了TaMBF1c通過翻譯調控小麥的熱應激反應［58］。

圖6 翻譯組研究技術流程Fig.6 Technical process of translationomics

多聚核糖體圖譜技術能夠獲取正在翻譯的mRNA 的全長信息，但沒有辦法獲知mRNA 內部的翻譯信息，例如核糖體位置、閱讀框位置、翻譯暫停區(qū)、uORFs 等。該實驗相對容易、適用范圍廣，但實驗操作過程復雜、樣本需求量大［56］。此外，蔗糖密度離心的體積通常較大［27］，且在高濃度的蔗糖溶液中常摻有脂筏、假多聚核糖體等高分子量復合物［59］，這些都大大增加了獲取核糖體-新生肽鏈復合物（ribosome nascent-chain complex，RNC）中的mRNA 即翻譯成蛋白質的mRNA 的難度，進一步局限該技術的發(fā)展。

在評估細胞內翻譯活躍程度方面，多聚核糖體圖譜可根據mRNA 結合核糖體數目判斷該mRNA 翻譯的活躍程度，且根據mRNA 在高濃度和低濃度蔗糖溶液的比例、正在翻譯的mRNA 與總mRNA 之間的比例共同判斷細胞的活躍程度。

3.2 翻譯譜分析技術

有研究發(fā)現，若一條mRNA 結合過多的核糖體則易發(fā)生核糖體“堆積”，阻礙翻譯延伸，降低翻譯速率。然而，部分mRNA 雖只結合單個核糖體，但其翻譯狀態(tài)卻異常的活躍。如在公認的翻譯活躍的HEK293 細胞和處于富營養(yǎng)培養(yǎng)基上對數生長的大腸桿菌中，其單核糖體組分占有主要地位［60-61］。將單核糖體單體分離并放置于無細胞翻譯體系中，其核糖體可以繼續(xù)翻譯生成蛋白質［61］。這都說明翻譯的活躍程度與mRNA 上核糖體的數量并不總呈正相關，但只要mRNA 與核糖體結合即可表明其處于翻譯狀態(tài)［62］?；谠摾碚?，2013年張弓實驗室開發(fā)了RNC-RNA-Seq［3］，與多聚核糖體圖譜技術類似，利用超速離心的方法將正在翻譯的mRNA 與游離的mRNA 分離并對翻譯中的mRNA 測序建庫，不同的是RNC-RNA-Seq 是采用單一濃度蔗糖溶液（30%蔗糖溶液）將正在翻譯的mRNA 與游離的mRNA 分離。該技術通常與RNA-Seq 技術相結合，共同探究動植物及細菌等在體內的轉錄和翻譯調控。例如，Luo 等［63］發(fā)現甜菜堿是通過調節(jié)基因的翻譯過程發(fā)揮降脂作用，其中Gpc1是降脂的關鍵基因；Zhang等［64］在膠質母細胞中發(fā)現LINC-PINT 可編碼多肽，且該肽可直接與聚合酶相關因子復合物（PAF1c）相互作用，抑制多種癌基因的翻譯過程，進而抑制膠質母腫瘤細胞的增殖。

與多聚核糖體圖譜相比，RNC-RNA-Seq 簡化了分離RNC-mRNA 的程序，有效地解決了多聚核糖體圖譜技術中溶液體積大、RNC-mRNA 濃度低的問題［27］。此外，實驗中得到的RNC-mRNA 仍保留翻譯活性，給予合適的緩沖液即可恢復翻譯能力［61］。不足的是RNC-RNA-Seq 依舊沒有辦法獲取mRNA內部翻譯信息，且單一濃度的蔗糖溶液使得沉淀物中不僅包含脂筏、假多聚核糖體等［59］高分子量復合物，還含有核糖體的大小亞基、單核糖體等，增加了獲取mRNA 信息的難度。

由于RNC-RNA-Seq 探究的是細胞內mRNA 分子是否進行翻譯，對某個基因或細胞內整體翻譯速率的水平還無法探知。但該技術與RNA-Seq 結合可共同分析翻譯過程中細胞整體或某個基因的翻譯水平。

3.3 核糖體圖譜技術

2009年由Weissman 課題組首次發(fā)表核糖體圖譜技術（Ribo-Seq）［65］，其利用核糖核酸酶I（ribonuclease I，RNase I）降解游離和不被核糖體保護的RNA 片段，并通過蔗糖梯度超速離心法獲取被核糖體保護的RNA 片段（ribosome footprints，RFPs），隨后去除核糖體，并將RNA 片段進行高通量測序和生物信息學分析，最終獲取正在翻譯的RNA 信息。Ribo-Seq 的精度是單密碼子級別，可精準獲取某基因內部的翻譯信息，如核糖體分布位置、起始密碼子位置、程序性框移動、uORF 等［66］。除Ribo-Seq 外，Pelechano 等［67］建立的5PSeq 技術也可以在單堿基分辨率下高通量捕獲核糖體的位置信息。因此，上述兩種技術在開放閱讀框（open reading frames，ORF）的發(fā)現、翻譯起始位點的發(fā)現及翻譯暫停等方面有著得天獨厚的優(yōu)勢［62，65］。例如，Sotta 等［68］采用Ribo-Seq 確定了高粱全基因組中快速翻譯的閱讀框，檢測到4 843 個主開放閱讀框（main ORF，mORF），并發(fā)現許多未被注釋的翻譯事件；Van’t Spijker［69］在人類G4C2基因的上游內含子中發(fā)現3 個起始位點，且該基因在核糖體易位過程中出現停頓現象。

雖然Ribo-Seq 有諸多優(yōu)點，但其存在樣本需求量大、成本高且操作要求高等問題［62］。此外，Ribo-Seq 也存在一定的局限性。例如，RNase I 不會降解與核糖體結合且被RNA 結合蛋白保護的或雙鏈的RNA［70］，此類RNA 在實驗中會被剔除，進而遺漏部分正在翻譯的RNA 信息；該技術只分析與核糖體結合的區(qū)域，并不能獲得與翻譯調控相關的非翻譯區(qū)的信息［27］；實驗通常只選取25-35 nt 的RFPs，而核糖體保護的RNA 片段長度差異很大（通常為19-75 nt），忽略其他大小的RFPs 片段，易造成翻譯信息的缺失。因此我們還需要從不同方面不斷優(yōu)化實驗，提出更加合理的實驗方案。

通過Ribo-Seq，可以清楚地了解每條RNA 結合核糖體的數目、位置等信息，因此可以根據基因結合核糖體的數目初步判斷翻譯的活躍程度。此外，也可以結合轉錄組數據計算整體或某基因的翻譯水平。

3.4 核糖體親和純化技術

核糖體親和純化技術（RAP）最早是由Gerbei課題組于2002年發(fā)表［27］，與其他翻譯組技術不同，利用親和純化以及組織特異性啟動子可在目的細胞內特異性表達這兩大原理，實現對樣品中難以分離的目的細胞進行翻譯水平的探究。其在核糖體內RPL25p 或RPL16a 蛋白的C 末端連接親和標簽（如His、FLAG 和eGFP 等），這兩類蛋白可被組織特異性啟動子啟動，純化后獲得過表達核糖體蛋白細胞系，隨后采用抗體與抗原特異性結合的原理將含有標簽的RNC-mRNA 進行分離，最后將被標記的mRNA 進行測序建庫分析［24］。該技術在檢測組織中特異性表達的mRNA、細胞的分離和建系等方面有著舉足輕重的地位。例如，Heiman［71］在中樞神經系統(tǒng)細胞中發(fā)現上千個在細胞中特異性表達的mRNA，這些mRNA 在RNA-Seq 中很難被檢測到；Corbacho［72］利用RAP 對斑馬魚細胞群中的核糖體進行遺傳標記，獲得基因在視網膜、骨骼肌、頜骨等組織中特異性表達的細胞系。

RAP 技術不需要對RNC-mRNA 進行廣泛的固定、超速離心分離或酶消化，可以在最小體外刺激下保持較完整的翻譯中RNA 圖譜，而且可以準確的定位在目的細胞，無需考慮來自其他組織、細胞的污染，獲得與該細胞表型相關性更高的數據信息。但實驗流程繁瑣冗長、成本昂貴，且不能獲得RNA的閱讀框位置、翻譯暫停區(qū)、uORFs 以及核糖體數量和位置等信息；此外，過表達核糖體蛋白會干擾正常生理狀況，攜有標簽的核糖體的翻譯性能也與正常核糖體不同，因而不能準確地反映正常生理狀況下的翻譯狀況［27］。

與RNC-RNA-Seq 相同，都不能獲取核糖體數目信息。因此，在計算整體或某基因的翻譯速率時都需要與RNA-Seq 數據相結合，共同分析細胞整體或單基因的翻譯水平。

4 總結與展望

中心法則闡述了遺傳信息從DNA 通過轉錄為RNA，再經翻譯合成蛋白質的基本生物學過程。蛋白質是發(fā)揮生物學功能的實際執(zhí)行者，但其組成多樣、構象復雜且結構穩(wěn)定等都嚴重阻礙著蛋白質組學的發(fā)展。翻譯速率是蛋白質豐度的決定性因素，眾多學者通過mRNA 結合核糖體的數目判斷翻譯的快慢。事實上，該方法在一定條件下是準確的；當核糖體在mRNA 上“堆積”時，過多的核糖體則會阻礙mRNA 的翻譯，利用該方法評估m(xù)RNA 的翻譯速率是不準確的。值得注意的是，并非高速的翻譯就能獲得最佳的表達效果，高速的翻譯會使多肽鏈錯誤折疊的概率增加，進而形成無活性、不可溶的包涵體。所以翻譯速率應當與蛋白質的折疊速率相“匹配”，這其中必然存在著某些重要的調控因子調控著二者的速率，還需進一步的挖掘和發(fā)現。當前，從基因組到轉錄組的調控機理研究得較為清楚，而從轉錄組到蛋白組的調控機理研究還非常薄弱，而翻譯組恰恰是連接轉錄組和蛋白組的橋梁。因此，通過翻譯組探究正在翻譯的mRNA 已經成為當前研究的熱點。利用該技術可幫助我們清晰地了解細胞內RNA 的翻譯狀態(tài)，有利于發(fā)現更多具有編碼能力的非編碼RNA，這為蛋白數據庫和分子生物學理論的補充和完善，對生命科學的發(fā)展具有重要的意義。