朱健榮，靳建峰，陳美鳳

(臨汾市中心醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，山西 臨汾 041000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見(jiàn)的組織學(xué)類型，通常預(yù)后不良[1]。近年來(lái)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICI)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，例如程序性死亡受體1(PD-1)或其配體(PD-L1)阻斷劑，極大地改變了晚期NSCLC的治療結(jié)局[2-3]。抗PD-1/PD-L1單克隆抗體可有效阻斷免疫抑制信號(hào)，從而恢復(fù)對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)[4]。但由于延遲動(dòng)力學(xué)和非典型反應(yīng)模式，PD-1阻斷劑的治療有效性難以區(qū)分和預(yù)測(cè)[5]。因此，迫切需要識(shí)別生物標(biāo)志物，以篩選可能受益于PD-1阻斷劑的患者。細(xì)胞因子是先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子，它允許免疫細(xì)胞以旁分泌和自分泌的方式進(jìn)行短距離通信[6]。鑒于免疫系統(tǒng)識(shí)別和摧毀癌細(xì)胞的能力，一些細(xì)胞因子已被探索用于癌癥的治療[7-8]。然而到目前為止，能夠可靠預(yù)測(cè)抗PD-1/PD-L1治療結(jié)果的細(xì)胞因子標(biāo)志物仍有待發(fā)現(xiàn)。本研究通過(guò)重點(diǎn)調(diào)查11種循環(huán)細(xì)胞因子是否可以在接受PD-1阻斷劑治療的NSCLC患者中發(fā)揮改善預(yù)后或預(yù)測(cè)作用，以期為改進(jìn)臨床免疫治療策略提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

這是一項(xiàng)由當(dāng)?shù)蒯t(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的前瞻性研究，并根據(jù)良好臨床實(shí)踐(GCP)指南進(jìn)行。所有患者在納入研究前均提供書(shū)面知情同意書(shū)。2015年1月至2019年10月共招募91例晚期NSCLC患者(NSCLC組)，其中男68例，女23例，年齡34～81歲，中位年齡56.0歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；組織學(xué)證實(shí)診斷為晚期或轉(zhuǎn)移性NSCLC，免疫組織化學(xué)檢測(cè)PD-L1表達(dá)≥1%，所有患者接受PD-1阻斷劑免疫單藥治療；東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)表現(xiàn)狀態(tài)0～2分，器官功能充足，精神狀態(tài)正常；表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變或間變性淋巴瘤激酶(ALK)易位均為陰性；預(yù)計(jì)生存期至少為12周。排除既往有間質(zhì)性肺病、全身免疫抑制治療或活動(dòng)性自身免疫性疾病病史的患者。另外選擇同期在本院體檢的90例健康志愿者的血清樣本作為對(duì)照組，其中男60例，女30例，中位年齡54.0歲，性別構(gòu)成、年齡與NSCLC組相匹配(P>0.05)。

1.2 治療

入選患者接受tislelizumab(百濟(jì)神州生物制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)S20190045)作為單藥治療(未接受化療的患者為200 mg，每3周1次；以前接受化療的患者為2 mg·kg-1)，或每2周靜脈注射nivolumab(百時(shí)美施貴寶公司，批準(zhǔn)文號(hào)S20180015)，劑量為3 mg·kg-1。藥物選擇基于PD-L1狀態(tài)和患者先前的治療史(一線或二線治療)。

1.3 療效判斷

通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像測(cè)量疾病的嚴(yán)重程度，并使用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1(RECIST 1.1)[9]評(píng)估治療反應(yīng)。每8周評(píng)估1次PD-1阻斷劑治療的臨床反應(yīng)，并在其后不少于4周通過(guò)后續(xù)評(píng)估予以確認(rèn)。根據(jù)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，靶病變的完全消失被評(píng)估為完全緩解(CR)，總靶病變減少30%以上被評(píng)估為部分緩解(PR)，總靶病變?cè)黾?0%以上被評(píng)估為進(jìn)展性疾病(PD)，靶病變總數(shù)減少30%或增加20%以下被評(píng)定為穩(wěn)定疾病(SD)。無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)是從PD-1阻斷劑治療開(kāi)始到影像學(xué)評(píng)估的首次疾病進(jìn)展的時(shí)間。由兩名研究人員獨(dú)立審查電子醫(yī)療圖表，以分配臨床反應(yīng)組。有反應(yīng)者以無(wú)病、病情穩(wěn)定或腫瘤體積減少超過(guò)6個(gè)月來(lái)定義，無(wú)反應(yīng)者以腫瘤生長(zhǎng)或≤6個(gè)月的臨床獲益來(lái)定義。

1.4 血清細(xì)胞因子檢測(cè)

于開(kāi)始PD-1阻斷劑治療前使用標(biāo)準(zhǔn)方案收集和處理血清樣本，等分并儲(chǔ)存在-80 ℃，直到化驗(yàn)。使用AimPlex流式高通量多因子試劑盒(美國(guó)AimPlex Biosciences)和BD-FACS Calibur系統(tǒng)(美國(guó)BD Biosciences)測(cè)定血清白細(xì)胞介素(IL)-5、IL-8、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-2、IL-4、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平。先將45 μl血清樣品和45 μl試劑磁珠混合，室溫下培養(yǎng)1 h。孵育后，添加0.5 ml洗滌緩沖液，離心5 min。用生物素結(jié)合單克隆抗體孵育樣品30 min，然后用鏈霉親和素結(jié)合單克隆抗體孵育樣品20 min。最后，在所有樣品中加入洗滌讀取緩沖液上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 26.0軟件處理數(shù)據(jù)，非正態(tài)分布連續(xù)變量表示為M50(四分位距：IQR)，進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用Logistic回歸模型分析血清細(xì)胞因子與PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的關(guān)系。采用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)估血清細(xì)胞因子對(duì)PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank法分析血清細(xì)胞因子與預(yù)后的相關(guān)性。采用Cox回歸比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性假設(shè)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清細(xì)胞因子水平比較

NSCLC組患者血清IL-4、IL-5、IL-8、IFN-γ、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2組血清細(xì)胞因子水平比較[M50(IQR)] pg·ml-1Tab 1 Comparison of serum cytokine levels between the two groups[M50(IQR] pg·ml-1

2.2 血清細(xì)胞因子與PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的關(guān)系

根據(jù)腫瘤反應(yīng)，55例被評(píng)估為PR或SD的患者被歸為有反應(yīng)者。有反應(yīng)者患者血清IL-5、IFN-γ水平顯著高于無(wú)反應(yīng)者(P<0.05，表2)。進(jìn)一步校正PD-1阻斷劑類型后，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，血清IL-5(OR=1.891，95%CI1.142～5.159，P=0.001)、IFN-γ(OR=2.018，95%CI1.336～5.007，P<0.001)仍是影響治療反應(yīng)的相關(guān)因子。血清IL-5、IFN-γ預(yù)測(cè)PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的ROC曲線下面積分別為0.708(95%CI0.594～0.823)、0.825(95%CI0.735～0.914)，對(duì)應(yīng)截?cái)嘀捣謩e為2.930、5.365 pg·ml-1，特異度分別為74.5%、78.2%，敏感度分別為63.9%、77.8%，見(jiàn)圖1。

表2 NSCLC患者不同治療反應(yīng)血清細(xì)胞因子水平比較[M50(IQR)] pg·ml-1Tab 2 Comparison of serum cytokine levels in NSCLC patients with different treatment responses[M50(IQR)] pg·ml-1

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清細(xì)胞因子水平與PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的關(guān)系

經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析顯示，血清IL-5、IFN-γ是PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(P<0.05，表3)。用于預(yù)測(cè)PD-1阻斷反應(yīng)的血清細(xì)胞因子的Logistic回歸模型構(gòu)建如下：logit(P=有反應(yīng)者)=0.114×(IL-5)+0.079×(IFN-γ)-19.548，(IL-5)和(IFN-γ)分別是治療早期IL-5和IFN-γ的血清濃度。通過(guò)使用該模型，AUC確定為0.832(95%CI0.748～0.916)，敏感度為86.1%，特異度為88%，這表明血清細(xì)胞因子在區(qū)分有反應(yīng)者和無(wú)反應(yīng)者方面表現(xiàn)良好(圖1)。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析血清細(xì)胞因子表達(dá)水平與PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的關(guān)系Tab 3 The relationship between the expression of serum cytokines and the response to PD-1 blocker treatment by univariate and multivariate Logistic regression analysis

圖1 血清IL-5、IFN-γ及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的ROC曲線Fig 1 ROC curve of serum IL-5, IFN-?and their combined prediction of PD-1 blocker response

2.4 Cox回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

經(jīng)單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，血清IL-5、IFN-γ與PFS、OS之間的相關(guān)性具有高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性和獨(dú)立性(P<0.05，表4、5)。

表4 單因素Cox回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素Tab 4 Risk factors influencing prognosis of NSCLC patients by univariate Cox regression analysis

表5 多因素Cox回歸分析影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素Tab 5 Risk factors influencing prognosis of NSCLC patients by multivariate Cox regression analysis

2.5 血清細(xì)胞因子水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)中位值(IL-5為2.70 pg·ml-1，IFN-γ為4.72 pg·ml-1)將患者分成高水平組和低水平組。隨訪期間，高IL-5水平組和低IL-5水平組中位OS時(shí)間分別為12.7、15.7個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.876，P<0.001)；中位PFS時(shí)間分別為4.5、6.4個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.671，P<0.001)。高IFN-γ水平組和低IFN-γ水平組中位OS時(shí)間分別為12.8、15.7個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.614，P<0.001)；中位OS時(shí)間分別為4.5、6.5個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.100，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線Fig 2 Kaplan-Meier survival curve

3 討 論

使用靶向PD-1/PD-L1抗體的ICI治療已證明對(duì)晚期NSCLC具有深遠(yuǎn)的臨床療效[10-11]，識(shí)別生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)至關(guān)重要。外周血采集是一種創(chuàng)傷小、安全、方便、可重復(fù)的樣本采集方法，此外，外周血可以提供宿主免疫狀態(tài)的系統(tǒng)視圖。近年來(lái)，血液循環(huán)中的一些生物標(biāo)志物在預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫治療反應(yīng)方面顯示出了價(jià)值。在本研究中，我們證明血清IL-5和IFN-γ水平與晚期NSCLC患者抗PD-1治療的療效相關(guān)；進(jìn)一步的分析也闡明了這兩種分子對(duì)于OS和PFS的預(yù)測(cè)價(jià)值。

細(xì)胞因子作為免疫活性的重要調(diào)節(jié)劑，將免疫細(xì)胞募集到腫瘤免疫微環(huán)境中，并在抗腫瘤活性過(guò)程中促進(jìn)某些免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)[12]。因此，這些細(xì)胞因子可能是對(duì)PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。IFN-γ是一種在先天性和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用的細(xì)胞因子，主要由用于天然免疫的T細(xì)胞和 NK細(xì)胞產(chǎn)生，但也由用于適應(yīng)性免疫的CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生[13]。在腫瘤中，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是IFN-γ的主要來(lái)源[14]。IFN-γ在對(duì)感染和癌癥的免疫反應(yīng)中起重要作用，它可以通過(guò)改善主要組織相容性復(fù)合體(MHC)介導(dǎo)的抗原呈遞、增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞1(Th1)反應(yīng)、調(diào)節(jié)白細(xì)胞運(yùn)輸、促進(jìn)Toll樣受體信號(hào)傳導(dǎo)以及增強(qiáng)抗腫瘤和抗菌功能來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。有研究[15]表明，基線IFN-γ基因表達(dá)特征與ICI治療的晚期NSCLC癌癥患者的臨床結(jié)局相關(guān)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)治療有反應(yīng)組血清IFN-γ和IL-5水平顯著高于治療無(wú)反應(yīng)組，且校正混雜因素后血清IL-5和IFN-γ是PD-1阻斷劑治療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。這可以通過(guò)以下機(jī)制來(lái)解釋：一方面IFN-γ信號(hào)通過(guò)直接上調(diào)腫瘤、免疫浸潤(rùn)和基質(zhì)細(xì)胞中的配體PD-L1和PD-L2，使PD-1信號(hào)軸活化，這些配體與腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞上的PD-1相互作用，從而下調(diào)細(xì)胞毒效應(yīng)；另一方面，IFN-γ可以上調(diào)腫瘤微環(huán)境中其他關(guān)鍵免疫抑制分子(如IDO1)的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞利用這種正負(fù)免疫信號(hào)因子的微妙平衡得以繼續(xù)生存和發(fā)展。

IL-5主要由輔助性T細(xì)胞-2亞型(Th2)淋巴細(xì)胞和Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞(ILC2)產(chǎn)生[16]，通過(guò)促進(jìn)B細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)增加抗體分泌，增強(qiáng)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答[17]。ILC2是原始肺組織中的常駐群體，通過(guò)快速釋放效應(yīng)細(xì)胞因子(如IL-5)和影響Th2細(xì)胞的共刺激配體，介導(dǎo)先天性和適應(yīng)性2型炎癥，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[5]。ILC2還可以通過(guò)以IL-5依賴的方式招募和激活嗜酸粒細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)其免疫抑制作用[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)血清IL-5水平升高與PD-1阻斷劑治療反應(yīng)不良密切相關(guān)，IL-5是ILC2釋放的主要細(xì)胞因子，一方面ILC2衍生的IL-5對(duì)于嗜酸粒細(xì)胞介導(dǎo)的NK細(xì)胞功能抑制非常重要，在一定程度上能夠抑制PD-1阻斷劑的抗腫瘤免疫；此外ILC2通過(guò)抑制PD-1信號(hào)傳遞使腫瘤細(xì)胞能夠控制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。事實(shí)上，以IL-5及其受體為靶點(diǎn)的免疫治療策略已經(jīng)引起普遍關(guān)注[19]。

綜上所述，早期治療血清中細(xì)胞因子標(biāo)志物的鑒定可作為選擇NSCLC患者的預(yù)測(cè)工具，例如低血清IL-5和IFN-γ水平的患者將從抗PD-1治療中獲益。因此，IL-5和IFN-γ可能成為預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者PD-1阻斷劑治療反應(yīng)和預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物。但本研究具有一定局限性，收集樣本量較小且血清細(xì)胞因子在NSCLC中的潛在機(jī)制尚不明確，有必要進(jìn)行更多更大的臨床研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)其在NSCLC中的臨床應(yīng)用價(jià)值。