卜 單，涂宗財(cái),2,3，劉光憲，胡月明，王 輝,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西師范大學(xué) 國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；3.江西師范大學(xué) 江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330022；4.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330299）

牛α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）由123 個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為14.2 kDa。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量為26%，β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)含量為14%[1]。牛乳α-LA占總蛋白的5%，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體中乳糖合成，含有大量的必需氨基酸（63.2%），牛乳α-LA 74%的氨基酸序列與母乳的α-LA相同，且有6%的殘基化學(xué)性質(zhì)類似[2]，因而牛乳α-LA是一種適合作為嬰兒食品營養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。

據(jù)報(bào)道，糖基化反應(yīng)和超聲波處理能夠調(diào)節(jié)α-LA的功能。糖基化反應(yīng)主要通過還原糖與氨基或脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的相互作用，與化學(xué)修飾和酶修飾相比，是一種安全的蛋白修飾方法。美拉德反應(yīng)可增強(qiáng)魚鱗明膠的抗氧化活性[3]；Wang Xumei等[4-5]發(fā)現(xiàn)糖基化可以顯著降低乳球蛋白的致敏性；Chen Yingjia等[6]發(fā)現(xiàn)美拉德改性后的β-乳球蛋白熱穩(wěn)定性得到改善。盡管糖基化能夠改善蛋白的功能性能，但是單靠單一的修飾并不能得到滿意的結(jié)果。

高強(qiáng)度（低頻率）超聲波是多被用于食物加工中。超聲波協(xié)同糖基化能夠更好改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，如超聲波預(yù)處理牛血清白蛋白，其糖基化程度加深，乳化性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)一步增強(qiáng)[7]；超聲作用和糖基化能破壞α-LA的結(jié)構(gòu)，糖基化能顯著提高α-LA的抗氧化活性[8]和降低其致敏性[9]。因此，超聲預(yù)處理與糖基化結(jié)合后α-LA的構(gòu)象變化與抗氧化活性有關(guān)。

然而，目前的研究主要集中在干燥狀態(tài)或者濕熱狀態(tài)下美拉德反應(yīng)法制備一種α-LA糖軛合物，關(guān)于不同糖類在干熱狀態(tài)下美拉德反應(yīng)的α-LA資料很少，單一糖基化對(duì)蛋白功能的研究很多，不同還原糖糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理對(duì)α-LA抗氧化活性的研究鮮見報(bào)道。因此本研究將采用食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用的兩種還原糖（葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man））和一種稀有糖（阿洛糖（allose，All））與α-LA進(jìn)行干熱處理下的抗氧化活性研究。首先將超聲技術(shù)應(yīng)用于α-LA的結(jié)構(gòu)擾動(dòng)，然后將超聲預(yù)處理后的α-LA進(jìn)行糖基化。通過對(duì)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，以還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除活性評(píng)價(jià)α-LA的抗氧化活性。以期為超聲預(yù)處理聯(lián)合糖基化誘導(dǎo)α-LA結(jié)構(gòu)變化與抗氧化活性之間關(guān)系的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-LA、D-Glc、D-All、D-Man 美國Sigma公司；蛋白分子質(zhì)量Marker 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑純度均為分析純或以上。

1.2 儀器與設(shè)備

JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano ZS90型粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司；MTB Module電泳儀 美國伯樂公司；Synergy全功能酶標(biāo)儀 美國BioTek儀器有限公司；Bio-Logic MOS 450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；F-7000熒光光譜儀 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1α-LA超聲樣品的制備

1 mg/mL的α-LA溶液用10 mmol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer，PBS）溶解，放入超聲波細(xì)胞破碎儀中進(jìn)行超聲處理。超聲功率和時(shí)間為130 W、10 min，整個(gè)超聲過程都在冰浴中進(jìn)行，超聲完畢后，放在4 ℃冰箱中待用。

1.3.2 糖基化樣品的制備

分別取40 mg的Glc、All、Man于40 mL超聲處理后的α-LA溶液中，混勻，凍干。將凍干樣品置于相對(duì)濕度65%和55 ℃的糖基化反應(yīng)模型中，反應(yīng)6 h，反應(yīng)完畢后將離心管至于4 ℃冰箱中終止反應(yīng)，用PBS（10 mmol/L pH 7.4）復(fù)溶，然后采用3 kDa的超濾離心管（Millipore，BedFord，MA，USA）除去未反應(yīng)的糖及鹽分，為了進(jìn)一步去除未結(jié)合的還原糖，將混合液移入透析袋中于4 ℃持續(xù)攪拌透析24 h，每天更換3 次超純水，透析后，凍干。置于4 ℃冰箱中待用。天然的α-LA命名為LA；僅超聲波處理的α-LA命名為ULA；Glc、All、Man糖基化修飾的α-LA分別命名為Glc-LA、All-LA和Man-LA；Glc、All、Man糖基化修飾的超聲預(yù)處理α-LA分別命名為U-Glc-LA、U-All-LA和U-Man-LA。

1.3.3 Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

依次配制分離膠、夾層膠和濃縮膠，3種膠的制膠體積比為4∶1∶1。取10 μL樣品（1 mg/mL）上樣，以蛋白質(zhì)Marker（3.3～31.0 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。

1.3.4 游離氨基含量測(cè)定

參照劉俊[10]的方法并作適當(dāng)修改。測(cè)定時(shí)取100 μL的樣品（蛋白質(zhì)量濃度4 mg/mL）與2 mL鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）溶液混合，室溫避光放置2 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在340 nm波長處測(cè)其吸光度，以在OPA試劑中加入100 μL去離子水為空白樣。

1.3.5 粒徑測(cè)定

參照張婧倩等[11]的方法，將所有樣品稀釋成0.25 mg/mL，采用馬爾文激光粒度儀檢測(cè)其粒徑。樣品于25 ℃平衡3 min，每個(gè)樣品掃描3 次取平均值。

1.3.6 圓二色譜掃描

根據(jù)Yang Wenhua等[12]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，將所有樣品用超純水稀釋成0.5 mg/mL。設(shè)定參數(shù)為：光譜掃描范圍190～250 nm，掃描速率60 nm/min，狹縫寬度1 nm。在室溫下測(cè)定，連續(xù)掃描3 次取平均值。在http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/網(wǎng)站上進(jìn)一步分析。

1.3.7 表面疏水性測(cè)定

參考Yang Wenhua等[13]的方法進(jìn)行一定修改。1 mL樣品加入5 μL 8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（8 mmol/L，pH 7.4）溶液，取200 μL混合液體加入到比色皿中，利用熒光光譜儀進(jìn)行熒光光譜分析，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm，測(cè)量熒光強(qiáng)度，將熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度的作圖進(jìn)行擬合，其斜率即為表面疏水性。

1.3.8 抗氧化活性測(cè)定

1.3.8.1 還原力的測(cè)定

參考Medjkouh等[14]的方法并作適當(dāng)修改。首先將500 μL 1%的K3[Fe(CN)]6溶液與等體積的PBS（0.2 mol/L，pH 6.6）混勻，再加入500 μL 10 mg/mL樣品溶液，混合均勻后于50 ℃水浴加熱20 min。反應(yīng)結(jié)束后放入冰浴中冷卻混合溶液，再加入500 μL 10 g/100 mL三氯乙酸溶液，混合均勻后再于室溫8 000×g離心10 min，然后取400 μL上清液與400 μL蒸餾水和80 μL 0.1%的K3[Fe(CN)]6溶液混合，取上述混合液200 μL于酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長700 nm處的吸光度。

1.3.8.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Wen Chaoting等[15]的方法并作適當(dāng)修改。首先將500 μL 10 mg/mL的樣品溶液與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合，于室溫下避光反應(yīng)30 min后，取200 μL于酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長517 nm處的吸光度，同時(shí)以超純水為空白對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算如下：

式中：AS為樣品在517 nm波長處的吸光度；AC為對(duì)照品在517 nm波長處的吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測(cè)定

參照Chang等[16]的方法并作適當(dāng)修改。7 mmol/L的ABTS和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混勻，避光室溫反應(yīng)12 h備用，此為ABTS陽離子自由基工作液。將反應(yīng)12 h后的ABTS陽離子自由基溶液用超純水稀釋到734 nm波長處吸光度為0.70±0.02后備用。取80 μL的樣品溶液，加入3.92 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液，混合均勻，室溫反應(yīng)10 min，于734 nm波長處測(cè)定吸光度。ABTS陽離子自由基清除率計(jì)算如下：

式中：AD為樣品在734 nm波長處的吸光度；AC為對(duì)照品在734 nm波長處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE

如圖1所示，與未處理的LA（1泳道）比較，僅超聲波處理的ULA條帶（2泳道）未發(fā)生明顯變化，超聲波協(xié)同糖基化反應(yīng)處理的α-LA條帶（3～8泳道）明顯上移，這說明糖基化后α-LA的分子質(zhì)量增加，α-LA與糖分子形成共價(jià)鍵。

圖1 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA分子質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on the molecular mass of ultrasonic pretreated α-LA

2.2 α-LA和不同還原糖糖基化反應(yīng)氨基含量

以往研究表明賴氨酸是還原糖的主要糖基化位點(diǎn)，而精氨酸是不常見的糖基化位點(diǎn)，糖基化程度的增加會(huì)減少游離氨基數(shù)量[17-18]。如表1所示，與LA相比，僅ULA游離氨基含量變化不明顯，但糖基化后的α-LA游離氨基含量發(fā)生了不同程度的減少，且超聲預(yù)處理的α-LA游離氨基含量變化進(jìn)一步增大（P＜0.05），說明超聲波促進(jìn)了α-LA的糖基化反應(yīng)，使得糖基化反應(yīng)程度進(jìn)一步增大。Glc、All、Man都是六碳醛糖，結(jié)構(gòu)上的唯一區(qū)別是C2和C3的構(gòu)型不同，導(dǎo)致不同糖基化樣品接枝度發(fā)生顯著差異。其中，All修飾的α-LA具有最低的游離氨基含量和最高的接枝度，說明糖基化反應(yīng)程度最高。這可能是由于超聲波破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使得蛋白構(gòu)象變得松散，更有益于糖分子的接入，且All的構(gòu)型更易于發(fā)生糖基化反應(yīng)。Yang Yipeng等[19]研究了卵清蛋白（ovalbumin，OVA）與5種不同的單糖發(fā)生糖基化，結(jié)果顯示All糖基化OVA的游離氨基含量最低。

表1 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA游離氨基含量的影響Table 1 Effect of glycation with different reducing saccharides on free amino contents of ultrasonic pretreated α-LA %

2.3 粒徑及其分布

由圖2可知，經(jīng)過超聲預(yù)處理和糖基化后的α-LA，平均粒徑從242 nm增加到了792 nm，多分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）從0.425增加到0.794。說明超聲波糖基化改變了α-LA的結(jié)構(gòu)，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加松散，粒徑分布跨度增大。其中，All修飾的α-LA平均粒徑和PDI最大，這可能是由于α-LA分子結(jié)合了更多All，這與之前的接枝度結(jié)果一致。馬秋平等[20]發(fā)現(xiàn)因?yàn)閱翁欠肿拥慕尤耄鞍讟?gòu)象遭到破壞，使得蛋白粒徑增大。胡淼等[21]發(fā)現(xiàn)過度的熱處理會(huì)使蛋白發(fā)生聚集，導(dǎo)致BMPIDextran共價(jià)復(fù)合物乳液的平均粒徑增大，乳化性降低。孟軒夷[22]通過粒徑和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)亞麻酸的加入能引起乳蛋白分子聚合形成高聚物增加β-乳球蛋白和α-LA的顆粒大小。

圖2 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA平均粒徑和PDI的影響Fig. 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on average particle size and PDI of ultrasonic pretreated α-LA

2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

如表2所示，超聲及糖基化處理后的α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生了明顯變化。與LA相比，α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量減少，β-折疊增加。這與Stathopulos等[23]的結(jié)果一致，超聲處理可以明顯影響蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白聚合作用從而導(dǎo)致α-螺旋相對(duì)含量減少而β-折疊相對(duì)含量增加；Ma Xiaojuan等[24]的研究表明，糖基化可以使得蛋白β-折疊含量增加。由于糖基化，它可能會(huì)以β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)結(jié)構(gòu)為代價(jià)增加β-折疊相對(duì)含量，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的幾何形狀轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的形式[13]。但是，Yang Wenhua等[25]報(bào)道，β-Lg經(jīng)過糖基化修飾后α-螺旋相對(duì)含量增加，β-折疊相對(duì)含量減少，糖基化可以使得蛋白β-折疊轉(zhuǎn)換為α-螺旋。不同結(jié)果可能是由于糖化反應(yīng)pH值、溫度、水分活度和蛋白質(zhì)等條件不同所致。

表2 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of glycation with different reducing saccharides on secondary structures of ultrasonic pretreated α-LA%

2.5 表面疏水性分析

圖3 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of glycation with different reducing saccharides on surface hydrophobicity of ultrasonic pretreated α-LA

如圖3所示，與LA相比，糖基化樣品的表面疏水性發(fā)生了不同程度的降低。這與之前研究一致，糖基化顯著降低了蛋白的表面疏水性[26-27]。在這3種還原糖中，Glc修飾的α-LA表面疏水性最低。由于ANS可以強(qiáng)結(jié)合陽離子基團(tuán)，如賴氨酸和精氨酸殘基，而賴氨酸和精氨酸殘基是糖基化反應(yīng)的主要位點(diǎn)[28]。超聲預(yù)處理使得蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生去折疊，可促進(jìn)賴氨酸和/或精氨酸殘基與還原糖結(jié)合，使ANS能夠結(jié)合的陽離子基團(tuán)減少，最終導(dǎo)致其表面疏水性降低。此外，糖分子的引入增加了糖-蛋白分子表面的空間位阻和親水性，抑制了ANS對(duì)這些疏水性基團(tuán)的可及性[29]。

2.6 抗氧化活性分析

圖4 不同還原糖的糖基化反應(yīng)對(duì)超聲波預(yù)處理α-LA抗氧化性的影響Fig. 4 Effect of glycation with different reducing saccharides on the antioxidant activities of ultrasonic pretreated α-LA

DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力可以反映超聲糖基化樣品的抗氧化能力。以樣品在700 nm波長處吸光度表示還原力的大小。如圖4A所示，超聲糖基化后的α-LA還原力顯著提高（P＜0.05），其中All修飾的α-LA具有最高的吸光度，且超聲預(yù)處理α-LA吸光度進(jìn)一步提高。超聲糖基化樣品DPPH自由基清除能力見圖4B，與還原力的測(cè)定有相似結(jié)果，糖基化后的α-LA自由基清除能力顯著提高，其抗氧化活性順序?yàn)锳ll＞Man＞Glc。圖4C中雖然3種糖修飾的α-LA對(duì)ABTS陽離子自由基清除能力無顯著差異，但是All修飾的α-LA仍具有最高自由基清除能力，且超聲進(jìn)一步提高其自由基清除能力，說明糖基化程度越高，蛋白抗氧化活性越強(qiáng)。Yang Wenhua等[12]也得到相似的結(jié)果，高強(qiáng)度超聲預(yù)處理可增強(qiáng)OVAMan結(jié)合物的抗氧化活性。此外，從圖4B、C可以看出，α-LA的ABTS陽離子自由基清除能力高于DPPH自由基清除能力，這說明超聲預(yù)處理的糖基化α-LA水溶性較高，更易與水溶性的ABTS陽離子自由基結(jié)合，而與脂溶性的DPPH反應(yīng)程度較低。

糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理增強(qiáng)α-LA抗氧化活性，可能是由于糖基化反應(yīng)過程中產(chǎn)生了一些還原酮類中間物質(zhì)，能夠提供氫離子等抗氧化物質(zhì)，與自由基結(jié)合，形成穩(wěn)定的分子[30]，而且高分子質(zhì)量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的還原性[31]，使得產(chǎn)物的抗氧化能力顯著提高。另一方面超聲使得蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，更有利于糖分子的接入，糖基化程度增大，此外超聲空化作用可以產(chǎn)生羥自由基[32]，促進(jìn)糖基化反應(yīng)?？傊?，超聲波協(xié)同糖基化顯著增強(qiáng)了α-LA的抗氧化活性，且超聲波預(yù)處理促進(jìn)了這種增強(qiáng)作用。因此，超聲波協(xié)同糖基化是一種很有前景的制備食品加工抗氧化劑的方法。

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理誘導(dǎo)α-LA結(jié)構(gòu)變化與其抗氧化活性增強(qiáng)有著密切相關(guān)性。其中，All修飾的α-LA接枝度最高，抗氧化活性最強(qiáng)。糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理提高了α-LA的平均粒徑，擴(kuò)大了粒徑分布范圍；改變了α-LA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高了β-折疊相對(duì)含量，降低了α-螺旋相對(duì)含量；改變了α-LA的三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理是一種很有前景的提升α-LA功能特性的方法。然而，在此條件下糖基化結(jié)合超聲波預(yù)處理增強(qiáng)α-LA抗氧化活性的機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。