熊蘇玥，李家鵬，李金春，韋憶萱，許隨根，劉睿茜，陳 曦，王守偉，曲 超，喬曉玲

（中國肉類食品綜合研究中心，北京食品科學研究院，國家肉類加工工程技術(shù)研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100068）

肉及肉制品的“摻假”是食品加工、流通和餐飲中存在的重要問題[1-2]，價格差異帶來的經(jīng)濟利益驅(qū)使一些不法商販和企業(yè)在牛肉等高價肉制品中摻入一些低廉肉種，甚至使用一些經(jīng)過違規(guī)添加劑處理后的植物源性添加物冒充高價肉，嚴重侵害消費者權(quán)益和健康[3]。因此需要建立對市售肉制品中牛源性成分精準定量的檢測方法，以判定摻假的類型及嚴重程度，解決定性檢測中無法區(qū)分污染和惡意摻假的假陽性問題。

國內(nèi)外關(guān)于動物源性成分檢測除了傳統(tǒng)理化檢測技術(shù)，主要還有基于蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)以及DNA的分子生物學檢測技術(shù)[4]，其中分子生物學技術(shù)以其檢測靈敏度高、重復性好、準確度高等優(yōu)勢，適用于經(jīng)各種加工條件處理后成分復雜的肉制品中肉成分的檢測[5-6]。目前已有大量關(guān)于基于普通聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的定性方法和基于real-time PCR的相對定量檢測方法的研究報道[7-9]，但相對定量方法需要基于標準曲線才能實現(xiàn)定量，同時real-time PCR的標準曲線需依賴于Ct值，引物設(shè)計或擴增條件的細微差異都可能影響PCR擴增效率，進而導致定量的不準確[10]。

微滴式數(shù)字聚合酶鏈式反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的定量分析技術(shù)，通過將PCR體系分配到約2萬 個獨立的反應(yīng)液滴中并且發(fā)生擴增反應(yīng)，統(tǒng)計每個獨立微滴中的陽性信號結(jié)合泊松分布原理，對模板中核酸的拷貝數(shù)進行絕對定量[11]，避免了樣品差異性及擴增效率變化而導致的定量結(jié)果不準確[12]。目前ddPCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測、致病菌微生物檢測、拷貝數(shù)變異分析以及疾病診斷等領(lǐng)域[13-16]。近年來，隨著ddPCR及其他分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和日趨完善，陸續(xù)有研究將ddPCR技術(shù)應(yīng)用于肉類食品成分定量分析，李偉琦等[17]比較了ddPCR與芯片式PCR在火雞源性成分定量檢測中的差異，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法對5%及以上含量樣品的檢測數(shù)據(jù)具有一定的穩(wěn)定性和可重復性。劉立兵等[18]以提取的樣品DNA濃度為中間值，建立其與DNA拷貝數(shù)和目標肉樣質(zhì)量之間的兩組標準曲線，從而實現(xiàn)對雞、豬、牛源性成分的精準定量，相比于Koppel等[19]開發(fā)的realtime PCR定量檢測方法中對雞肉及豬肉含量定量方法相對標準偏差更?。煌ㄟ^直接建立拷貝數(shù)與質(zhì)量分數(shù)之間的關(guān)系，Ren Junan等[20]實現(xiàn)了羊肉中摻雜豬肉或雞肉成分的ddPCR精準定量檢測方法，發(fā)現(xiàn)該方法比定量PCR的檢測結(jié)果更接近真實值，相對標準偏差更低。但由于市場上肉制品中混合成分多樣，摻假肉源種類眾多，除常見的低價禽畜肉類外，更有甚者會摻入一些貉子肉等不能食用的動物肉以次充好，或者選擇植物源性添加物增加質(zhì)量。因此，固定的檢測某類摻假物質(zhì)會降低檢測摻假效率，加大工作量，有待開發(fā)可同步檢測多種肉類的檢測方法。

本研究建立雙重ddPCR體系，同時擴增牛源性成分與動物源性成分，除了對牛源性成分進行定量檢測，還可以通過ddPCR雙通道拷貝數(shù)比值，判斷是否存在牛肉源性之外動物源性成分參與通用引物的擴增，以期為打擊肉類產(chǎn)品摻假售假等違法違規(guī)行為提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉、狗肉、狐貍?cè)?、貉子肉、鹿肉、驢肉、胖頭魚肉、馬肉 市購；貓血、鼠血在北京某寵物醫(yī)院采集；牛肉丸、牛排等牛肉制品北京某超市。

Droplet Generation Oil for probes 美國Bio-Rad公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）美國Bio-Rad公司；Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒 上海凱杰有限公司；SYBR Green Enzyme Premix 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ddPCR系統(tǒng)（QX200微滴生成儀、C1000 PCR儀、QX200微滴讀取分析儀） 美國Bio-Rad公司；5415R高速冷凍離心機 德國Eppendorff公司；OMNI Prep多樣品剪切均質(zhì)勻漿機 美國OMINI公司；Nanodrop2000微量核酸蛋白檢測儀 Thermal中國有限公司；LightCycler 480實時熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針的設(shè)計

從NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）下載目標物種牛（NC_037352.1）及其他動物的單拷貝基因序列β-actin，將目標物種與其他動物源性物種基因序列進行比對（MEGA 6.0），選擇差異序列用于設(shè)計特異性引物和探針，保守區(qū)域用于通用引物和探針的設(shè)計。用HEX熒光染料基團標記牛源性探針的5’端，F(xiàn)AM熒光染料基團標記動物源性探針的5’端，非熒光淬滅基團均采用BHQ標記，引物和探針均由Invitrogen公司合成，詳細序列見表1。

表1 用于多重ddPCR的引物Table 1 Primer sequences used for multiplex PCR

1.3.2 樣品前處理

參考Noh等[21]的方法，取樣品的肌肉組織于組織勻漿機中絞碎后80 ℃烘干72 h，再用粉碎機研磨成粉，勻質(zhì)過程中不同肉類分開處理，防止樣品間交叉污染。

1.3.3 DNA提取

參考Santella[22]采用CTAB法提取基因組DNA，分別準確稱取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg的牛肉粉末作為實驗的標準品，加入800 μL組織裂解液和20 μL蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，56 ℃水浴1 h后12 000 r/min離心5 min；吸取上清液600 μL，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，混勻后12 000 r/min離心5 min；吸取上清液400 μL，加入80%體積的異丙醇，混勻后常溫靜置沉淀30 min，12 000 r/min離心5 min。棄掉上清液，加入500 μL的70%乙醇溶液洗滌沉淀2 次，12 000 r/min離心5 min；棄去上清液，室溫下自然干燥后加入TE緩沖液100 μL溶解DNA。

1.3.4 引物和探針的設(shè)計與特異性評價

利用鼠、牛、羊、豬、馬、鹿、狐貍、貓、狗、魚、雞、鴨、貉子和驢共14 個物種所提取的基因組DNA，采用real-time PCR技術(shù)進行相應(yīng)引物、探針的特異性和通用性驗證。所用的10 μL的real-time PCR體系包含：LightCycler 480 Probe Master 5 μL，DNA 模板2 μL（質(zhì)量濃度為5 ng/μL），上下游引物（10 nmol/μL）0.6 μL，探針（10 nmol/μL）0.3 μL，ddH2O 1.5 μL。realtime PCR條件： 95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性15 s，64 ℃退火、延伸45 s，40 個循環(huán)，同時連續(xù)檢測熒光強度。

1.3.5 ddPCR退火溫度優(yōu)化

如表2所示，兩種引物和探針的終濃度均為900 nmol/L和200 nmol/L。將加入DNA模板后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到微滴生成卡中，加入70 μL液滴生成油，生成微滴。將生成的40 μL微滴轉(zhuǎn)移至96 孔板中，封膜后放入C1000 PCR儀中進行擴增。為考察擴增退火溫度對讀取拷貝數(shù)定量結(jié)果的影響，采用不同的退火溫度以優(yōu)化PCR，以20 ng/μL牛DNA為模板，PCR條件： 95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，于不同溫度60、61、62、63、64 ℃退火、延伸1 min，共40 個循環(huán)；98 ℃、10 min，升降溫速率為2 ℃/s。

表2 雙重ddPCR體系組分及配比（總體積20 μL）Table 2 Composition of ddPCR system (total volume of 20 μL)

1.3.6 牛肉質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定

1.3.6.1 牛肉質(zhì)量與DNA質(zhì)量濃度的線性關(guān)系

分別稱量5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg共10 個質(zhì)量梯度的牛肉樣品提取DNA，每個梯度重復3 次。提取完成后采用NanoDrop2000核酸定量測定儀測定DNA質(zhì)量濃度與純度，以3 個平行的DNA質(zhì)量濃度平均值（ng/μL）為縱坐標，使用Excel擬合標準曲線，得到牛肉質(zhì)量-DNA質(zhì)量濃度的線性關(guān)系式。

1.3.6.2 DNA質(zhì)量濃度與拷貝數(shù)的線性關(guān)系

將提取的牛DNA按比例稀釋后，用NanoDrop2000核酸定量測定儀測定稀釋后的DNA質(zhì)量濃度與純度，最終得到5、10、24、48、73、96、145、200、260、300 ng/μL 10 個不同質(zhì)量濃度梯度的牛DNA。按照優(yōu)化后的擴增條件進行擴增，使用微滴分析儀和QuantaSoft V1.3.2軟件對ddPCR擴增產(chǎn)物進行檢測和分析。每個體系的有效微滴數(shù)應(yīng)高于12 000 個微滴，以滿足泊松統(tǒng)計的需求，記錄有效的拷貝數(shù)濃度（C），每個梯度3 個重復，分別計算其平均值，使用Excel擬合DNA濃度與拷貝數(shù)濃度之間的標準曲線。同時通過雙通道拷貝數(shù)比值計算樣品中牛源性成分在動物源性成分中的拷貝數(shù)相對含量，計算公式如下：

1.3.7 ddPCR的抗干擾及適用性實驗

1.3.7.1 定量方法對混合牛肉樣品的抗干擾驗證

為驗證所建ddPCR方法對外源性物種的抗干擾性，以總質(zhì)量為50 mg，分別稱量不同質(zhì)量的牛肉與豬肉制成9 個質(zhì)量分數(shù)（10%～90%）的混合樣品，同時選取羊肉、驢肉、馬肉、貉子、狐貍?cè)狻㈦u肉和鴨肉7種其他肉樣與牛肉按照質(zhì)量比2∶3制成兩兩混合樣品。提取混合肉樣DNA后進行雙重ddPCR檢測。分別對樣品中的牛源性成分進行定量檢測，并計算雙通道拷貝數(shù)相對含量。

1.3.7.2 定量方法對不同牛肉樣品的適用性驗證

為驗證所建ddPCR方法對不同鮮切牛肉產(chǎn)品的適用性，分別從某市場中購買牛五花趾、牛匙柄、黃牛腿肉、黑牛腱子、黑牛吊龍等10 件不同部位、不同品種的牛肉鮮切產(chǎn)品。在線性范圍內(nèi)，分別稱取每個產(chǎn)品10、25、40 mg 3 個不同質(zhì)量梯度，對產(chǎn)品中的牛源性成分進行定量檢測，并計算雙通道拷貝數(shù)相對含量。

1.3.8 市售樣品的檢測

分別從某市場中購買牛肉及豬肉（牛肉丸、牛排、豬肉丸等）等15種不同類型的成分復雜的肉制品，提取DNA后利用建立的ddPCR方法對肉制品中牛源性成分質(zhì)量進行檢測，以驗證所建立的ddPCR實際檢測效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物和探針的設(shè)計與驗證

采用14種物種的DNA驗證牛源性引物的特異性及用動物源性引物的通用性，擴增結(jié)果如表3所示，14種物種中僅有牛DNA為模板時，可在牛源性特異引物擴增時出現(xiàn)擴增曲線，其他物種均無熒光信號值的增加。證明所設(shè)計的引物對食品中常見的肉種有良好的特異性，不會擴增出食品中常見的非牛動物源性成分，以免干擾定量的精準性。同時，動物源性通用引物擴增時，僅有空白對照組未出現(xiàn)擴增曲線，說明該通用性引物能夠用于常見動物源性成分檢測。

表3 real-time PCR特異性引物檢測結(jié)果Table 3 Results of specific primer test by real-time PCR

2.2 ddPCR擴增條件優(yōu)化

當退火溫度為60、61、62、63、64 ℃時，檢測結(jié)果如圖1所示，藍色散點為FAM通道1中通用性引物擴增成功的目標微滴，拷貝數(shù)濃度為（104±3）copies/μL，灰色散點為未發(fā)生擴增或發(fā)生非特異性擴增，熒光強度低相對較低的非目標微滴，不參與計數(shù)；綠色散點為HEX通道2中特異性引物成功擴增的目標微滴，拷貝數(shù)濃度為（106±4）copies/μL。所有退火溫度均能有效區(qū)分陰性和陽性微滴點，但在FAM通道1中，隨著擴增溫度的下降，動物源性通用引物出現(xiàn)的非特異性擴增的液滴數(shù)量上升。在模板濃度更高的情況下，可能會干擾目標基因的正常讀數(shù)，因此選擇64 ℃作為該牛源性-動物源性成分雙重ddPCR體系的退火溫度。

圖1 不同退火溫度下雙重ddPCR雙通道中拷貝數(shù)1D散點圖Fig. 1 1D scatter plots of copy number in two channels of ddPCR system at different annealing temperatures

2.3 肉樣質(zhì)量與拷貝數(shù)計算公式

2.3.1 目標肉樣質(zhì)量與DNA質(zhì)量濃度的關(guān)系

牛肉質(zhì)量在5～50 mg范圍內(nèi)，牛肉質(zhì)量與提取的DNA質(zhì)量濃度有顯著的線性關(guān)系：y1=6.926 1x1-17.167；R2=0.998 1，其中，x1代表牛肉的質(zhì)量（mg），y1代表所測得的DNA質(zhì)量濃度（ng/μL）。

2.3.2 DNA總量與DNA拷貝數(shù)的關(guān)系

在Beta-actin單拷貝基因靶標體系下，ddPCR檢測過程中每個樣品的微滴生成均在12 000以上，滿足了泊松分布計算的要求，且DNA總量與其所生成的DNA拷貝數(shù)之間有顯著的線性關(guān)系：y2=4.389 2x2+3.392；R2=0.998 5。其中，x2代表所加模板DNA總量（ng），y2代表每微升的DNA特異性擴增拷貝數(shù)（copies/μL）。

同時，在以不同質(zhì)量濃度牛肉DNA為模板擴增時，特異性引物擴增的拷貝數(shù)與通用引物擴增的拷貝數(shù)比值為1.00±0.04，表明在檢測樣品中，牛肉在動物源性成分中的相對含量為小于或等于（100±4）%，該誤差范圍包括機器微滴讀取與泊松分布計算誤差（＜5%），符合樣品含有100%牛肉的樣品性質(zhì)。

2.3.3 肉樣質(zhì)量與拷貝數(shù)換算公式的確定結(jié)果

根據(jù)目標肉樣的質(zhì)量與所提取DNA質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系及DNA質(zhì)量濃度與所測定DNA特異性擴增拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，選擇DNA質(zhì)量濃度作為中間值，推導出目標肉樣的質(zhì)量與特異性擴增拷貝數(shù)之間的關(guān)系式M牛=0.033C牛+2.37，因此可通過測定DNA特異性擴增拷貝數(shù)，計算檢測樣品中牛源性成分的質(zhì)量。其中，M牛為牛源性成分的質(zhì)量（mg），C牛為每微升的DNA特異性擴增拷貝數(shù)（copies/μL）。

2.4 ddPCR抗干擾實驗和適用性驗證

2.4.1 ddPCR的抗干擾實驗結(jié)果

在牛肉與其他肉類制成兩兩混合樣品中，牛肉定量檢測數(shù)值與實際質(zhì)量基本一致（表4），且隨著牛肉的實際質(zhì)量由5 mg上升至45 mg，定量檢測值準確性逐漸提高，相對標準偏差由12.68%降低為1.33%，說明該方法對牛肉源性成分的定值基本準確。而得到的拷貝數(shù)相對含量與牛肉實際相對含量存在明顯的偏差。由牛、豬肉兩兩混合樣品的檢測結(jié)果可得，在牛肉實際相對含量為10%時，牛肉檢測相對含量僅為2.52%，隨著牛肉含量的上升，拷貝數(shù)相對含量與實際含量相差逐漸縮小。

這可能是由于相同質(zhì)量下，豬肉中提取到的可參與通用性引物擴增的核酸分子含量高于牛肉，在大量豬肉成分存在時，通用引物的拷貝數(shù)相對提升較多，導致拷貝數(shù)相對含量明顯低于理論值。相反的情況則出現(xiàn)在存在雞、鴨源性成分時，這兩種非牛源性成分在通用性引物擴增時得到的拷貝數(shù)較低，使牛肉相對含量高于理論值。這表明通過雙通道擴增拷貝數(shù)比值計算得到的相對含量是否小于（100±4）%僅可以判斷樣品中是否存在非牛源性成分，但無法對其他動物源性成分進行定性及定量檢測。

表4 已知質(zhì)量的混合肉樣的ddPCR定量分析Table 4 Results of ddPCR for known mixed meat samples

2.4.2 ddPCR的適用性驗證

采用建立的雙重ddPCR方法對不同品種、不同部位的牛肉進行10、25、40 mg 3 個不同質(zhì)量梯度的定量鑒定。如表5所示，10 個不同部位的定量結(jié)果在10、25、40 mg 3 個不同質(zhì)量梯度時，平均值分別為9.75、26.30、36.16 mg，相對標準偏差分別為-2.52%、5.20%、-9.60%，可見不同牛肉部位的檢測結(jié)果相對偏差隨著質(zhì)量的增加而升高。這可能是由于不同部位或品種的樣品，相同質(zhì)量下的細胞含量有所差異，不同組織成分在制成干粉后DNA提取效率也不盡相同，導致擴增后的定量結(jié)果產(chǎn)生了一定的偏差。

所有樣品通過擴增雙通道中特異性引物與通用性引物的擴增拷貝數(shù)之比，得到的拷貝數(shù)相對含量為92.59%～99.01%，與牛肉實際相對含量100%基本相符，部分略低于95%的樣品如牛匙柄、黑牛里脊等鮮切產(chǎn)品，可能是由于超市加工環(huán)節(jié)或者樣品流通中的無意沾染造成的誤差。

表5 不同部位、不同品種牛肉樣品的ddPCR定量分析Table 5 Results of ddPCR for beef samples from different body parts and species

2.5 市售肉制品中牛肉成分的檢測結(jié)果

利用本研究建立的雙重ddPCR方法，對于成分復雜、肉種多樣的市售肉及肉制品進行定量鑒定（表6）。結(jié)果表明，在明確標注牛肉含量的第1～4號產(chǎn)品中，檢測結(jié)果均基本符合產(chǎn)品標注；而部分市售肉制品存在部分含量不足及摻假現(xiàn)象，如第6、10號產(chǎn)品中，牛肉定量檢測的質(zhì)量分數(shù)為3.00%與4.30%，說明該類樣品中的牛肉含量過低，同時檢測拷貝數(shù)相對含量為55.56%與98.04%，分別符合6號產(chǎn)品中含有其他動物源性成分以及10號產(chǎn)品中僅牛肉的標注；對7號樣品鮮牛肉餡的檢測發(fā)現(xiàn)，牛肉定量檢測的質(zhì)量分數(shù)為77.55%，拷貝數(shù)相對含量為81.97%，排除超市可能出現(xiàn)混裝柜臺或者共用絞肉機等器具造成的誤差，該牛肉餡樣品仍可能存在一定的摻假情況。13～15號樣品為豬肉丸，該類樣品未檢測到牛源性成分，說明所建立的ddPCR體系在復雜的食物基質(zhì)中檢測時可保持良好特異性。

表6 市售樣品的ddPCR定量分析Table 6 Results of ddPCR for commercial beef samples

3 討 論

目前，食品安全和食品原料成分摻假等問題已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注[23]，real-time PCR作為現(xiàn)在監(jiān)管部門對肉制品鑒別的常用技術(shù)手段，已漸漸不能滿足目前市場出現(xiàn)的各類復雜摻假現(xiàn)象的檢測和監(jiān)管。大量研究表明ddPCR相比于real-time PCR，尤其在在檢測低含量的核酸成分時，具有更高的準確度和靈敏度[24-26]。

市售肉制品存在原料肉種類多樣，添加劑成分復雜等情況，一些肉制品多含有凝膠等添加劑，使得部分ddPCR檢測方法檢測準確性受限[27]，劉立兵等[28]建立的鴨源性成分ddPCR定量檢測方法中，發(fā)現(xiàn)在選取鴨皮膚、脂肪或內(nèi)臟等部分，而非鴨紅肉部分作為樣品進行檢測時，會導致誤差升高。同時肉制品在生產(chǎn)加工過程中通常會受高溫、高壓等條件影響，目的DNA可能會出現(xiàn)含量降低、高度片段化等現(xiàn)象，增加檢測難度[29]。本研究建立的檢測體系主要著眼于市售肉及肉制品，通過檢驗市場上多種不同類型的肉制品進行取樣實驗，結(jié)果顯示無論在肉樣兩兩混合還是復雜的食品基質(zhì)中，對牛源性成分的檢測都與實際質(zhì)量基本一致，也發(fā)現(xiàn)了市場上的確存在部分摻假產(chǎn)品。

目前已有研究主要針對市場某些常見肉類摻假模式[30-31]，苗麗等[32]建立了一種基于ddPCR技術(shù)的牛肉與豬肉的檢測方法，可針對性的對牛肉中摻入的豬肉進行定量分析。劉立兵等[33]通過ddPCR技術(shù)分別對牛GH基因和豬PRNP基因的拷貝數(shù)進行檢測，采用固定比值法準確檢測到樣品中豬肉源性成分的質(zhì)量分數(shù)。René等[34]通過建立雙重ddPCR對不同的熒光信號進行讀取，每個雙重ddPCR體系可實現(xiàn)對羊、馬、雞等多種動物源性成分中的兩個物種的準確定量。然而，這類方法僅適用于2種肉類混合的樣本，而市售肉制品中常含有多種肉源性成分。為增加檢測肉品種類，趙新等[35]引入內(nèi)參基因，通過進行羊種屬特異性和動物源性通用性的拷貝數(shù)濃度兩次檢測，在一定摻假范圍內(nèi)，可準確定量摻有雞、鴨、豬等多種鮮凍畜、禽肉產(chǎn)品中羊源性成分質(zhì)量分數(shù)。但目前尚無包含通用動物源性成分的雙重ddPCR檢測方法，本研究所建立的基于ddPCR檢測技術(shù)的雙通道檢測技術(shù)，利用牛特異性擴增與動物源性通用性擴增的拷貝數(shù)之比，擴大了對摻假肉類種類的檢測范圍，可判斷是否存在非牛源性的其他動物成分。

另一方面，在檢測牛肉與不同物種混合樣品時，發(fā)現(xiàn)不同物種在相同的樣品質(zhì)量下，肌肉細胞數(shù)乃至DNA提取效率不盡相同[36]，導致動物源性成分通用引物在擴增各物種DNA時，拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量不成比例，這與楊華等[37]建立的檢測牛源性成分的雙重ddPCR結(jié)果一致，在樣品中摻入雞肉、鴨肉和豬肉不同肉源性成分后，其DNA拷貝數(shù)之比難以計算出其準確的組分質(zhì)量比。在相同物種的不同部位，也存在拷貝數(shù)濃度差異較大的情況，紀藝等[38]通過研究鴨的不同品種及不同部位生鮮組織的拷貝數(shù)變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)檢測核DNA時，鴨心或鴨血相較于肌肉組織較多的鴨腿部分，定量值的變異系數(shù)由4.1%升高至21%以上。因此，目前還不能通過對樣品中不同肉源性成分的DNA拷貝數(shù)比計算出其組分的質(zhì)量比，存在無法對摻假肉種類定性、定量檢測的不足之處。有待通過挖掘各物種間通用性引物擴增差異進一步改善，或建立擴增不同熒光值的靶標[39]區(qū)分不同物種ddPCR方法。