黃瓜果實冷害的發(fā)生機(jī)制與控制技術(shù)研究進(jìn)展

盧曉婷， 殷菲朧， 劉純友， 劉云芬， 帥 良

(1.賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院/廣西康養(yǎng)食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣西賀州 542899；2.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州 545000)

黃瓜(CucumissativusL.)別稱青瓜、胡瓜，是葫蘆科(Cucurbitaceae)一年生的蔓生或攀緣草本植物，雌雄同株[1]。黃瓜果實口感清脆、味甜多汁，有獨(dú)特的芳香氣味，富含水分和維生素C，食用價值高，深受消費(fèi)者喜愛。在低溫條件下，植物組織因無法進(jìn)行正常的代謝過程，會發(fā)生各種生理生化變化。黃瓜貯藏在低溫條件下冷害癥狀不明顯，在轉(zhuǎn)移至室溫下放置一段時間后，才會出現(xiàn)各種冷害癥狀：果實表皮組織呈水漬狀、變軟、褪綠黃化，并從皮孔開始出現(xiàn)明顯的點(diǎn)狀腐蝕，易被病原菌感染引起腐爛變質(zhì)[2]。因此，采取有效的措施防止、減輕黃瓜冷害的發(fā)生，對延長黃瓜的貯藏期和貨架期十分必要。

1 黃瓜冷害發(fā)生的生理生化機(jī)制

果蔬對低溫脅迫的反應(yīng)存在多樣性，最初反應(yīng)包括：膜脂相變、蛋白質(zhì)或酶功能障礙等現(xiàn)象；繼而帶來一系列生理生化反應(yīng)變化，如原生質(zhì)流動停止、溶質(zhì)滲漏增加，呼吸速率增加、乙烯生物合成的改變，及氧化磷酸化解偶聯(lián)、次級代謝產(chǎn)物含量變化等[3]。這些改變最終會引起一系列的冷害癥狀。現(xiàn)有多種不同的生理生化機(jī)制可闡釋冷害癥狀的發(fā)生，包括膜脂相變學(xué)說、活性氧代謝失調(diào)學(xué)說、能量代謝虧損學(xué)說、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)代謝異常學(xué)說[4-6]。通過討論黃瓜冷害發(fā)生的根本原因，可以探究有效的冷害控制方法。

1.1 低溫對膜脂代謝的影響

一般來說，植物受到低溫脅迫時，細(xì)胞膜會最先感知寒冷繼而引起相變，從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)變?yōu)楣虘B(tài)、難以流動。植物細(xì)胞在短期低溫脅迫范圍內(nèi)通過調(diào)節(jié)其生理代謝來適應(yīng)低溫，否則由于膜脂代謝失衡而發(fā)生冷害，這是目前普遍接受的產(chǎn)生冷害的根本原因[7]。主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、膜結(jié)合酶能力下降，膜選擇透過性增加和破壞、胞內(nèi)電解質(zhì)大量滲漏[4]。

低溫脅迫直接導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，故通常用電解質(zhì)外滲率來表征果蔬細(xì)胞膜透性的破壞情況。此外，細(xì)胞膜損傷主要是由膜脂過氧化引起的，可通過多種反應(yīng)了解其氧化的程度。丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平的上升和膜脂肪酸成分變化就是膜結(jié)構(gòu)和功能改變帶來的現(xiàn)象[8]。MDA是膜多不飽和脂肪酸快速過氧化作用產(chǎn)物，低溫環(huán)境下果蔬中MDA含量的增加與冷害癥狀的出現(xiàn)基本一致[4]，故其含量可以評價黃瓜果實細(xì)胞膜系統(tǒng)氧化損傷的程度。果蔬中不飽和脂肪酸有利于維持細(xì)胞膜在低溫下的穩(wěn)定性，降低膜的相變溫度，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，減輕冷害損傷。故膜脂肪酸含量和不飽和度的高低可以作為衡量膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)，若氧化嚴(yán)重會出現(xiàn)脂肪酸飽和度升高、磷脂和半乳糖值降低等情況，而且不飽和度越高，膜的流動性越強(qiáng)。

磷脂是生物膜的主要成分，而低溫貯藏引發(fā)冷害會造成磷脂降解。磷脂酶D(phospholipase D，PLD)可將磷脂水解成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，引起膜負(fù)彎曲和功能障礙，磷脂酶C(phospholipase C，PLC)和磷脂酶A(phospholipase A，PLA)在低溫下也能催化甘油磷脂的降解，造成不可逆的膜損傷，脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)可增強(qiáng)植物細(xì)胞膜的流動性和脂質(zhì)的不飽和性[9-11]，所以通過磷脂酶和脂氧合酶的活性變化可以判斷膜脂代謝情況。

1.2 低溫對活性氧代謝的影響

1.3 低溫對能量代謝的影響

先前研究已表明，細(xì)胞膜損傷與細(xì)胞能量損失有關(guān)[17]。在低溫脅迫下，植物為維持自身生命活動需要，能量損耗增加導(dǎo)致線粒體活性增強(qiáng)、ROS積累，從而影響線粒體上的酶和電子傳遞鏈，使膜透孔道被打開，導(dǎo)致線粒體功能異常、能量利用效率下降。此外，氧化磷酸化的解偶聯(lián)會降低細(xì)胞合成的三磷酸腺苷(ATP)水平[3]。因此，認(rèn)為減輕低溫脅迫影響的機(jī)制可能與高水平ATP和能荷有關(guān)。

能荷水平的變化直接取決于能量代謝。線粒體H+-ATPase、Ca2+-ATPase、琥鉑酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)和線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，CCO)是能量代謝過程中的關(guān)鍵酶，這些酶的變化能反映線粒體的功能及合成能量的變化，其活性可被作為細(xì)胞能量代謝的指標(biāo)[18]。研究表明，果蔬中這4種酶的活性會隨著低溫貯藏時間的延長逐漸降低，果蔬的冷害程度也隨之加深。姜玉等研究發(fā)現(xiàn)，外源水楊酸處理能通過提高H+-ATPase、Ca2+-ATPase、SDH和CCO的活性，維持細(xì)胞內(nèi)的能量代謝平衡，從而使黃瓜果實內(nèi)的ATP含量和能荷保持在較高水平，延緩冷害的發(fā)生[19]。結(jié)果表明，通過增強(qiáng)能量代謝相關(guān)酶活性、提高能量狀態(tài)和不飽和/飽和脂肪酸比值，促進(jìn)能量代謝正常進(jìn)行，進(jìn)而可減輕黃瓜果實采后發(fā)生冷害。

1.4 低溫對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)代謝的影響

現(xiàn)有研究結(jié)果普遍認(rèn)為，果實的質(zhì)地主要取決于果實中果膠、纖維素、半纖維素等細(xì)胞壁物質(zhì)的含量。低溫脅迫同樣影響果實中與果膠降解有關(guān)的酶活性，一方面抑制了β-半乳糖苷酶和纖維素酶活性上升，造成其果膠質(zhì)的降解受阻[20]；另一方面，果膠甲酯酶活性增強(qiáng)、多聚半乳糖醛酸酶活性減弱，兩者變化不協(xié)同，導(dǎo)致細(xì)胞壁中的果膠代謝異常、果實不能正常軟化。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)，果蔬在采后低溫貯藏過程中發(fā)生冷害，誘導(dǎo)可溶性果膠增溶、使果實過分綿軟[6]，果實表面凹陷癥狀的發(fā)生實際上是由細(xì)胞死亡和細(xì)胞塌陷引起的。李佳樂等用梯度熱水處理有效減輕了貯后黃瓜冷害，并證明抑制黃瓜果膠酶、纖維素酶及β-葡萄糖苷酶等細(xì)胞壁水解酶活性的上升，可延緩原果膠的水解及纖維素的分解，保持果實較高的硬度[21]。

1.5 低溫對次級代謝產(chǎn)物的影響

腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)等多胺類(Polyamines，PAs)是一類與植物激素類似的胺類化合物，具有脂肪族氮結(jié)構(gòu)，在高等植物的分生組織和生長旺盛的組織中的濃度較衰老組織中高，在植物受到非生物脅迫時也會積累[22]。研究表明，低溫誘導(dǎo)植物組織中多胺含量增加，而高水平的多胺可有效緩解果蔬的冷害癥狀并延長貯藏期[23]。在低溫條件下，黃瓜果實在冷害癥狀出現(xiàn)之前，呈現(xiàn)內(nèi)源腐胺和亞精胺開始大量增加、精胺含量較低且無明顯變化規(guī)律[24]。研究證明，多胺處理會提高植物對低溫的耐受性，施用亞精胺提高了黃瓜果實抗氧化酶活性和耐冷性，腐胺則通過抑制1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)合酶的合成和活性減緩了乙烯的生物合成[25-26]。因此，多胺可作為激發(fā)應(yīng)激保護(hù)反應(yīng)的激發(fā)子，補(bǔ)償?shù)蜏貞?yīng)激的負(fù)面影響。

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白氨基酸，是植物體內(nèi)重要的內(nèi)源信號分子，對植物的脅迫響應(yīng)、生長發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[27]。在植物中，細(xì)胞內(nèi)GABA水平通常較低，但它們在干旱、鹽分和低溫脅迫下可迅速大量積累，并參與抵御這些脅迫，在黃瓜采后冷害中也有針對性研究[28，11]。其代謝途徑由3種酶組成：谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，GAD)、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(γ-aminobutyrate aminotransferase，GABA-t)和琥珀酸半醛脫氫酶，其中，GAD是形成GABA的關(guān)鍵酶。在冷脅迫下，胞內(nèi)Ca2+形式的復(fù)合物與鈣調(diào)素(CaM)的水平升高，促進(jìn)GAD催化谷氨酸形成GABA[28]。通過多胺分解途徑，GABA可以進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化。Spd、Spm經(jīng)多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)催化成Put、Put再經(jīng)二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)催化生成代謝產(chǎn)物GABA；GABA還可以通過GABA-t轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，然后轉(zhuǎn)化為琥珀酸參與三羧酸循環(huán)反應(yīng)[29]。

脯氨酸是一種具有特殊剛性構(gòu)象的氨基酸，常常參與調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡，維持細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，還能作為活性氧清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑[30]。有證據(jù)表明，脯氨酸含量與果蔬抗冷性呈正相關(guān)，說明脯氨酸積累可能是高等植物抵抗低溫脅迫的另一適應(yīng)機(jī)制[31]。在高等植物中，脯氨酸一般通過Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)由谷氨酸合成，也可通過鳥氨酸-δ-轉(zhuǎn)氨酶(ornithineδ-aminotransferase，OAT)由鳥氨酸替代合成，增強(qiáng)P5CS和OAT活性可以提高脯氨酸的生物合成能力[30]。脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase，PDH)是催化脯氨酸發(fā)生降解的酶，抑制PDH活性有利于降低脯氨酸的分解。這3種酶對植物體內(nèi)脯氨酸合成與降解形成動態(tài)的調(diào)節(jié)與控制，它們活性的改變是引起果實中脯氨酸含量變化的原因。

綜上所述，研究采后處理對低溫脅迫下植物體內(nèi)多胺、γ-氨基丁酸和脯氨酸代謝及相關(guān)酶活性的影響，可為3種物質(zhì)積累的生理意義提供更有價值的信息。

2 黃瓜冷害的分子機(jī)制

分析和驗證冷脅迫相關(guān)基因，探究黃瓜抗低溫冷害機(jī)制，可為誘導(dǎo)黃瓜耐冷性和預(yù)防貯藏冷害奠定基礎(chǔ)。低溫可影響調(diào)控酶的RNA和DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯和細(xì)胞代謝[32]。目前研究中，主要通過轉(zhuǎn)錄組篩選鑒定低溫脅迫下差異表達(dá)的冷害相關(guān)酶、基因和轉(zhuǎn)錄因子，探究減輕采后冷害的潛在機(jī)制，確定介導(dǎo)植物適應(yīng)低溫的特異性分子，為植物抗冷性的產(chǎn)生提供了新的線索。

2.1 黃瓜耐低溫相關(guān)基因及功能研究

Kong等發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下出現(xiàn)冷害癥狀，通常伴隨著細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、膜脂質(zhì)過氧化及編碼PLD、LOX的基因CaPLD和CaLOX活性和表達(dá)的增加[7]；同時，低溫誘導(dǎo)了CaPLDα4轉(zhuǎn)錄本的強(qiáng)積累，且受CaNAC1轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控，而CaPLDα4在植物的非生物脅迫中起著重要作用[33]。更進(jìn)一步來講，褪黑素能通過上調(diào)CaGAD、CaP5CS、CaOAT和下調(diào)CaPDH基因的轉(zhuǎn)錄水平，觸發(fā)黃瓜的脯氨酸代謝酶系統(tǒng)調(diào)節(jié)膜滲透，增強(qiáng)抗冷性[31]。類似地，隨著貯藏時間的延長，ATPase、NAD和VPP的酶活性和基因表達(dá)均呈下降趨勢，但PLD活性和基因表達(dá)明顯提高[34]，這與上述細(xì)胞膜損傷和能量缺乏誘導(dǎo)冷害發(fā)生的機(jī)制相呼應(yīng)，說明這些與膜脂代謝、活性氧代謝、能量代謝相關(guān)酶的活性和基因表達(dá)水平的變化可導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化和能量損失，從而使果實發(fā)生冷害。

黃瓜中有多個與低溫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，這些成員通過調(diào)節(jié)相關(guān)防御基因的表達(dá)，參與響應(yīng)冷害的耐受性。如，熱激轉(zhuǎn)錄因子CsHSFs基因的表達(dá)與熱處理和冷鍛煉誘導(dǎo)的黃瓜果實耐冷性有關(guān)，其中，CsHSF7、CsHSF11響應(yīng)低溫脅迫、表達(dá)量顯著升高[35]。乙烯響應(yīng)因子(ethylene-responsive factors，ERFs)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在響應(yīng)生物及非生物逆境中發(fā)揮重要作用。通過分析ERF轉(zhuǎn)錄因子在黃瓜冷害及減輕冷害的進(jìn)程中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)29個ERF基因可能與黃瓜果實冷害相關(guān)，且認(rèn)為CsERF基因和黃瓜組蛋白去乙?；富駽sHDAs的表達(dá)水平與黃瓜果實冷害有一定關(guān)系[36]；更進(jìn)一步的，CsERF17能夠識別并結(jié)合膜脂合成代謝相關(guān)基因的啟動子并激活它們的活性，說明ERF轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控膜脂合成代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控低溫脅迫下黃瓜的膜脂合成代謝，減少冷害發(fā)生[37]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物免疫反應(yīng)、發(fā)育和衰老的調(diào)控，已在黃瓜中發(fā)現(xiàn)61個WRKY家族基因[38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)黃瓜細(xì)胞核中的CsWRKY46基因使轉(zhuǎn)基因植株具有抗寒性，并以脫落酸(abscisic acid，ABA)依賴途徑正向調(diào)控冷信號通路[39]。CBF轉(zhuǎn)錄激活因子CBF1、CBF2和CBF3(DREB1b、DREB1c和DREB1a)與許多低溫誘導(dǎo)基因調(diào)控區(qū)域中的CRT/DRE元件結(jié)合，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄激活，從而控制植物對低溫的反應(yīng)，如過表達(dá)G蛋白Gγ亞基同源基因CsGG3.2使黃瓜對低溫脅迫表現(xiàn)出耐受性，緩解低溫?fù)p傷，同時增加CBF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及對其的調(diào)控[40-41]。

miRNA(microRNA)是一類來自真核生物、長度為18～24 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用。miRNA介導(dǎo)的基因反應(yīng)是植物響應(yīng)非生物脅迫的又一潛在機(jī)制。在逆境環(huán)境下，miRNA通過與目標(biāo)基因mRNA堿基互補(bǔ)配對，對目標(biāo)mRNA進(jìn)行剪切或翻譯抑制，或是調(diào)節(jié)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)來降解目標(biāo)基因的mRNA，使果蔬對各種環(huán)境脅迫做出反應(yīng)[42]。近年來，miRNA在植物逆境適應(yīng)過程中的調(diào)控作用已經(jīng)有越來越多的報道。低溫會影響甘薯抗逆應(yīng)答miRNA的表達(dá)，這些miRNA是通過靶向一個蛋白質(zhì)編碼基因來調(diào)節(jié)甘薯對溫度脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[43]，雖然大部分miRNA與靶基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)水平，但也有可能存在正向調(diào)控機(jī)制。不同表達(dá)水平的miRNA關(guān)鍵基因參與不同途徑的調(diào)節(jié)，miR319通過活性氧代謝參與番茄對低溫脅迫的耐受調(diào)節(jié)[44]、miR528通過靶向多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)在低溫下引起香蕉果皮褐變[45]。

2.2 黃瓜耐低溫相關(guān)蛋白及功能研究

目前，研究中發(fā)現(xiàn)多個蛋白與黃瓜耐冷性密切相關(guān)。冷馴化(pre-storage cold accuration，PsCA)可以減輕黃瓜果實的冷害，上調(diào)DNA損傷誘導(dǎo)蛋白1(CsDDl1)，提示冷馴化誘導(dǎo)的黃瓜耐冷性涉及CsDDl1的轉(zhuǎn)錄[46]。植物富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白(GR-RBP)在響應(yīng)非生物脅迫方面的作用在黃瓜果實中也有體現(xiàn)，如PsCA顯著上調(diào)了低溫下黃瓜果實中CsGR-RBP3的轉(zhuǎn)錄水平，而過表達(dá)CsGR-RBP3顯著上調(diào)了9個參與抗低溫等防御反應(yīng)的擬南芥基因，說明CsGR-RBP3在誘導(dǎo)黃瓜抗冷性中發(fā)揮了積極的作用[47]。通過蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，貯前冷馴化使低溫貯藏黃瓜中12個蛋白出現(xiàn)差異積累，而且大多數(shù)上調(diào)的蛋白質(zhì)的積累與轉(zhuǎn)錄本水平的上升趨勢高度一致[48]。

目前，關(guān)于黃瓜耐低溫蛋白的研究鮮有報道，對于相關(guān)蛋白如何受低溫影響、在轉(zhuǎn)錄水平的變化以及它們參與低溫響應(yīng)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，探究黃瓜耐低溫響應(yīng)途徑及調(diào)控因子的研究對于黃瓜耐低溫脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制研究具有非常重要的意義。

2.3 黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

植物響應(yīng)低溫是一個非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。ROS可以作為關(guān)鍵的信號分子參與下游信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)逆境脅迫相關(guān)基因表達(dá)，使植物能更好地在逆境脅迫條件下生存。僅有的一些研究表明，植物體內(nèi)存在一些可能的ROS信號受體，如擬南芥中的乙烯受體ETR1、乙烯響應(yīng)因子ERF6及熱激轉(zhuǎn)錄因子HSF可能參與對ROS信號的響應(yīng)，同時，ROS還可提高多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，包括WRKY、bZIP、MYB基因家族等[49-52]。此外，ROS的下游信號可能還涉及Ca2+和Ca2+相關(guān)蛋白、一氧化氮(NO)、ABA等，如ABA可通過誘導(dǎo)H2O2的快速產(chǎn)生調(diào)控NO的產(chǎn)生進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)ABA信號途徑中抗氧化酶基因表達(dá)與活性[53-54]。

脫落酸(abscisic acid，ABA)是一種廣泛存在于高等植物中的內(nèi)源激素，是植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的重要信號物質(zhì)[55]。在低溫條件下ABA積累與其生物合成的增加相關(guān)，同時表現(xiàn)為ABA在低溫下調(diào)控許多下游基因表達(dá)，如激活黃瓜葉片中冷誘導(dǎo)基因CBF1和黃瓜果實中CsGR-RBP3的表達(dá)來提高耐冷性[47，55-56]。ABA合成途徑中的關(guān)鍵酶 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED)、玉米黃酯環(huán)氧化酶(eaxanthin epoxidase，ZEP)、乙酸醛氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)活性及其基因表達(dá)上調(diào)，促使ABA含量大幅上升，植物抗逆性增加[52]。ABA信號傳導(dǎo)途徑中的核心反應(yīng)是由ABA受體 PYR/PYL/RCARs(pyracbactin resistance/pyracbactin resistance-like/regulatory component of abscisic acid receptor)、正調(diào)控因子蔗糖非酵解相關(guān)蛋白激酶2(sucrose non-fermented related protein kinase 2，SnRK2)、負(fù)調(diào)控因子蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C，PP2C)組成的信號調(diào)控系統(tǒng)在低溫刺激下迅速誘導(dǎo)ABA積累，ABA與受體PYR/PYL/RCAR結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致PP2C活性被抑制，從而激活靶向膜蛋白、離子通道和轉(zhuǎn)錄因子的SnRK2，促進(jìn)ABA響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，從而提高植物對低溫的耐受性[55]。施用外源ABA發(fā)現(xiàn)，ABA處理促進(jìn)了抗氧化酶活性，推遲了冷害癥狀且抑制了衰老劣變[57]，同時提高了脯氨酸含量，降低了膜脂過氧化，有效緩解了細(xì)胞膜損傷，增加了植物耐冷性[58-59]。此外，ABA還可通過調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動，以增強(qiáng)植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的能力[52]。

3 冷害的控制措施

運(yùn)用適當(dāng)?shù)奶幚矸椒ㄕT導(dǎo)黃瓜的耐冷性，以提高黃瓜抗冷性和延緩采后低溫貯藏冷害發(fā)生的重要方式，包括溫度調(diào)節(jié)(如熱處理[60]和冷處理[61-62])、控制采后貯藏條件(如提高環(huán)境濕度[63]、改良?xì)庹{(diào)貯藏[64])、紫外線照射[65]等物理方法，及施用水楊酸、茉莉酸甲酯、硝普鈉、多胺等化學(xué)物質(zhì)[11，66]。通過這些處理改善冷害的發(fā)生，包括維持細(xì)胞膜完整性和高能狀態(tài)，改善抗氧化系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞壁正常修飾，及誘導(dǎo)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累[67-70]。以下討論了冷害控制方法的有效性和可能的控制機(jī)制。

3.1 溫度調(diào)節(jié)處理

階段降溫可與預(yù)冷處理相結(jié)合，將階段降溫處理的前段視為去除田間熱的采后預(yù)冷環(huán)節(jié)，使果蔬既達(dá)到預(yù)冷的效果，同時誘導(dǎo)耐冷性。王斌等使用冷庫[62]、代慧等利用泡沫箱的隔熱性[71]，均使貯藏黃瓜實現(xiàn)逐漸降溫的效果，增強(qiáng)了黃瓜果實的抗冷性，減少了瞬間低溫對細(xì)胞膜的傷害，維持了更高的抗氧化活性，減輕了冷害的發(fā)生。

冷激處理(cold shock treatment，CST)是指對采后果實做不致發(fā)生冷害和凍害的短時低溫處理，以延長貯藏時間、提高果蔬貯藏品質(zhì)的物理保鮮方法。冷激處理下，果蔬呼吸強(qiáng)度降低，有效延緩了果蔬后熟進(jìn)程，提高了膜脂過氧化保護(hù)酶的活性，減輕了黃瓜貯藏中的冷害[72]。因此，黃瓜在處于冷害溫度范圍內(nèi)運(yùn)輸時，可通過預(yù)先冷激的方法減輕冷害以減少損失。

熱激處理通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性、抑制活性氧產(chǎn)生，增加多胺和脯氨酸含量以及誘導(dǎo)熱激蛋白的積累，提高果蔬對冷害的耐受性。黃瓜經(jīng)過合適溫度熱激處理，硬度增大，失質(zhì)量率、LOX活性、氧自由基含量減小，這說明適宜的熱激處理能夠延緩膜脂過氧化發(fā)生，達(dá)到減輕冷害、延長貯藏期的作用[73-74]。采前對黃瓜果實進(jìn)行高溫處理，采后 10 ℃ 的貯藏條件下仍能保持較好的耐冷性[75]。喬勇進(jìn)通過熱處理顯著提高黃瓜內(nèi)源多胺的含量來減輕冷害發(fā)生[24]。

間歇升溫是指將果蔬產(chǎn)品在低溫生長或貯藏期間1次或多次移至常溫一段時間來中斷低溫傷害。這種方法使受損的冷凍組織在暴露于溫暖的溫度時得以修復(fù)，同時分解冷害條件下積累的有毒物質(zhì)并補(bǔ)充冷害中消耗的物質(zhì)，提高細(xì)胞代謝活性，降低冷害發(fā)生率[23]。但需要注意溫度變化速度和平均溫度梯度，避免因熱損傷造成軟化、黃化等不良現(xiàn)象。

3.2 氣調(diào)貯藏

氣調(diào)貯藏是目前較為先進(jìn)的果蔬貯藏手段，實質(zhì)是在冷藏的基礎(chǔ)上對氣體成分進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過抑制果蔬采后呼吸作用來實現(xiàn)采后保鮮，主要分為人工氣調(diào)貯藏(CAS)和自發(fā)氣調(diào)包裝(MAP)[23]。冷害溫度下，氣體成分對冷害的影響有顯著性差異，其中，5% O2和1% CO2處理組效果最佳[76]。用袋密封包裝的黃瓜比未包裝的黃瓜遭遇的冷害要輕，可能是因為密封袋內(nèi)CO2濃度上升、O2濃度下降，延緩了抗氧化酶活性降低，同時低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的高水平多胺也有助于提高果實的耐冷性[77]。因此，可結(jié)合氣調(diào)貯藏進(jìn)行黃瓜果實的貯運(yùn)，以減輕低溫貯藏冷害的影響，提高采后黃瓜的貨架期。

3.3 紫外線輻射處理

紫外線照射已在多種果蔬的采后低溫貯藏中有所應(yīng)用，紫外線短期處理能有效減輕冷害，能夠延緩微生物的侵襲和衰老。短時間紫外線照射減緩果實軟化速度，不僅能刺激生成乙烯，還使多胺的積累有增加的趨勢、提高黃瓜果實的總抗氧化能力，這些反應(yīng)可能均有利于提高果實組織對抗衰老和冷害能力[78-79]。

3.4 高濕環(huán)境處理

高濕貯藏能夠顯著抑制黃瓜果實冷害指數(shù)和失重率的升高，減少水分、葉綠素、抗壞血酸、氨基酸等物質(zhì)的損失，顯著增加抗氧化酶活性和抗氧化能力，減輕ROS對細(xì)胞膜的損傷作用，較好地維持了黃瓜果實在低溫冷藏期間的品質(zhì)，展示出良好的發(fā)展應(yīng)用前景[63]。

3.5 涂膜處理

涂膜處理主要是減慢蒸騰的速度、降低呼吸強(qiáng)度，抑制采后果實中的水分從組織流失，防止表皮下的細(xì)胞塌陷形成凹陷，如使用食用蠟[80]提高商品外觀，降低冷害程度；它的作用方式還可能是涂層具有抗氧化效果，減緩膜脂過氧化的發(fā)生、抑制細(xì)胞膜透性上升，如低溫下采用1.00%殼聚糖涂膜有效地延遲了黃瓜冷害出現(xiàn)的時間，改善了黃瓜在低溫下的貯藏品質(zhì)[81]。

3.6 化學(xué)處理

水楊酸(salicylic acid，SA)是一種廣泛存在于植物防御反應(yīng)中重要的信號分子，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中的許多過程[82]。前人研究發(fā)現(xiàn)采用水楊酸處理可減輕黃瓜冷害的發(fā)生，其誘導(dǎo)抗冷性的機(jī)制有多種猜測，主要認(rèn)為外源SA處理能夠降低果實ACC的積累，調(diào)節(jié)H2O2相關(guān)的氧化脅迫反應(yīng)，誘導(dǎo)抗氧化酶活性，有效抑制細(xì)胞膜過氧化作用[83]；也有的使黃瓜保持較高的能荷水平、提高脯氨酸和多胺含量使冷害癥狀減輕[19，23]。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是植物體內(nèi)的信號分子，對植物生長發(fā)育起調(diào)控作用，在植物遭受逆境脅迫時發(fā)揮著重要作用。外源MeJA溶液處理抑制了黃瓜果實冷害的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)在貯藏期間膜透率和脯氨酸含量降低，CAT、P5CS、OAT和GAD活性升高，說明MeJA可能通過影響活性氧代謝、脯氨酸含量和GABA代謝來緩解冷害作用[84]。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是植物體內(nèi)參與多種生理過程的重要信號分子，參與植物葉片和根的生長發(fā)育、果實的成熟和衰老、抗逆等過程[85]。許多研究表明，內(nèi)源NO能通過抑制ROS的積累來保護(hù)植物細(xì)胞、對抗氧化應(yīng)激，并阻礙細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)性損傷。Yang等對黃瓜果實進(jìn)行適宜濃度的一氧化氮處理，發(fā)現(xiàn)NO通過改善抗氧化系統(tǒng)減緩了膜脂過氧化作用，進(jìn)而提高了黃瓜的抗冷性[68]。外源NO處理提高耐冷性，還可能通過調(diào)節(jié)脯氨酸代謝、抑制乙烯生成來降低果蔬冷害和品質(zhì)劣變[86-87]。

6-芐基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是人工合成的細(xì)胞分裂素類化合物，對人體無毒害，但應(yīng)用實例較少。目前，研究表明，6-BA處理可提高SOD、CAT等抗氧化酶的活性，并維持能量供給平衡，使黃瓜的冷害癥狀減輕[16]。

4 總結(jié)與展望

黃瓜作為深受人們喜愛的蔬菜作物，在我國種植廣泛、在市場上的需求量高，發(fā)展前景廣闊。黃瓜果實采后常用低溫貯藏進(jìn)行保鮮，以保證其貨架期壽命及商品價值。然而，冷鏈貯運(yùn)過程中長時間的低溫不良影響，會引發(fā)黃瓜果實一系列生理生化變化，使其產(chǎn)生冷害癥狀，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，減緩和防止低溫貯藏造成的冷害，對黃瓜采后貯藏保鮮具有十分重要的意義。

闡明果蔬冷害機(jī)制是尋求有效控制果蔬冷害新方法的理論基礎(chǔ)。綜合現(xiàn)有的研究成果，對黃瓜冷害產(chǎn)生的機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識，目前主要有膜脂相變理論、活性氧自由基傷害理論、能量虧損理論、細(xì)胞壁降解理論，以及冷害同植物激素、次級代謝產(chǎn)物、冷害相關(guān)信號途徑之間的聯(lián)系，不同的響應(yīng)機(jī)制對應(yīng)延緩和降低冷害癥狀的有效措施也各不相同。隨著高新技術(shù)的發(fā)展，全轉(zhuǎn)錄組、代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，這為從更深層次解析黃瓜冷害的發(fā)生機(jī)制提供了便利，如篩選出黃瓜果實對低溫應(yīng)激的miRNA/靶標(biāo)組合，驗證miRNA及其靶基因在低溫下的差異表達(dá)，更深入地探究了解黃瓜果實在冷害溫度脅迫下的分子調(diào)控機(jī)制。

在防止或減輕采后果蔬低溫貯藏冷害措施方面，目前主要有熱處理、冷激處理、氣調(diào)貯藏、紫外輻射和化學(xué)處理等，但其如何減輕冷害的確切機(jī)制仍然不清楚。不同控制技術(shù)之間還可以相互結(jié)合優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)的抗冷害效果?？紤]到影響果蔬采后低溫貯藏冷害的因素，除了貯藏環(huán)境等外界因素外，還要注意黃瓜本身所具有的特性與冷害發(fā)生的聯(lián)系；在今后的研究中，可以選擇利用基因工程的手段培育出耐低溫、抗冷害的黃瓜新品種，從根本上保證各種質(zhì)資源的品質(zhì)。