干腌火腿中肽的形成機理研究進展

李平，張志，周輝*，周凱，王兆明，馬曉鐘，徐寶才*

1(農產品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥，230009)2(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥，230009) 3(安徽旺德福食品有限公司，安徽 淮北，235000)4(金字火腿股份有限公司，浙江 金華，321000)

干腌火腿具有悠久的歷史，其加工工藝繁瑣，對原料產地、加工環(huán)境要求嚴格，因此火腿具有特殊的風味。長期的發(fā)酵也讓腿肉中的營養(yǎng)物質更易被人體吸收，更快補充蛋白質、脂質和微量元素，成為深受世界消費者喜愛的產品。聞名世界的火腿包括：中國浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、云南宣威火腿與諾鄧火腿、西班牙的伊比利亞火腿與塞拉諾火腿、意大利的帕爾馬火腿與圣丹尼火腿、法國的巴約納火腿、德國黑森林火腿等。從地理位置來看，優(yōu)質火腿產地主要集中在中國和地中海地區(qū)，從產品特點來看，火腿肉香濃郁、色澤鮮艷，且食用方式多樣，可以佐餐、炒制或是熬湯提鮮。經過近幾十年的發(fā)展，干腌火腿在加工過程中產生的多種功能性肽已成為研究的熱點。

功能性肽(尤其動物來源的肽)是指來自動物食物中由 2～30 個氨基酸組成且對生物機體的活動有益或具有生理作用的肽類化合物[1]，一般分為生物活性肽和呈味肽。生物活性肽是指除基礎的營養(yǎng)功能外，還可在生物體內起重要的生理作用，發(fā)揮特定生理功能的肽類物質，一般具有調節(jié)血壓、提高免疫力、消除炎癥、降低膽固醇、降低血脂和抗凝血等作用[2-3]。呈味肽是干腌火腿產品特殊滋味的重要來源，呈味肽產生于蛋白質降解，主要包含的特征滋味有：鮮味、甜味、苦味、酸味、咸味及濃厚感。國內外對呈味肽的研究為產品品質的提升以及新產品的研發(fā)提供了重要的理論依據。

干腌肉制品具有獨特的加工工藝以及漫長的加工過程，期間肌肉蛋白質降解程度高，富含多肽，成為天然功能性肽的重要來源。目前，國內外針對干腌火腿中功能性肽的研究集中在生物活性肽的功能特性和呈味肽的呈味機理，本文綜述近年來國內外干腌火腿中的功能性肽及其產生機理的相關報道，旨在為干腌火腿品質提升和新工藝設計提供理論指導。

1 干腌火腿中肽的功能特性研究

1.1 干腌火腿中肽的生物活性

干腌火腿在原料加工過程中，由于內源酶和微生物的共同作用，肌肉蛋白質發(fā)生顯著降解，產生一系列具有特定生物活性的肽。國內外學者對火腿中生物活性肽的研究較多，總結起來有以下功能特征：抗氧化活性、降血壓活性、抗菌活性以及降血糖和抗炎癥功能?？寡趸钚匝芯砍晒芏?，西班牙干腌火腿、浙江金華火腿、云南宣威火腿等均分離出具有較強的抗氧化活性肽[4-6]。肽的抗氧化活性主要與氨基酸序列有關而且抗氧化肽序列中通常含有疏水性氨基酸殘基，一般來說疏水性越高，肽的抗氧化能力越強[7-8]。降血壓肽主要通過抑制血管緊張素I轉移酶 (angiotensin I converting enzyme，ACE) 的活性進而抑制血管收縮發(fā)揮降低血壓的作用。目前，在西班牙傳統(tǒng)干腌火腿、伊比利亞火腿以及浙江金華火腿中均發(fā)現了降血壓肽[9-11]。降血壓肽通常在肽段的C末端和N末端對氨基酸種類有特殊要求，使得肽的結構與ACE的作用底物血管緊張素I類似，因而能與ACE結合，使得ACE失去原有的活性[12]?？咕牡墓δ軐崿F依賴于其兩親性的結構，該結構使得抗菌肽更容易通過細胞膜，干擾細胞正常的功能進而發(fā)揮抑菌作用[13]。邢璐娟等[14]在云南宣威火腿中提取分離出對大腸桿菌O157和單增李斯特菌的抗菌肽，CASTELLANO等[15]在西班牙干腌火腿中提取分離得到對單增李斯特菌具有抑制作用的抗菌肽。

隨著眾多國內外學者對干腌火腿中生物活性肽的研究不斷深入，具有其他功能的生物活性肽也逐漸被發(fā)現，如在西班牙干腌火腿中提取分離得到對二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)具有抑制作用的肽[16]，而DPP-IV是II型糖尿病治療的靶點，因此該活性肽能有效降低血糖濃度。GALLEGO等[17]在干腌火腿中提取得到能夠降低機體炎癥反應的肽。

國內對于降血糖肽和抗炎癥肽的研究尚未有文獻報道，新型生物活性肽的提取分離和功能特性研究是干腌肉制品研究領域的熱點，未來從干腌肉制品中提取天然生物活性肽，在解決當今人類面臨的重大健康疾病難題中將發(fā)揮重要作用。

1.2 干腌火腿中肽的呈味特性

干腌火腿的風味主要由滋味和香味組成，來源于原料在加工過程中發(fā)生的美拉德反應、蛋白質水解、脂質氧化以及其他成分的降解。香味物質一般具有揮發(fā)性，主要來源于食品中各類營養(yǎng)素的化學反應，形成各種醛類、醇類、酯類、酸類、酮類和烴類等物質。在火腿的滋味特征中，各類呈味肽發(fā)揮著重要作用，呈味肽是指在產品中呈現滋味的肽，來源于加工過程中蛋白質的降解。研究表明呈味肽在發(fā)酵食品中是重要的風味物質，可以呈現出苦味、鮮味或濃厚味[18]。

火腿中鮮味肽的研究成果較多，大多數鮮味肽為二肽、三肽等低分子寡肽。谷氨酸和天冬氨酸作為具有鮮味的氨基酸，由于本身能有效提升產品中的鮮味，在鮮味肽的增鮮作用研究中也通常將二者作為特征氨基酸。1978年，YAMASAKI等[19]用木瓜蛋白酶水解牛肉，得到的一種氨基酸序列為 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala 的八肽，命名為鮮味肽。目前在其他肉制品如豬肉、魚肉和植物產品如大豆、小麥中均發(fā)現了鮮味肽，尤其對發(fā)酵制品如發(fā)酵魚、火腿、醬油等鮮味肽的研究較多。王娟[20]對金華火腿中的小肽進行分離純化和鑒定，結果表明Ser-Glu、Val-Glu、Leu-Glu、Glu-Glu-Glu和Glu-Gly-Ser這5種肽呈現出鮮味特征。DANG等[21]發(fā)現意大利帕爾瑪火腿和金華火腿的鮮味肽在呈味特征上有一定的相似性，其中金華火腿鮮味肽氨基酸序列為Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val、帕爾瑪火腿鮮味肽序列為Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr。在酸、甜、苦、咸、鮮5種滋味的基礎上，濃厚感是指能夠提高滋味的后味，進一步豐富食品的整體味感、增強滋味的持續(xù)性和延滲性，使人深感味的厚度和廣度[22]。UEDA等[23]從大蒜中分離出的具有鮮味增強作用的氨基酸衍生物，目前具有濃厚感作用的肽類物質主要是γ-谷胱甘肽、γ-谷氨酰肽類以及一些低分子肽類[24]。

苦味肽主要以寡肽的形式存在于干腌火腿中，SENTANDREU等[25]從西班牙干腌火腿中通過色譜法分離提取得到許多苦味二肽，氨基酸序列測定為 Ile-Val、Leu-Gly、Ile-Asp 和 Pro-Leu。王娟[20]在金華火腿中分離出呈苦味的寡肽Pro-Leu和Leu-Lys。多數研究表明肽的苦味和其疏水性關系密切，肽的疏水性使肽能夠在口腔中與苦味受體的活性部位結合，從而產生苦味[26]。其他類別的呈味肽如甜味肽、酸味肽和咸味肽在干腌火腿中的研究較少。

2 干腌火腿中肽的形成機理研究

干腌火腿的加工過程包括原料腿篩選、腌制、晾曬整形、發(fā)酵和后熟，較長的加工時間導致肌肉蛋白質發(fā)生降解，各種功能性肽在加工過程中形成。在加工前期的腌制階段，低溫和高鹽的環(huán)境下肌肉內源酶的作用是導致蛋白質水解、活性肽形成的主要原因，特別是組織蛋白酶 B、D、H 和 L 和外肽酶(肽酶和氨肽酶)以及鈣激活蛋白酶[18]。在發(fā)酵及后熟階段，適宜的溫濕度能夠激活蛋白酶的活力，同時由于微生物可以通過直接代謝或者分泌胞外蛋白酶進而降解肌肉蛋白質產生多肽及其衍生產物，因而在這個階段火腿區(qū)系微生物與肌肉內源酶共同主導蛋白質的降解[27]。通過國內外學者對干腌火腿中蛋白質降解規(guī)律的研究，結合蛋白質組學技術，發(fā)現火腿加工過程中肌原纖維蛋白是發(fā)生降解的主要蛋白[28-30]。

2.1 加工工藝對肽的形成影響研究

不同干腌火腿原料的選擇不同，如金華火腿選用金華“兩頭烏”的鮮豬后腿，宣威火腿選用宣威烏金豬，伊比利亞火腿選用伊比利亞豬，巴馬火腿選用大白豬、長白豬和杜洛克豬等。火腿加工條件如環(huán)境溫濕度和處理時間在不同產品中要求不同，主要在腌制和成熟這2個階段存在較大區(qū)別，馬曉鐘等[31]研究比較了中國傳統(tǒng)火腿金華火腿和意大利帕爾馬火腿的工藝差異，其中金華火腿腌制過程中環(huán)境溫度為0～15 ℃，發(fā)酵環(huán)境溫度為15～38 ℃，環(huán)境相對濕度為40%～70%，而帕爾馬火腿腌制過程環(huán)境溫度控制在0～4 ℃，發(fā)酵環(huán)境溫度控制在15～25 ℃，且環(huán)境相對濕度更高。腌制階段的上鹽量也有較大差異，例如金華火腿總用鹽量為腿胚重的6.5%～8.0%，分5～7次上鹽，宣威火腿總用鹽量為7%左右，分3～4次上鹽等。不同加工工藝導致干腌火腿中蛋白質降解程度存在較大差異，進而影響各類肽的功能特性以及含量。HANSEN-M?LLER等[32]研究發(fā)現意大利帕爾馬火腿在不同加工時期肽的種類不同，且肽的形成與火腿風味的形成高度相關。小分子肽尤其是寡肽在干腌火腿的滋味形成中具有重要作用，目前分離得到的眾多呈味肽大多數為寡肽，而寡肽的形成對火腿加工工藝要求較高且通常在加工后期才開始大量積累?；趯Τ饰峨牡男纬蛇^程的認識，目前許多學者通過改進加工工藝來實現小分子肽的富集，進而增強產品的滋味實現風味調控。

干腌火腿加工過程中環(huán)境溫度變化范圍很大，溫度的改變往往影響火腿中內源酶活性，進而影響肽的形成。SFORZA等[37]在對帕爾瑪火腿的研究中比較了后熟過程中不同溫度(26 ℃ 和18 ℃)對寡肽含量的變化影響，在18 ℃ 下后熟的火腿中寡肽含量(分子質量約319 Da)更高，且與26 ℃ 下后熟的火腿相比差異顯著，其原因可能是較高溫度下內源酶活力較高，寡肽被持續(xù)降解。MARTN等[38]研究伊比利亞火腿加工過程中肽的變化，發(fā)現在腌制結束后的風干期(晾曬階段)和發(fā)酵期內小分子肽大量形成，其原因可能是伊比利亞火腿干燥過程中環(huán)境溫度會刺激肌肉來源和微生物來源的蛋白酶，促進蛋白質水解。有關研究表明溫度對于內源酶尤其是組織蛋白酶活力影響很大，一般35～40 ℃ 左右酶活力最高，而這一溫度很接近在干腌火腿中發(fā)酵環(huán)節(jié)的溫度[39]。

腌制是干腌火腿加工的重要環(huán)節(jié)，食鹽可以影響微生物的生長和繁殖，同時調節(jié)肌肉中內源酶的活力，影響蛋白質降解。在干腌火腿加工過程中，由于前期NaCl的滲透作用和后期肌肉水分的流失，鹽含量在不同的加工階段均呈現上升趨勢，目前國內外干腌火腿產品的含鹽量一般為10% 左右。含鹽量過高導致火腿水分流失量加大，進一步抑制內源酶活力，微生物的代謝也處于被抑制狀態(tài)，而含鹽量過低則會導致蛋白質過度水解甚至腐敗變質。馬志方[40]研究低鈉鹽對金華火腿蛋白質降解的影響，分別按照8%的上鹽量制作干腌火腿，結果表明在加工結束后，低鈉鹽(50%NaCl) 腌制火腿的蛋白質降解指數高于食鹽組，而且肌肽含量也顯著高于食鹽組，提取得到的抗氧化肽的總抗氧化能力也更強。

綜上所述，晾曬和發(fā)酵階段的溫濕度和時間的控制是決定火腿品質的重要因素，結合現代控溫控濕技術能夠通過激活相關酶活力或者潛在功能微生物的代謝來調控肽的生成，適當延長發(fā)酵時間則能夠實現肽的富集，其功能特性也會得到一定的增強。腌制階段通過影響加工后期火腿含鹽量進而調控蛋白質降解程度和肽的含量，結合替代鹽技術提高成品火腿中功能肽的含量將有助于進一步提升干腌火腿的品質。

2.2 加工過程中內源酶對肽的形成影響研究

干腌火腿中各類肽來源于肌肉蛋白質的降解，在組成肌肉的各類蛋白質中, 肌原纖維蛋白和肌漿蛋白降解程度最高，基質蛋白降解程度最低。蛋白質降解過程中有許多內源酶參與，目前研究較多而且在肽的形成中發(fā)揮重要作用的是肌肉中組織蛋白酶B、D、H和L和鈣激活蛋白酶。在整個加工過程中都能檢測到蛋白酶的活性，并且蛋白酶的活性與小肽的生成數量及火腿的感官特性高度相關，表明組織蛋白酶的酶促蛋白質降解作用在干腌火腿的特征性風味和質地形成過程中起著重要作用[41]。肌肉中不同的內源酶在不同加工階段活力不同，對蛋白質降解的作用也不同，在干腌火腿加工過程中，組織蛋白酶 B、H 和 L 于 15 個月后仍具有活性，而組織蛋白酶D在加工6～10個月后活性消失，鈣激活蛋白酶僅在腌制過程的第1階段參與肌肉蛋白質的水解，其穩(wěn)定性較低且在2周左右活性消失[42]。ZHOU等[43]研究表明金華火腿從腌制到后熟的加工過程中，組織蛋白酶 B 和 L 的活性顯著降低，最終仍保留10%左右的活性。

鈣激活蛋白酶是細胞內一組半胱氨酸類內肽酶，目前國內外研究中共確定了14種鈣激活蛋白酶，其中對于μ-鈣激活蛋白酶和m-鈣激活蛋白酶的研究成果較多，它們在肉的成熟過程中發(fā)揮重要作用。在宰后早期，μ-鈣激活蛋白酶和m-鈣激活蛋白酶從肌漿中的亞細胞器沿著 Z 線和 I 帶逐漸擴散進入肌原纖維中并開始降解該區(qū)域的肌原纖維蛋白[44]。MORA等[45]從西班牙索洛納火腿中得到來源于肌原纖維蛋白的 14 個多肽片段，預測在干腌火腿的加工初期，鈣激活蛋白酶可能起到非常重要的作用。BARON等[46]的體外試驗發(fā)現μ-鈣激活蛋白酶和m-鈣激活蛋白酶首先酶解肌間線蛋白形成多肽，隨后組織蛋白酶發(fā)揮作用，將大量多肽繼續(xù)降解小肽。

組織蛋白酶B、H和L屬于半胱氨酸蛋白酶，組織蛋白酶D是一種天冬氨酸酶，溶酶體破裂之后釋放組織蛋白酶。肌球蛋白和肌動蛋白是骨骼肌肌原纖維中最常見的2種蛋白而且是功能性肽的重要來源。組織蛋白酶 B對肌動蛋白有顯著降解作用，產生的大部分肽類是從蛋白質的N 端和C 端釋放出來的，而且大多數為水溶性多肽，這些多肽可能對干腌肉制品的風味具有重要影響[42]。當pH為5.5左右時，組織蛋白酶B和L降解肌原纖維蛋白，且它們能夠降解諸如肌聯(lián)蛋白、肌鈣蛋白、伴肌動蛋白、原肌球蛋白等在內的肌原纖維蛋白。相關組織蛋白酶H的研究表明它能夠降解肌鈣蛋白T[47]。組織蛋白酶D能廣泛降解肌原纖維蛋白，在pH值3.0時它能夠水解肌球蛋白重鏈、α-肌動素、原肌球蛋白及肌鈣蛋白的T亞基和I亞基；在pH值5.5和37 ℃下能夠降解幾種肌原纖維蛋白，其中降解最快的包括肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白、肌球蛋白的重鏈及M蛋白和C蛋白[48]。但組織蛋白酶D在加工過程中活性降低較快，主要在加工前中期發(fā)揮作用。

總而言之，肌肉中的內源酶種類較多，不同的pH條件下，對蛋白質的降解作用均存在較大的差異，在干腌火腿中隨著加工的不斷深入，環(huán)境溫濕度等環(huán)境條件的改變以及火腿內部理化性質的改變均能夠影響內源酶的活力，因而探究加工過程中肽的含量和相關特性的變化結合內源酶的活性升降進一步解釋酶與肽的關系，對于從工藝條件入手調控內源酶活力實現功能肽的富集是當前肉制品研究的重要方向。

2.3 加工過程中微生物對肽的形成影響研究

發(fā)酵和后熟是干腌肉制品成熟過程的關鍵工序，發(fā)酵工序的控制好壞直接關系到干腌火腿產品的成品率，后熟工序與火腿風味和品質密切相關?；鹜瘸墒爝^程主要受到兩方面因素影響，一方面是經過腌制和晾曬階段后的肌肉中含鹽量，不同的含鹽量對發(fā)酵影響較大，另一方面是發(fā)酵環(huán)境的溫濕度及控制，這是影響發(fā)酵成敗的關鍵因素，而這兩類因素主要通過對火腿區(qū)系微生物產生作用進而影響產品品質。在火腿微生物多樣性分析結果中表明細菌中的葡萄球菌屬和霉菌中的曲霉菌屬在火腿的發(fā)酵過程中作為優(yōu)勢菌發(fā)揮重要作用，另外具有蛋白質分解活性的芽孢桿菌屬也在火腿中被發(fā)現，可能與其他優(yōu)勢菌種一起對多肽的產生發(fā)揮作用[49-50]。干腌火腿中微生物多樣性豐富且在不同溫濕度環(huán)境下存在較大差異，其與火腿的理化性質存在一定的相關性，但微生物與肌肉內源酶、肌肉蛋白質的互作影響機理尚待深入研究，因此微生物對肽的形成影響是未來功能微生物挖掘研究的重要方向。

綜上所述，微生物對于干腌火腿風味尤其是揮發(fā)性風味物質的形成起著重要的作用，而且兩者的相關性已有較多文獻支撐，但是干腌火腿中微生物與呈味肽的關系、微生物與生物活性肽的關系有待進一步研究證實，除此之外，充分發(fā)揮微生物的作用、探索新工藝實現功能性肽的富集，將具有非常高的應用價值，在未來具有廣闊的市場。

3 結語

干腌火腿在加工過程中產生許多具有生理活性或為產品提供滋味的功能性肽，生理活性如抗氧化、降血壓、抗菌以及降血糖、抗炎癥等，對于生物活性肽的研究很多，目前集中在肽的功能特性研究、分離純化鑒定以及人工合成方向，為干腌火腿產品提供滋味的呈味肽包括鮮味肽、甜味肽、苦味肽、酸味肽、咸味肽及濃厚感肽這六大類，且多為寡肽，目前研究集中在該類肽的呈味機理和人工合成方向。

火腿中內源酶和外源微生物的共同作用促進了肌肉蛋白質的降解，研究表明肌原纖維蛋白是加工過程中降解程度最高的蛋白質，也是許多生物活性肽的重要來源?；鹜戎袃仍疵傅难芯砍晒^多，國內外學者通過蛋白酶的提取、活力測定和體外試驗等方法闡明了加工過程中組織蛋白酶B、D、H和L以及鈣激活蛋白酶的活性變化規(guī)律以及作用機理，但針對特定功能性肽的形成機理解釋有待更加深入研究?；鹜葏^(qū)系微生物的研究目前集中在微生物多樣性的分析以及通過基因來推測微生物功能與產品品質的關系，在發(fā)酵魚制品中微生物對產品滋味的作用得到了證實，然而對于微生物的作用機理尚不清楚，火腿中功能性肽與微生物的相關性尚未有文獻報道。

干腌火腿是深受國內外消費者喜愛的食品，但當今世界倡導低脂、低糖、降鹽的健康飲食，給這種高鹽的傳統(tǒng)干腌產品帶來了沖擊，低鈉鹽火腿正成為科研工作者面臨的新課題，通過改進加工工藝在保持火腿原有的風味與衛(wèi)生指標基礎上，研發(fā)低鈉鹽腌制技術。近三十年的國內外研究表明干腌火腿具有非常高的營養(yǎng)和潛在利用價值，因此在低鈉鹽火腿的研究基礎上實現功能性肽富集的工藝設計，具有廣闊的市場應用前景。同時，應在對干腌火腿功能性肽進行功能分類和結構鑒定的基礎之上，結合現代組學技術，深入探究內源酶活性規(guī)律，闡明干腌火腿在加工過程中功能性肽形成的內源酶機理并探索分析火腿區(qū)系微生物對功能性肽形成的貢獻度，為進一步開展特定功能微生物挖掘研究提供理論基礎。