醬油釀造中微生物群落演替及其空間異質(zhì)性研究

王阿利，王子謙，魏梓晴，于茜雅，張沛，黃桂東*

（1 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣東佛山528231 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100081 3 廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心 廣東佛山528231 4 廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心 廣東佛山528231 5 佛山市釀造工程技術(shù)研究中心 廣東佛山528231 6 佛山市農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心 廣東佛山 528231）

醬油是起源于中國的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，其獨(dú)特的鮮味備受人們的青睞，成為中國、日本、韓國等亞洲國家常用的調(diào)味品，并逐漸被西方國家所接受[1]。醬油的生產(chǎn)涉及霉菌、細(xì)菌、酵母等多種微生物的協(xié)同作用，混菌發(fā)酵體系中的微生物對醬油發(fā)酵進(jìn)程和風(fēng)味形成至關(guān)重要[1-2]。微生物作為醬油生產(chǎn)的核心，其群落多樣性一直是研究的熱點(diǎn)。自20 世紀(jì)初，日本學(xué)者從醬醪中分離培養(yǎng)乳酸菌以來[3]，研究者采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法[4]、磷脂脂肪酸分析法[5]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)（polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[6]、高通量測序技術(shù)[7]等多種方法對醬油微生物多樣性進(jìn)行研究[8]。目前，醬油生產(chǎn)過程中的優(yōu)勢微生物已比較明晰，優(yōu)勢細(xì)菌屬包括：魏斯氏菌屬（Weissella）[9-11]、葡萄球菌屬（Staphylococcus）[6，12]、庫特氏菌屬（Kurthia）[13]、芽孢桿菌屬（Bacillus）[4]、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）[7]等；優(yōu)勢真菌屬包括：曲霉屬（Aspergillus）[10]、假絲酵母屬（Candida）[9]、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）[10]等。然而，醬油品種繁多，風(fēng)味各異，這與其特有的醬油釀造微生態(tài)體系息息相關(guān)，發(fā)酵環(huán)境和條件的變化影響微生物群落結(jié)構(gòu)，且微生物群落豐度在醬油生產(chǎn)的不同階段也各不相同，進(jìn)而影響醬油的風(fēng)味[1]。科學(xué)認(rèn)識醬油生產(chǎn)中微生物群落的多樣性、演替規(guī)律，對調(diào)控菌群，提升醬油風(fēng)味和品質(zhì)具有重要意義。

醬油生產(chǎn)工藝主要分為3 個階段：制曲、醬醪發(fā)酵和淋油[1，14]。制曲是在大豆和小麥原料中添加米曲霉或醬油曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[3]。醬曲微生物多樣性研究顯示，細(xì)菌屬較豐富，主要包括魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、庫特氏菌屬等，真菌屬主要是添加的曲霉，同時含有低豐度的酵母[6，10，12-13]。醬醪發(fā)酵是在成熟的醬曲中加入鹽水進(jìn)行長時間發(fā)酵，時間一般為幾個月，最長可達(dá)4 年[1，4]。醬醪微生物多樣性研究顯示：大部分微生物來自于醬曲，而群落多樣性高于醬曲[13]。醬醪發(fā)酵時間長，根據(jù)微生物變化分為乳酸和乙醇發(fā)酵兩個階段，乳酸發(fā)酵階段的細(xì)菌以乳酸菌為主，真菌主要是曲霉；乙醇發(fā)酵階段細(xì)菌量減少，酵母成為優(yōu)勢真菌[10]。淋油是將發(fā)酵成熟的醬醅通過壓榨或浸提的方式獲得醬油原油[14]，該階段的微生物研究鮮見報道。

釀造醬油半開放式的發(fā)酵體系中，來源復(fù)雜且多樣的微生物以發(fā)酵原料為基質(zhì)進(jìn)行代謝，在添加鹽水的干預(yù)作用下進(jìn)行選擇性增殖，形成微生物群落演替并推動發(fā)酵的進(jìn)程[1，13]。醬曲和醬醪的微生物多樣性研究，豐富了人們對制曲和醬醪發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)、時間軸上演替規(guī)律的認(rèn)識。然而，在食品發(fā)酵過程中，不同空間位置的差異也會影響微生物的定殖、繁衍與代謝，且微生物群落空間異質(zhì)性對風(fēng)味形成起著重要作用[15-16]。目前醬油釀造中的微生物空間分布規(guī)律尚未明確。本研究跟蹤醬油主產(chǎn)區(qū)的廣東某醬油廠中同一批次樣品，利用高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析制曲、醬醪發(fā)酵和淋油階段的微生物群落變化，并解析醬醪發(fā)酵階段的上、中、下層的微生物群落組成，以期揭示醬油發(fā)酵主要階段的微生物演替規(guī)律和空間異質(zhì)性，為優(yōu)化醬油生產(chǎn)工藝，提升醬油品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油發(fā)酵樣品，采自廣東某醬油廠。定期跟蹤同一批次高鹽稀態(tài)醬油生產(chǎn)不同階段的樣品，樣品采集和處理參照Wang 等[13]方法。樣品分別為：制曲階段（S1），醬醪發(fā)酵時的乳酸發(fā)酵階段上、中、下層醬醪（S2、S3、S4），醬醪發(fā)酵時的乙醇發(fā)酵階段上、中、下層醬醪（S5、S6、S7），淋油階段（S8）。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher Scientific公司；QuantusTM熒光計(jì)，美國Promega 公司；BioTek ELx800 酶標(biāo)儀，美國Biotek 公司；DYY-6C 電泳儀，北京市六一儀器廠；GeneAmp9700 型PCR 擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；Illumina Miseq 測序儀，美國Illumina 公司；5424R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取 醬油發(fā)酵樣品總DNA用FastDNASpin Kit for Soil 試劑盒提取，按照試劑盒說明書操作流程進(jìn)行。用分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增及測序 以醬油發(fā)酵樣品總DNA 為模板，用引物 338F（5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細(xì)菌16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌ITS1 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸45 s），72 ℃穩(wěn)定延伸10 min。PCR 擴(kuò)增體系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L 上游引物0.8 μL，5 μmol/L 下游引物0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足ddH2O 至20 μL。PCR 產(chǎn)物的建庫與測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測序平臺為Illumina Miseq PE300。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 使用Fastp 等軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控和拼接。優(yōu)化的數(shù)據(jù)使用Uparse 軟件，在97%的相似度水平下進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析。用RDP classifier 對OUT 代表序列進(jìn)行物種分類注釋，細(xì)菌比對Silva 數(shù)據(jù)庫，真菌比對Unite 數(shù)據(jù)庫，置信度閾值設(shè)置為0.7?；诜诸悓W(xué)信息，在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。使用Qiime、Mothur、Mega 等軟件繪制樣品序列的菌群可視化分析圖。以上分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的生信云分析平臺完成（https：//cloud.majorbio.com/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析結(jié)果

2.1.1 微生物的Alpha 多樣性 采用MiSeq 高通量測序方法分析醬油生產(chǎn)中制曲、醬醪發(fā)酵（乳酸發(fā)酵上、中、下層，乙醇發(fā)酵上、中、下層）、淋油階段的微生物多樣性。通過細(xì)菌16S rRNA V3-V4和真菌ITS1 測序，分別優(yōu)化獲得280 352 和430 288 條有效序列，序列經(jīng)OTU 聚類與注釋，分別獲得271，27 個OTU。所有醬油發(fā)酵樣品的覆蓋率均大于0.99（表1），表明樣本文庫覆蓋率高，本次測序結(jié)果可真實(shí)反應(yīng)樣品中的細(xì)菌和真菌群落。

多樣性指數(shù)是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)，通過Alpha 多樣性指數(shù)分析，比較醬油生產(chǎn)樣品中物種的多樣性。OTU 數(shù)和Chao 指數(shù)反映群落中的物種數(shù)，數(shù)值越大微生物群落的豐富度越高；Shannon 指數(shù)反映群落中物種的豐富度和均勻度，數(shù)值越大微生物群落的多樣性越高[17]。由表1 可知，細(xì)菌的多樣性指數(shù)高于真菌，表明醬油生產(chǎn)中細(xì)菌的群落豐富度和均勻度高于真菌，與文獻(xiàn)[10]報道的成曲和醬醪中細(xì)菌比真菌更豐富的結(jié)果一致。表1 中細(xì)菌多樣性指數(shù)顯示，醬醪發(fā)酵和淋油階段的OTU 數(shù)、Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)高于制曲階段，且醬醪發(fā)酵上層的指數(shù)高于下層。真菌多樣性指數(shù)顯示，乙醇發(fā)酵和淋油階段的OTU 數(shù)、Chao 指數(shù)和Shannon 指數(shù)高于制曲，制曲階段指數(shù)高于乳酸發(fā)酵階段，且醬醪發(fā)酵下層的指數(shù)高于上層。細(xì)菌和真菌的Alpha 多樣性分析表明：時間軸上，制曲階段的細(xì)菌和真菌多樣性較低，醬醪發(fā)酵和淋油階段較高；空間上，醬醪發(fā)酵階段上、中、下層的細(xì)菌和真菌多樣性有差異，細(xì)菌多樣性上層較高，真菌多樣性下層較高。

表1 醬油發(fā)酵樣品中細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)表Table 1 Diversity indexes of bacteria and fungi in soy sauce

2.1.2 微生物的Beta 多樣性分析 采用Weighted UniFrac 距離算法衡量不同樣品間物種組成的相似性[18]，并通過非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA）對樣品進(jìn)行聚類分析，研究醬油生產(chǎn)各階段樣品間群落組成的相似性或差異性。細(xì)菌層級聚類圖1a 顯示，制曲階段樣品S1 自成一類，醬醪發(fā)酵和淋油階段由兩小類聚為一大支，其中醬醪發(fā)酵上層樣品（S2 和S5）聚為一類，醬醪發(fā)酵中、下層和淋油階段樣品（S3、S4、S6～S8）聚為一類。結(jié)果表明：時間軸上，制曲階段的細(xì)菌與其它階段有差異，而醬醪發(fā)酵與淋油階段的細(xì)菌相似；空間上，醬醪上層的細(xì)菌與中、下層有差異，而中層與下層相似性高。真菌層級聚類圖1b 顯示，所有樣品聚為兩大支，制曲、醬醪發(fā)酵上層和中層樣品（S1～S5）聚為一類，醬醪發(fā)酵下層與淋油階段樣品（S6～S8）聚為一類。結(jié)果表明：時間軸上，制曲與醬醪乳酸發(fā)酵階段的真菌相似，且醬醪酒精發(fā)酵與淋油階段的真菌相似；空間上，醬醪上層與中層的真菌相似性高，而上、中層與下層相似性低。細(xì)菌和真菌的Beta 多樣性分析表明，醬油生產(chǎn)微生物的物種進(jìn)化關(guān)系及豐度隨時間和空間而變化，其中Beta 多樣性隨時間變化與LIU 等[11]研究結(jié)果相似。

圖1 醬油發(fā)酵樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）層級聚類樹Fig.1 Hierarchical clustering tree of bacteria（a）and fungi（b）in soy sauce

2.2 群落分布與組成分析

2.2.1 微生物的群落分布 在屬分類水平下，從所有醬油發(fā)酵樣品中共檢測到147 個細(xì)菌屬和19 個真菌屬。采用韋恩圖統(tǒng)計(jì)醬油生產(chǎn)時間軸上制曲（K）、乳酸發(fā)酵（MA）、乙醇發(fā)酵（MB）、淋油（S）階段和空間上醬醪發(fā)酵上層（MU）、中層（MM）、下層（ML）樣品的獨(dú)有和共有微生物屬，比較醬油生產(chǎn)過程中微生物屬數(shù)目組成的相似性和重疊情況，結(jié)果如圖2 和圖3 所示。

細(xì)菌韋恩圖2a 顯示，醬油生產(chǎn)各階段共有細(xì)菌屬21 個，占細(xì)菌屬總數(shù)的14.29%；乳酸發(fā)酵、乙醇發(fā)酵與淋油階段共有細(xì)菌屬55 個；乳酸與乙醇發(fā)酵階段共有細(xì)菌屬17 個；4 個階段細(xì)菌特有菌屬分別為：制曲1 個、乳酸發(fā)酵19 個，乙醇發(fā)酵12 個，淋油6 個。時間軸上，醬油生產(chǎn)制曲階段，除1 個細(xì)菌屬外，其余細(xì)菌進(jìn)入后續(xù)發(fā)酵和淋油階段，與Wang 等[13]報道的醬醪中大部分細(xì)菌來源于醬曲的結(jié)果一致。同時，乳酸發(fā)酵、乙醇發(fā)酵和淋油階段中出現(xiàn)多種其它細(xì)菌屬參與發(fā)酵，且這3個階段的細(xì)菌群落具有一定的相似性。細(xì)菌韋恩圖2b 顯示，醬醪發(fā)酵上、中、下層共有細(xì)菌屬38個，占細(xì)菌屬總數(shù)的27.14%；上層與中層共有細(xì)菌屬22 個；3 個空間位置特有細(xì)菌屬分別為：上層60 個，中層6 個，下層3 個?？臻g上，醬醪發(fā)酵階段的上、中、下層細(xì)菌屬數(shù)目依次減小，上層與中層的細(xì)菌群落具有一定的相似性，上層特有細(xì)菌屬數(shù)目較多，表明醬醪原核微生物組成具有一定的空間異質(zhì)性。

圖2 醬油生產(chǎn)不同發(fā)酵階段（a）和不同位置（b）樣品中細(xì)菌屬水平韋恩圖Fig.2 Venn diagram of bacteria in soy sauce at genus level from different fermentation stages（a）and locations（b）

真菌韋恩圖3a 顯示，醬油生產(chǎn)中各階段共有真菌屬4 個，占真菌屬總數(shù)的21.05%；僅乙醇發(fā)酵和淋油階段存在特有真菌屬，分別為6 個和2個。表明時間軸上，醬油生產(chǎn)制曲階段中的全部真菌屬進(jìn)入后續(xù)階段，且乙醇發(fā)酵階段中出現(xiàn)多種其它真菌屬參與發(fā)酵。真菌韋恩圖3b 顯示，醬醪發(fā)酵上、中、下層共有真菌屬4 個，占細(xì)菌屬總數(shù)的23.53%；3 個空間位置特有真菌屬分別為：上層1 個，中層3 個，下層7 個。表明空間上，醬醪發(fā)酵階段的上、中、下層真菌屬數(shù)目依次增大，下層特有真菌屬數(shù)目較多。

圖3 醬油生產(chǎn)不同發(fā)酵階段（a）和不同位置（b）樣品中真菌屬水平韋恩圖Fig.3 Venn diagram of fungi in soy sauce at genus level from different fermentation stages（a）and locations（b）

2.2.2 微生物的群落組成 在屬分類水平下，統(tǒng)計(jì)各樣品的細(xì)菌和真菌組成及各物種相對豐度，將豐度低于1%的合并為一類（Others），結(jié)果如圖4 所示。將樣品中相對豐度≥5%的屬定義為優(yōu)勢屬。根據(jù)相對豐度劃分出各樣品的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌，結(jié)果見表2。

圖4a 細(xì)菌屬水平相對豐度顯示，在相對豐度≥1%閾值下，共得到10 個細(xì)菌屬，分別為：葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、庫特氏菌屬（Kurthia）、考克氏菌屬（Kocuria）、腸桿菌屬（Enterobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、魚果菌屬（Piscicoccus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）。除魚果菌屬外，其余菌屬在醬油微生物研究文獻(xiàn)[9-10，13]中均有報道。Piscicoccus中文屬名為魚果菌屬[19]，該屬僅有1 個種腸魚果菌（Piscicoccus intestinalis），分離自魚腸道[20]。本試驗(yàn)中魚果菌屬為發(fā)酵食品中首次報道，該菌屬僅在S2（醬醪發(fā)酵時乳酸發(fā)酵階段上層醬醪）樣品中豐度較高（1.2%），其余樣品的豐度小于1%，推測環(huán)境中的魚果菌屬在乳酸發(fā)酵時期從上層醬醪進(jìn)入醬油發(fā)酵體系。表2 優(yōu)勢細(xì)菌顯示，時間軸上細(xì)菌的相對豐度變化較大，魏斯氏菌屬為制曲階段絕對優(yōu)勢菌屬（相對豐度71.27%），進(jìn)入后續(xù)發(fā)酵階段而急劇下降（相對豐度15.96%）；葡萄球菌屬隨時間而逐漸升高，并成為醬醪發(fā)酵和淋油階段的絕對優(yōu)勢菌屬（相對豐度63.40%～83.36%）；四聯(lián)球菌屬僅在醬醪發(fā)酵和淋油階段大量存在（相對豐度8.20%～21.76%）。本試驗(yàn)中，制曲階段的絕對優(yōu)勢是魏斯氏菌，與胡傳旺[10]對醬曲高通量測序結(jié)果一致；醬醪發(fā)酵階段的絕對優(yōu)勢是葡萄球菌，與WANG 等[13]的醬醪優(yōu)勢細(xì)菌結(jié)果一致，而與胡傳旺[10]和LIU 等[11]報道的醬醪優(yōu)勢細(xì)菌為魏斯氏菌結(jié)果有差異，推測醬醪發(fā)酵階段的時間和環(huán)境差異會引起菌群豐度的變化[1]。空間上，乳酸發(fā)酵階段中，魏斯氏菌屬豐度上層高，葡萄球菌屬豐度中層高，四聯(lián)球菌屬豐度下層高；乙醇發(fā)酵階段中，魏斯氏菌屬豐度上層高，葡萄球菌屬豐度下層高，四聯(lián)球菌屬豐度中層高。表明優(yōu)勢細(xì)菌豐度在不同層間存在差異，推測這種差異性與不同層間營養(yǎng)和條件的差異有關(guān)[16]。

圖4b 真菌屬水平相對豐度和表2 優(yōu)勢真菌顯示，曲霉屬（Aspergillus）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）為醬油生產(chǎn)的主要真菌屬。時間軸上，乙醇發(fā)酵和淋油階段的真菌屬的相對豐度變化較大。曲霉屬為制曲和乳酸發(fā)酵階段的絕對優(yōu)勢菌屬（相對豐度>99%），并在醬油生產(chǎn)后期明顯下降（相對豐度最低為25.03%）；而接合酵母屬后期明顯上升（相對豐度36.83%～74.95%），并成為優(yōu)勢真菌之一。所得結(jié)果與文獻(xiàn)中醬油發(fā)酵真菌高通量測序結(jié)果一致[10]?？臻g上，乳酸發(fā)酵階段的真菌組成變化不大；乙醇發(fā)酵階段的曲霉屬相對豐度上層＞下層＞中層，接合酵母屬變化相反。

圖4 醬油發(fā)酵樣品中細(xì)菌（a）和真菌（b）屬水平群落組成Fig.4 Distribution of bacterial（a）and fungal（b）community in soy sauce at genus level during fermentation

表2 發(fā)酵過程中醬油樣品的優(yōu)勢細(xì)菌和真菌屬Table 2 Dominant bacterial and fungal genus in soy sauce samples during fermentation

2.3 功能預(yù)測結(jié)果

通過PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）軟件分別對16S rRNA 和ITS 測序結(jié)果進(jìn)行微生物群落功能預(yù)測，得到細(xì)菌COG 功能相對豐度（圖5）和真菌MetaCyc pathway 相對豐度（表3）。

細(xì)菌PICRUSt 功能預(yù)測圖5 顯示，忽略未知功能（F18）后，得到22 個功能基因家族，主要包括：能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化（F3，5.65%～6.46%），氨基酸運(yùn)輸和代謝（F5，9.97%～11.03%），碳水化合物運(yùn)輸和代謝（F7，6.69%～7.85%），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（F10，6.78%～8.54%），轉(zhuǎn)錄（F11，6.51%～6.90%），復(fù)制、重組和修復(fù)（F12，4.81%～5.95%），細(xì)胞壁/膜/被膜生物合成（F13，5.00%～5.35%），無機(jī)離子運(yùn)輸和代謝（F16，6.68%～7.45%）。這8 類主要功能基因家族占比之和在50%以上，其中，氨基酸運(yùn)輸和代謝相對豐度最高。醬油發(fā)酵各樣品氨基酸運(yùn)輸和代謝的相對豐度排序?yàn)镾5（乙醇發(fā)酵上層）＞S2（乳酸發(fā)酵上層）＞S7（乙醇發(fā)酵下層）＞S8（淋油）＞S6（乙醇發(fā)酵中層）＞S3（乳酸發(fā)酵中層）＞S4（乳酸發(fā)酵下層）＞S1（制曲）。細(xì)菌COG 功能預(yù)測結(jié)果表明：醬油發(fā)酵體系中的細(xì)菌功能主要集中在氨基酸代謝，時間軸上，醬醪發(fā)酵和淋油階段的細(xì)菌氨基酸代謝相對豐度高于制曲；空間上，醬醪上層的細(xì)菌氨基酸代謝相對豐度高于中、下層。氨基酸是醬油鮮味的主要來源，而醬油中的氨基酸由微生物代謝產(chǎn)生[3，21]。結(jié)合圖4a 中醬醪發(fā)酵和淋油階段的葡萄球菌豐度較高，表2 中上層魏斯氏菌豐度較高，表明葡萄球菌和魏斯氏菌對醬油氨基酸的形成具有重要作用。

圖5 醬油發(fā)酵樣品細(xì)菌功能預(yù)測的COG 相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial genus predicted COG functions in soy sauce

醬油釀造樣品真菌PICRUSt 功能預(yù)測的通路如表3 所示。其中，脂質(zhì)代謝相關(guān)的途徑有脂肪酸β 氧化、甲基酮生物合成、乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)；碳水化合物代謝相關(guān)的途徑有磷酸戊糖途徑、GDP 甘露糖生物合成和三羧酸循環(huán)。真菌Meta-Cyc pathway 功能預(yù)測結(jié)果表明：醬油發(fā)酵體系中的真菌功能主要集中在脂肪和碳水化合物代謝，這些相關(guān)的代謝通路，時間軸上，制曲和乳酸發(fā)酵階段豐度一致，乙醇發(fā)酵和淋油階段豐度主要呈下降趨勢；空間上，乳酸發(fā)酵階段上、中、下層的豐度一致，乙醇發(fā)酵階段中層的大部分通路豐度較低。醬油發(fā)酵體系中的真菌主要來源于制曲時添加的曲霉，曲霉具有淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等多種復(fù)合酶系，可將醬油原料分解為糖類、有機(jī)酸、氨基酸等成分[10，14]。結(jié)合圖4b 中制曲和乳酸發(fā)酵階段的曲霉豐度較高，表2 中乙醇發(fā)酵階段上層的曲霉豐度較高，表明曲霉對醬油原料中脂肪和碳水化合物的分解作用主要集中于制曲和乳酸發(fā)酵階段，曲霉在乙醇發(fā)酵階段的分解作用主要集中在上層。

表3 醬油發(fā)酵樣品真菌功能預(yù)測的MetaCyc pathway 豐度（前10）Table 3 Relative abundance of fungal genus predicted MetaCyc pathway in soy sauce（top 10）

3 討論與結(jié)論

采用高通量測序，分析醬油釀造過程主要階段（制曲、醬醪發(fā)酵和淋油）的微生物群落演替和醬醪菌群空間分布規(guī)律。研究顯示，醬油釀造中微生物的多樣性、群落分布與組成、預(yù)測功能呈現(xiàn)明顯的階段特征和空間異質(zhì)性。

醬油釀造依次經(jīng)歷制曲、醬醪發(fā)酵和淋油階段，其中微生物群落結(jié)構(gòu)隨發(fā)酵進(jìn)程而不斷變化[1]。制曲階段的微生物多樣性較低，群落組成與其它階段有差異，這主要是由于原料經(jīng)制曲后加入高鹽并轉(zhuǎn)入發(fā)酵池而引起條件和環(huán)境的改變，進(jìn)而改變了微生物群落結(jié)構(gòu)[1，13]。制曲階段的核心細(xì)菌為魏斯氏菌和葡萄球菌，核心真菌為曲霉，與胡傳旺[10]醬曲高通量測序結(jié)果、TANAKA 等[22]醬曲PCR-DGGE 結(jié)果、YAN 等[12]醬曲微生物培養(yǎng)法結(jié)果一致。醬醪發(fā)酵階段的微生物多樣性高于制曲，推測醬醪發(fā)酵周期長，半開放式的發(fā)酵池更有利于醬醪微生物與環(huán)境微生物之間的交互作用[1，4]，形成更豐富的微生物群落。醬醪發(fā)酵階段的核心細(xì)菌為魏斯氏菌、葡萄球菌和四聯(lián)球菌。醬醪核心細(xì)菌種類與文獻(xiàn)[5]，[7]，[10] 類似，然而，多篇文獻(xiàn)顯示醬醪魏斯氏菌豐度最高[9-11]。本試驗(yàn)葡萄球菌豐度最高，可能與不同工廠的發(fā)酵環(huán)境差異有關(guān)[1]。葡萄球菌在醬油發(fā)酵過程中可降低生物胺[23]，減少褐變[24]，作為發(fā)酵肉制品中的常見微生物，能分解脂肪和蛋白質(zhì)，提供風(fēng)味前體物質(zhì)[25]。本試驗(yàn)醬醪中高豐度的葡萄球菌是否影響醬油生物胺、顏色和風(fēng)味的形成，后續(xù)將分離葡萄球菌并進(jìn)行功能驗(yàn)證。醬醪發(fā)酵階段的核心真菌為曲霉和接合酵母，與之前多篇文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[6，10，22]。淋油階段的微生物多樣性、群落組成、核心微生物與醬醪發(fā)酵階段相似，可能與本試驗(yàn)醬油釀造采用浸提淋油方式有關(guān)。綜上，魏斯氏菌和葡萄球菌是醬油釀造過程中的優(yōu)勢細(xì)菌，曲霉和接合酵母是醬油釀造過程中的優(yōu)勢真菌。

中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵體系在營養(yǎng)、環(huán)境、生態(tài)位等方面存在空間差異性，且微生物空間異質(zhì)性在醋和酒的發(fā)酵中已被證實(shí)[15-16]。醬油釀造過程的醬醪發(fā)酵階段主要在大型發(fā)酵池或發(fā)酵罐中完成，容器中混合鹽水的醬曲在重力作用、溶氧量、溫度等因素的影響下，發(fā)酵體系不均一[1，16]，體系中微生物的空間分布規(guī)律仍未明確。本試驗(yàn)從醬醪發(fā)酵階段發(fā)酵池的上、中、下位置取樣，分析不同空間位置的醬醪微生物變化。上層發(fā)酵樣品與空氣接觸，有利于與外界環(huán)境中的物質(zhì)和微生物進(jìn)行交換[16]。本試驗(yàn)醬醪上層的細(xì)菌多樣性和特有菌屬數(shù)目較高，表明醬油發(fā)酵體系中的細(xì)菌更容易與環(huán)境微生物進(jìn)行交互作用。中層發(fā)酵環(huán)境營養(yǎng)物質(zhì)豐富、發(fā)酵條件適宜，適合微生物的生長[26]。本試驗(yàn)醬醪中層的葡萄球菌屬和接合酵母屬的豐度較高，表明醬油發(fā)酵體系中層環(huán)境更適合優(yōu)勢菌生長。下層為固、液兩相發(fā)酵，高鹽、高酸環(huán)境適合具有耐鹽、耐酸的微生物生長[26]。本試驗(yàn)醬醪下層的真菌多樣性較高，且這些特有真菌多為酵母，表明醬油發(fā)酵體系中的酵母具有較強(qiáng)的耐鹽、耐酸特性。綜上，醬醪上層細(xì)菌多樣性較高，醬醪下層真菌多樣性較高。

本研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)對醬油釀造中的微生物群落進(jìn)行解析，闡明發(fā)酵時間和空間差異對微生物群落的影響，為醬油釀造過程中微生物質(zhì)量控制、菌群調(diào)控、發(fā)酵工藝優(yōu)化等提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。