金鳳梅， 王麗萍

(1.河北省承德市中心血站， 河北 承德 0670002.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

胎盤植入原名病態(tài)粘附胎盤，是指胎盤絨毛不同程度的侵入子宮肌層，引起產(chǎn)時、產(chǎn)后出血，圍生期緊急子宮切除和繼發(fā)感染、損傷等嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至母嬰雙亡[1]。造成胎盤植入的原因與多方面的因素有關(guān)，普遍認(rèn)為與母體子宮內(nèi)膜的損傷情況、胎盤附著部位、子宮手術(shù)史、子宮病變等有關(guān)[2,3]。胎盤植入的發(fā)生率逐年升高，由胎盤植入引起的產(chǎn)婦病死率已達(dá)到7～10%[4]。胎盤植入沒有典型的臨床癥狀，臨床診斷主要依據(jù)高危因素結(jié)合超聲或者磁共振檢查，確診需要根據(jù)手術(shù)中或者分娩時所見及分娩后的病理學(xué)檢查。隨著胎盤絨毛侵入的加深，臨床超聲、磁共振檢測的準(zhǔn)確性將會降低。因此，早期預(yù)測胎盤植入發(fā)生及其是否存在并發(fā)感染的可能對臨床上早期預(yù)防、治療胎盤植入并發(fā)感染具有重要意義。大量研究報(bào)道，前置胎盤和胎盤植入的診斷均可通過血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothlialgrowth factor,VEGF)、胎盤微血管密度(Microvesseldensity，MVD)在母體中的含量進(jìn)行預(yù)測[5]。于是推測VEGF、MVD的表達(dá)水平可能與胎盤植入并發(fā)感染的可能性也存在聯(lián)系。本研究擬通過檢測分析535例胎盤植入患者的胎盤組織、血清中VEGF、MVD的表達(dá)水平與胎盤植入并發(fā)感染的關(guān)系，揭示VEGF、MVD在胎盤植入并發(fā)感染的中的價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料

1.1.1樣本來源：樣本來自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年9月至2021年2月期間接診的胎盤植入患者535例(其中終止妊娠后，發(fā)生感染者215例，剩余320例為未發(fā)生感染者)孕產(chǎn)婦的胎盤組織和靜脈血。從醫(yī)院病案科收集患者終止妊娠時孕周、病史、年齡、剖宮產(chǎn)次數(shù)、人工流產(chǎn)次數(shù)等臨床資料。病歷資料來自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病案科。納入研究的所有住院分娩孕婦均需在住院后3d內(nèi)采血1.8mL至混有0.2mL的枸杞酸鈉真空采血管。胎盤組織的獲取均在剖宮產(chǎn)產(chǎn)出胎盤后快速剪取植入病灶區(qū)組織或正常胎盤中央組織2塊，每塊大小為1cm×1cm×1cm的立方塊。一塊組織用0.9%生理鹽水沖洗后-80℃保存，另一塊用10%甲醛溶液封閉保存。胎盤植入并發(fā)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：發(fā)熱，體溫>37.8℃，且具備以下≥2個條件，除外其他因素，可診斷：①子宮緊張有壓痛；②實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)；③末梢血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>15×109L-1。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均診斷為胎盤植入；臨床資料完整；患者對本研究知情同意；排除標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)前患有高血壓、糖尿病、肝腎功能障礙、腫瘤、感染、多器官衰竭等疾病的患者；非單胎妊娠患者；因胎盤植入導(dǎo)致子宮切除者、手術(shù)死亡者。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料:TRIzol液(Invitrogen)購自北京索萊寶公司；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒購自TaKaRa公司；人VEGF 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent test，ELISA)檢測試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰荆痪燮蚁┠?polyvinylidene fluoride，PVDF)購自北京康為世紀(jì)公司；兔抗血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothlial growth factor,VEGF)多克隆抗體、兔抗CD34單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自上海艾博抗公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素購自北京博爾西科技公司；二氨基聯(lián)苯胺(3，3'-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購自北京鼎國昌盛生物公司。

1.2方 法

1.2.1樣本處理:將收集的胎盤組織、血清分為胎盤植入并發(fā)感染組、未感染組。將收集的全部胎盤組織從-80℃取出，備用。打開10%甲醛溶液中保存的胎盤組織，用于制備石蠟切片。將采取的全部血液抽取上層血清，用于ELISA實(shí)驗(yàn)。

1.2.2RT-qPCR實(shí)驗(yàn):將胎盤組織從-80℃取出，無菌研磨。加入3倍組織體積的無菌蒸餾水，充分研磨，然后用TRIzol液提取組織中的總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再采用SYBR-Green熒光定量PCR檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技有限公司)檢測VEGF mRNA表達(dá)。qRT-PCR檢測程序(反應(yīng)體系：1×SYBR GreenⅠ混合物10μL、0.2μmoL/L PCR上下游引物各0.5μL、重蒸水0.8μL、RT產(chǎn)物2μL、；反應(yīng)條件：95℃變性(5min)，94℃(30s)，60℃(30s)，72℃(40s)，共40個循環(huán))。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算VEGF的相對表達(dá)量。反應(yīng)程序設(shè)置程序按照RT-qPCR試劑盒要求設(shè)置：95℃，10min，40個循環(huán)，60℃，60s。VEGF，上游引物，5'-TGCGGATCAAACCTCACCAA-3'，下游引物5'-ACAGTGAACGCTCCAGGATT-3'。GAPDH，上游引物，5'-AAGAGGGATGCTGCCCTTAC-3'，下游引物5'-TACGGCCAAATCCGTTCACA-3'。

1.2.3WB實(shí)驗(yàn):將組織從-80℃冰箱中取出，充分研磨。加入5倍體積的裂解液，充分裂解，提取總蛋白。用BCA試劑盒對蛋白定量，沸水中煮沸10min對蛋白變性。用變性后的蛋白上清液用于SDS-PAGE蛋白電泳，將蛋白聚集在瓊脂膠上。使用轉(zhuǎn)膜儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜過程需在4℃低溫條件下進(jìn)行。再用2.5%的脫脂奶粉對膜進(jìn)行37℃封閉2h。結(jié)束后，將膜輕輕置入1∶1000倍稀釋的兔抗VEGF多克隆抗體溶液中，4℃孵育一夜。取出膜，充分清洗，再浸入1∶500倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，37℃反應(yīng)1.5h。最后用ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光。

1.2.4ELISA實(shí)驗(yàn):將VEGF ELISA檢測試劑盒、待檢測血清恢復(fù)至室溫。按照VEGF ELISA檢測試劑盒說明書要求操作，判定血清中VEGF的含量。

1.2.5免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn):參考喬小改等[7]的操作方法，檢測組織中VEGF、微血管密度(Placental microvesseldensity，MVD)的表達(dá)。免疫組織化學(xué)：將組織標(biāo)本修剪成1cm3組織塊，經(jīng)石蠟包埋，切成4μm厚的切片，再展片、烤片、復(fù)水、修復(fù)、復(fù)溫。然后使用山羊血清封閉處理，然后加入稀釋的一抗溶液(VEGF，1∶200；CD34，1∶100)，4℃孵育過夜。恢復(fù)至室溫后，充分洗滌，再置于稀釋的拉更過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。結(jié)束后，經(jīng)DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明、封膠處理。VEGF、CD34判定陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。結(jié)果由病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立判定。結(jié)果以陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為判定標(biāo)準(zhǔn)：5%及以下為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。細(xì)胞染色深度積分法則：無著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。結(jié)果：將上述兩項(xiàng)的得分的乘積作為總分。總分在0～2分判為陰性，3～12分判為陽性。MVD值的計(jì)算采用Weidner法，用CD34標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞，棕黃色以上均為陽性。顯微鏡計(jì)數(shù)時，采用5點(diǎn)法觀察、計(jì)數(shù)，視野內(nèi)有染成棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)為1個，取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)均使用軟件SPSS22.0分析。對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。定性資料以n(%)表示，行χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的變量采用Pearson相關(guān)分析法分析變量間的相關(guān)性。P<0.05表示差異或相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者的臨床資料比較:535例胎盤植入患者中，并發(fā)感染215例，占40.18%，年齡26～45歲，平均(34.87±4.91)歲；終止妊娠時孕周28～39周，平均(33.91±2.45)周。未并發(fā)感染320例，年齡26～43歲，平均(32.03±4.12)歲，終止妊娠時孕周28～39周，平均(33.83±2.43)周。胎盤植入并發(fā)感染組35歲以上所占比例、剖宮產(chǎn)次數(shù)≥1患者所占比例和人工流產(chǎn)次數(shù)≥2患者所占比例均高于胎盤植入無并發(fā)感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者的資料分析n(%)

2.2VEGF在兩組胎盤植入患者胎盤組織中的表達(dá)及血清含量:結(jié)果如圖1A和表2所示，與胎盤植入無并發(fā)感染組相比，胎盤植入并發(fā)感染組胎盤組織中VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，血清中VEGF含量顯著升高(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖1B、C所示，與未感染組相比，感染組胎盤組織呈明顯的褐色(P<0.05)。

表2 VEGF在兩組胎盤植入患者胎盤組織中的表達(dá)及血清含量

圖1 VEGF蛋白表達(dá)及免疫組織化學(xué)圖A：VEGF蛋白在胎盤組織中的表達(dá)；B、C：VEGF在感染組和未感染組胎盤組織中的免疫組織化學(xué)圖

2.3MVD在胎盤植入并發(fā)感染患者胎盤組織中的表達(dá):結(jié)果表3所示，與胎盤植入無并發(fā)感染組相比，胎盤植入并發(fā)感染組胎盤組織MVD值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 MVD在胎盤中的表達(dá)

2.4感染胎盤組織VEGF水平與MVD的相關(guān)性:Pearson相關(guān)分析，胎盤組織VEGF含量與MVD值呈正相關(guān)(r=0.645，P<0.001)。

3 討 論

胎盤植入并發(fā)感染的發(fā)生不僅與護(hù)理因素相關(guān)，還可能與患者體內(nèi)一些基因表達(dá)失調(diào)有關(guān)[8]。VEGF參與了胚胎血管生成的多種生理病理過程，VEGF可促進(jìn)胚胎發(fā)育，提高子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)發(fā)育中的胚胎與子宮內(nèi)膜的相互作用，參與胚胎著床過程[9]。VEGF在胚胎著床中具有多種的作用，VEGF表達(dá)的失調(diào)，可能導(dǎo)致不孕、胎盤植入并發(fā)癥[10]。柳月霞等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，VEGF在胎盤植入患者血清中的表達(dá)水平明顯高于疑似胎盤植入患者或正常孕婦，揭示VEGF在早期胎盤植入診斷的潛在價值。本研究檢測了胎盤植入并發(fā)感染孕婦、胎盤植入未感染孕婦胎盤、血清中VEGF的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF在胎盤組織的表達(dá)水平和血清中的含量均明顯高于胎盤植入未感染孕婦。這與VEGF在胎盤植入孕婦胎盤中的表達(dá)高于前置胎盤孕婦胎盤的研究結(jié)果相類似。推測VEGF不僅具有預(yù)測胎盤植入發(fā)生的可能性，還有預(yù)測胎盤植入伴感染的潛力。

MVD的表達(dá)水平與婦科疾病、顱神經(jīng)根疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)。喬小改等[7]在研究中報(bào)道，MVD在兇險性胎盤前置合并胎盤植入孕婦胎盤中的表達(dá)高于未合并胎盤植入孕婦，并且MVD、VEGF在兇險性胎盤前置組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)。研究報(bào)道，MVD在前置胎盤、胎盤植入孕婦胎盤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，并且MVD、VEGF在前置胎盤、胎盤植入孕婦胎盤組織中的表達(dá)成正相關(guān)，證實(shí)MVD、VEGF在胎盤中的表達(dá)異常與胎盤植入的發(fā)病存在聯(lián)系。由此可見，MVD、VEGF在胎盤前置、胎盤植入孕婦胎盤中的異常表達(dá)確實(shí)參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。本研究檢測了MVD在胎盤植入并發(fā)感染孕婦、胎盤植入未并發(fā)感染孕婦胎盤組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MVD在胎盤植入并發(fā)感染胎盤中的表達(dá)明顯升高。結(jié)合前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，暗示孕婦胎盤組織中MVD表達(dá)水平可能與該病的兇險程度有關(guān)，即MVD越高，胎盤絨毛入侵子宮越嚴(yán)重。此研究還發(fā)現(xiàn)，胎盤植入并發(fā)感染胎盤組織中MVD、VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，這與二者在胎盤前置、胎盤植入孕婦胎盤中的表達(dá)關(guān)系相一致。由這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果猜測，VEGF、MVD在胎盤植入胎盤中的表達(dá)量可能能夠初步推測孕婦發(fā)生胎盤植入并發(fā)感染的可能性。本研究是在支持VEGF、MVD可用于預(yù)測前置胎盤、胎盤植入發(fā)生的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證VEGF、MVD與胎盤植入并發(fā)感染發(fā)生相關(guān)密切。